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明治鉱灸医学第 II 号 誠刺激がマウス末梢血リンパ球サブセットに及ぼす影響. 明治娘灸大学東洋医学教室 明治銭灸大学麻酔科学教室 明治錨灸大学免疫 微生物学教室渡辺勝之 水沼国男 篠原昭二単林田一志刊行待寿紀日塚本紀之... 近藤裕..* 酒井ゅうこ... 雨貝 孝日本 要旨 我々は

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(1)

明治鉱灸医学第 II号 61-69 (1992) 

誠刺激がマウス末梢血リンパ球サブセットに及ぼす影響

.明治娘灸大学 東洋医学教室 ・・明治銭灸大学 麻酔科学教室

・・・明治錨灸大学 免疫・微生物学教室

渡辺勝之・ 水沼国男・ 篠原昭二単 林田 一志刊 行待寿紀日 塚本紀之... 近藤裕..* 酒井ゅうこ...

雨貝 孝日本

要旨 我々は東洋医学で重視する自然治癒力とその要因由一つである免疫系と白関連に注目し研究を 進めている 今因。拘束したマウスに減,灸,録通電刺激を行い,拘東刺激のみ白コント ルと比較 してマウス末梢血リンパ球サプポピュレ ν ョンにど D ょっな影響を及ぼすかを,蛍光ラベルモノクロー ナル抗体を用いたフローサイトメトリー法により検討した 拘束刺激のみの 30分後ではへ JレバーT富田明包 αβ陽性T細胞の比率が有意に上昇し,日細胞は逆に有意な低下を示した 誠併において 30分後単球杭 また加分及び印分後にはヘルパー T細胞, αβ 隙性T細胞の比率が有志に上鼻 L, 日細胞は加分, 60分 後で有意な低下を示した

Effect of Acupuncture on Subpopulations of Murine  Peripheral 

B 1

00d Lymphocytes 

WATANABE  Katsuyuki¥MIZUNUMA Kunio¥ SHINOHARA Shoji¥ 

H A  Y ASHIDA 

I t

sushi'¥YUKIMACHI Toshinori'¥ 

TSUKAMATO Noriyuki" '

,

KONDO Yuichi" '

,

SAKAI Yuko'"  and AMAGAI Takashi'" 

DepartmenL 

0 1  

Orientαl Medicine, Meiji College 

0 1  

Oriental Medicine 

.ODepαrtment o[ Anesthesiology, Meiji College 

0 /  

Medicine 

...Ðepαrlmenl

0 1  

lmmunology and A1icrobiology, Meiji College 

0 1  

Medicine 

Summary: A major aim of the treartment with oriental medicine is to increase the self‑defense  mechanisms, for nalural  restoralion of balance, depending on the lraditional diagnosis of  individual spe口 ficity. The immune s)'s同 m is a central  mechanism for se1f‑defense against  foreign  substances.  ¥Ve have been investigating modulation  of immune r田 ponses by  the  treatmenl with techniques of oriental medi 口 ne , acupuncture and moxibustion. Jn this study, we investigated  the effect  of acupuncture, electro-acupuncture, moxibustion and  restraint  stress on subpopulations of murine peripheral  blood  lymphocyte  fraclion.  using f1uorescent  flowcytomelry. Thc results indi回 le lhat  the percentages ofαβpositive helper T cells ホncreュ ased 30 min after restraint stress lreatment a\one, and  by acupuncture  treatment the per・

centages of monocytes were increased 30 min aftcr Lreatmenl, while lhe percenLages of αB

positive helpcr T cells were also increased 30  and 印 min after treatment. On lhe other hand, B cell  popu¥ation was decreased 30.60 min after treatment 

Key Words  鎖 acupuncture. moxibustion, 似通電 e 1 ec tro‑acu punct ure 

リンバ球サプポピュレーション lymphocyte subpopu¥ations 

蛍光フロ サイ トメト リー fluorescent f1owcytometry 

61 

(2)

62  録刺激がマウス末梢血リ ンパ球サプセ y トに及ぼすf,~響

I 緒面

鍛灸治療の主な的は、、自然治癒力を高める M 司王が重要とされている 1 , 2, 3)

その主要な因子の一つである免疫反応との関連 も注目されている.鎖灸治療による免疫系の地強 効果の報告 4 ,5) や, 実験的な研究では鍛灸刺激に より, リンパ球増殖反応",抗体産生の応答7), NK 活性 8) の地強も報告されている

しかし,東洋医学は本来,人と自然環境との関 わりや個体の特異性を重視し全人的におこなわ れるものとされている.鍛灸の効果においても,

同様な刺激を行なったとしても.個体により反応 様式が異なる事が多く見受けられる そのため,

銭灸の免疫系調節に|耳|するヒトでの臨床的研究に おいては,個体の特異性をどのように評価し分離 するかの方法論をまず確立しはければならない

以上のことから実験的研究を行うに際して,ま ず最初に均一な条件設定での評価が必要不可欠で あり基礎にもなると考え.環境条件,個体条件を なるべく均一にするため, Sp凹】 fic pathogen 

f r c c  

(SPF) にて飼育している純系マウスを対象とし て実験をおこなった,

これまでに,様々なス ト レスによりリンパ球サ ブポピュレーションが変化することが多数報告さ れている.またヒトでの鍛灸治療による変化も少 数ではあるが報告されているト1 1)そこで,拘束 ストレス及び鍛灸臨床でよく用いられる, 録,灸,

鍛通m刺激による末梢J!n リンパ球サプポピュレー ションの変化を検討した.

を対象とした

)リンパ琢サブセ

刺激前,刺激終了後30分, 60分の計 3 回目良時静 脈叢より約 300μ1 :係血を行なった採血は 9:00 

‑13: 

00 時の間とした. lfn 液をヘパリン (IOOOu /ml) 加 PBS 2 ml で希釈したのち, Fico Jlを 用いた比重遠心法にて分離し, リンパ疎単球分画 を採取した.それらを 10%牛胎児血ii';

(FCS)  1 1 0   E a g l e  

~1inimum essential 

medium 

(1',1 E'vt)で 洗浄(1 500回転 5 分)後, 各々 400μ l に調整 し, 4 つに分け 100μl ずつ染色用チューブに分 注した.

)抗体及び染色方法

使用した抗体は.以下に示す 6 種類を用いた Anti-~10use L

3T4 R‑P

h

y c o e r y t h r i n   (PE) (San 

Jose, CA. Becton Dickinson), Anti-1',1ouse Lyt  2 Fluorescein i

s o t h i o c y a n a t e  (F

lT

C ) ( S a n  Jose

, CA. B

e c t o n  

Dickinson),

P8 

Anti・Mouse

a l p h a   b a t a  TCR 

(San Die喧0 , CA. 

Phar 

Mingen),

F l   TC Anti‑Mouse ga

mma 

d e

l

t a  TCR  ( S a n  

Diego,

CA. 

Phar Mingen)

,

FlTC 

Anti-~10useμ 鎖抗 体 (West Chester,

PA. 

Cappel)ヤギ・ 77 イン ティー精製抗体, Anti-1',1ac-1 抗体 Rat-Mouse ハイプリドーマ 1',11/70. 15. 

1 1 . 5  

(ATCC TIB 

128) の培養上清 (表 1

染色は.以下に示すごとく行なった

a) P 

E 標識 Anti-mouse L3T4 を4 μI /tube と FITC 標識 Anti-mouse

Lyt 

2 を 4μ1 /

H  対象及び方法

)対象動物

表 1 標識抗体、染色方法およびサプポピュレーション分類

室温 24:!:: 1 'C, 湿度 55:!::10% ,照 明 12 時間の一定環 境下でクリンラッ ク内の SPF 条件 にて飼育した,

-9 週令の純系 C57BL/6 マウス

抗体

An

ti

Y1

o u s e  L3T4 

Anti

::V

l o

u

s e  

Lyt 2 

A n t i ‑ M o u s e  

a ゚ TCR 

AnlトMouse

 TGR 

Anti-Mouseμ 姐

Anti‑Mac‑l 

標識

PE  rlT

PE 

F

ITC 

F

/T

C  F I

TC 

染色方法

直接法 Helpcl

' / I n d u c e r  T  c e l l s  

直接法

S

u

p p

r

e s s o r / c y t o

t

o xc  

l' 

c e

lls 

直接法 αβ 随性 T

c e l l s  

直接法 γ6 陽性 T

c e

ll

直接法 IgM(μ)陽性 B 細胞

間接法

Mo 

nocy tes, )ニ

a c r o p  

hages,

ran u I 

o c y  

t

e s  

(3)

明治誠灸医学第 11 号 6]-69 (J叩2) 63 

tube 用いて直接法で 2 カラー染色

七) P E 標識 Anti-mouse αβT田 11 レセプター を 10倍希釈し,lO μ1 / tube と F I TC 標識

Anti-mouseγ 占 Tcell レセプターを 10倍希釈 し 10μl/tube を直接法で 2 カラー染色

c) FITC 標識 Goat Anti‑mouse  JgM (μ)

を 20倍希釈し 10μJ /tubeを直接法で 1 カラー 染色

d) M!/70(Anti-Macl) を 50μI/tube に F ITC 懐識 Anti-Rat Jd且抗体を 40倍希釈し,

間接法で 1 :カラー染色

それらを 4 "C で3的予間反応させた後, 1 % F  CS  1Jl1M E M で 1000rpm , 5 分, 2 回洗浄した 染色

した細胞のリンパ球の股マーカー陽性細胞率(%) を Becton Dickinson 社製, Laser Flowcytometュ ry, FACScan を用いて解析した.測定では,前 方散乱及び測方散乱を用い, リンパ球分布領壕に

Live gate をかけ, Gated events を 500 に設定 した.統計処理は, Student's  paired t-t田t を用

いた.

鍛,灸及び鍛通電刺激

マウスをストレスを少なく拘束するため,エチ ルエーテ Jレで麻酔し,iJlj気孔を空けたポリカーボ ネート 50ml遠心管 (NaJge Company, New York) 

に雨後肢を側方の穴から出して回定し拘束を行なっ た.マウスを以下の 4 m~ に分け,麻酔}):醒後マウ

ス両側足三里相当部位に刺激を行なった.

1 コントロール(拘束)群(拘束ストレス 30 

分)

2 ,鍛群(拘束および鍛刺激 13 ミリ 26号銀世銀 30分)

3 ,銭通屯群(拘束および錨通Lli刺激 13 ミ リ 26 号鍛, 15HZ 30分)

4 ,灸群(拘束および灸刺激 拘束30分下で半米 粒大=約 0.65mg 3壮)各群 N= lOとした

W 結 果

1 )拘束ス トレスの効果

拘束ストレスのみではL3T4-Lyt2-紺!胞, ~vl

1/70-*Iß胞は 30分後, 60分後ともにほとんど変 化を示さなかった. L灯4+Ly12 細胞, α ß+ γ

δ 細胞は 30分後有意に上昇した. 60 分後には L3 T4-Lyt2一細胞は 30分後に比べ低下し拘束前と同 レベルにもどった.他方 αβ+r ô-細胞は 60分後 には 30分後よりも低下する傾向を示した. μ+組l 胞は 30分後有Z互に低下し, 60分後も低下傾向を示 した α ß+ T ð 制胞もやや低下傾向を示した.

(図 1 )  2 )録刺激の効果

錨群では凶 T4+Lyt2 細胞, α8φ T ð-細胞は 3 0分後及び60分後で有意に上昇した. 60 分後でも 上昇が持続していることが,拘束群とは異なった 反応である また M 1 /70'細胞は拘束群と異なっ て, 30分後有意に上昇した.μ 細胞は 30 分, 60 

分後共に有意に低下した αβ T ð+ は拘束群と 同様やや低下傾向を示し, L3T4 -Lyt2+細胞は拘 束群と同僚変化しなかった (図 2

3 )鍛通電刺激の効果

銭通電群では拘束併と奥なり, L3T4+Lyt2-細 胞の変化が30分でも 60分でもみられなかった α

β T ð-納胞, Ml/70+細胞はやや上昇傾向を示 した αβ ー γ 占一細胞及び μ+細胞は,拘束群と 同様な変化を示した L3T4-Ly臼+細胞は拘束郡 及び銭群と同様に変化を示さなかった目(図 3) 

4 )灸刺激の効果

灸1罪では 30分後の μ4細胞のみが拘束間!と同様 な変化を示した.しかし, L3T4-Ly12 細胞, α β+ γδ 細胞では拘束群で認められた変化を示さ なかった. L3T4-Lyt2+細胞, αβ一 γr 細胞,

M  I 

/70-制l胞は拘束群,鍛通電訴と同様,変化 を示さなかった (図4)

V 考察

今回の実験で,末杵j血リンパ球の股表面マーカ一 陽性細胞率(%)の測定において, 鍛群60分と拘 束群とを比較して, へ Jレパー T 細胞 (L3T4 ← Lyt r細胞), αβT細胞 (a ß- γt 細胞)の陽伯 細胞率の上昇がみられた.拘束群では 30分後のみ にへ Jレパー T細胞, αβ 陽性T細胞の上昇が認め

(4)

錨刺激がマウス末梢 1(11 リンハ球サブセットに及ぼす影響

拘束群

L3T4  +  Lyt2  L3T4 '  Lyt2 + 

100  100 

rヘ 90

P<O.O 90 

渓 .0 .0 

70 

60 

‑ f  

60 

50 

5 ‑ 1   E

50 

40 

40 

30 

20 

。 i

1 10

+ー α ß 'y δ φ αβ7δ

100  10 

90  P<O.Q5 

ま .0

70 

i l ! l  

00 

寝刻

50 .0 

30 

20 

10 

M 1 /70 +  + 

μ

20 

10

.0 

15 .0 

P<O.OOl 

官奇

60 

奥量刻邸 一 山

50 40 ト

30 

20 

。 l

30  60  mln  30 

1 拘束群でのサブポピュレーションの変化

マウス末梢血リ ンパ球単球分聞での刺激iìíJ及ひ'30分1111の拘束刺激後 (初分後, 60分後)に おけるサプポピュレーションの変化を FACS 解析した結果を示した N ~ 10 とし平均 o :t標準偏差で示 L. 各個体ごとの測定値をそれぞれの γ ンポルで示した 倹定は処置前

と比較して Student's pair吋 t-test で行なった

H  •

a

60  min 

(5)

65 

第 II 号 61-69 (1992) 

nJli古銭灸医学

鋪群

L3T4  Lyt  2 

Lyt2 

L3T4φ

100 

P<O.OOl  90  0

0 0 0 0   0 9 8 7 8  

0 0 0 0   8 7 8 5  

P<O.Ol 

O B o   a

3 2   a

(渓)附町露間帯組盛

10  0

0 0 0 0 0   5 4 3 2 1  

αβrδ+

0 9 8  

100  90 

' 0 

70 

.0 

50  40 

(ま)

川町四町黒刻盛

E E

‑ ‑

E ‑ ‑

0 0 0 0   3 2 t

 

M1 /70 

μ

10 90  20 

P<O.Ol 

000

8 7 8 5  

「一一一一寸

15 

(ま)同町辺黒胡盛

「一一一寸

斗寸~ ?

0 0 0   4 3 2  

10  10 

m 川

30  図 2 鈍群でのサブポピュレンョンの比較

マウス末!Il血リ ンパ球単球分画での刺激前及び30分の銭刺激後 (3日分後, 60分後) お けるサプポピュレーショ ンの変化を PACS 解析した結果を示し \I~ 10と し,平崎O

±標準偏差で示し,各個体ごとの測定値をそれぞれのソンポルで示し 検定は処置前比較して Student's paired t-testで行なった

min 

.0 

30 

(6)

66  鍛車リ激がマウ末梢血リンバ球サプセ y トに及ぼす影響

鋪通電群

L 3T4' Lyt2 '  L3T4 ' 

Lyt2φ

10. 

,..

••

9. 

r、 ..

••

ま刊 7' 

時gE主盛 ••

.. 

•• ••

••

3. 

• E5 

2.  2 0 B  

,.

10 

αβ+7δー αβ7δ+

10

,.

9.  P<O.05 

r、 ..

ま 7.

子量

:•

持辺 6. 5. 

• t 

4

5盛

3. 

2. 

,。

M1 / 70  + 

μ

日「

,..

r、 "

随辺一

累主盛 品

•• ••

7' 

••

P<O.0

• ••

30 

20 

b 1   間 →

10 

30  E ロ mln 3.  60 mrn 

図 3 鍛通電群でのサブポピュレーションの変化

マウス末梢曲l リ ンパ球単球分画での車1)激iÌÍJ及び30分間白銀通Icr刺激後 (30分後, ω分後〉

におけるサプポピュレーション白変化をFACS解析した結果を示したー N~lOと l. 平 均0 :1:標準偏差で示1.-. 各個体ごとの曲l定値をそれぞれ白シンボルで示した 検定は処置 前と比較して Student'spaired t-testで行なった

(7)

I~J治銭灸医学第 11号 61-69 (1992) 

灸群

L3T4  Lyt2 

ー+

L3T4  Lyt2 

100  10

90  90 

r、 .0

~ eo 

、ノ 70 7D 

時週

60 

5ト a

60 

思胡盛

'0 40  50 ‘。

30 

20 

10  10 t

αβ7δ +ー αβ7δ 一+

100  10 

90 

80

、/ 7D 

γ

富 60 ケ1

票記 •

密 日

.0 

30 

20 

10 

M1 / 70φ

μ

20r  100 

ま 15

持 母

10 

5主需司

盛 s

90 

eo 

P<O.05 

60 

50 

40 

30 

十i

210 0 

30  60  mln  30  60 mln 

図 4 灸群でのサブポピュレーショ ンの変化

マウス末梢血リ y パ球!~球分画での刺激前及び灸(半米粒大 3 壮〉刺激後 (3切子後, 60:分 後) におけるサブポピュレーションの変イヒをFACS 解析した結果を示し

~IOと L , 平均o :t標準偏差で示 L ,各個体ごとの測定値をそれぞれのシ y ボルで示した 検定は処 也前と比較して Student'spaircd l-testで行なった

67 

(8)

6B  制リ激がマウス末梢血リンパ疎サプセ γ トに及ぼす影惇

られるのに比べ. 灸,鍬通íTIl\'Fにおいては.へ Jレ バー T細胞の陽性比率は 30分, 60分後とも有意な 変化は認められなかった a ßT細胞の陽性比率 は,鍛通電刺激では拘束1咋と同様に 30分後のみ有 意な上昇を示したが, 灸lÞ,では有意な変化を示さ

なかった. これらの結果は, 灸. 鍛通111刺激によ り,拘束ストレスにおける末梢 JI日リンバ球サブポ ピュレーションの変動を抑制する可能性を示唆す る.以上のことから,鎖刺激の効果は末梢血への へ Jレバー T細胞及び αβ 陽性T 制l胞の動員が, 拘 束ストレスのみに比べて.より強く発現したこと が示唆される.

B 細胞 (μ+細胞〕の~化においては,銭群で のみ 60分後でも行訟な低下を示した.このことは.

ヘルパー T 細胞の上昇と通勤した変化である可能 性が考えられる.灸1阜,賊通tt:.ì l拝においては拘束 群と問憾な変化を示した

単E事 (M

/70'制H胞〕は鍛 1拝の 30 分のみで有 意に上昇した.拘E巨1洋,鍛通,[ìJ咋. 灸群とも変化 が認められなかった.

これらの結果は, リ ンパ球サプポピュレーション の変化という点で, 鍬. 灸,銭通~m拝を比験する とそれぞれ奥なった反応を引き起こすことが示さ れた このことは刺激の'l'Iの相違いにより. 末梢 血へのリンパ硲の急性移行へのシグナ Jレの差とし て表現されたのかもしれない.

ヒトでのリンバ際サプポピュレーションの変化 に関して, 鍛通電車 11激によって{也常群では刺激直 後に CD4 陽性細胞,

CD 

8 陽性細胞の有意な変 動は認められなかったが,疾患t干において CD4 陽性細胞は上昇し. CD8 陽性細胞は有意な低下 が認められ,

C  D  4 

I\!ài!t細胞/CD8 陽性細胞比 が有意に上昇したという報告がある引 また健康 成人において鍬通氾刺激直後に句 CD4 紛性納胞 は一定の変動をみなつかたが,

C  D 

8 陽性細胞は 地加したという報告もある 10) 鍛刺激では,健康 成人において刺激直後に CD4 陽性細胞は有窓に 上昇し,

CD 

8 防組細胞は有意な低下が認められ たという報告がある川.

ヒト末梢血l リンパ球サプポピュレーションは様々

なストレスや環境の変化により変動するという報 告が多い 12-川 総リンパ時数と問機 T 細胞, B  細胞が夜をピークとした日内変動を示すことが報 告されている削 また初夏をピークとする総リン バ球数.へ jレパーT細胞. サプッレサー T 剖n胞の サーカディアンリズムがみられるが, C D 4 陥jg 制胞/CD8 陽性制l胞比は年間を通じて安定して いるということも報告されている19)

精神的ストレスでは単疎, NK 細胞, B 紺|胞は

l 1 ' l I

J1l L ,生理的ストレスでは.すべてのリンパ球 サブセットは地加したが, T/B 比,

CD 

4 陽性 細胞/CD8 陽性細胞比は減少した制 こと,ま た急性的なストレスでは CD8 が上昇し制.慢性 的なストレスでは CD8 が低下する 2け という報 告がある これらのストレスや環境変化によるリ

ンパ球サプポピュレーションの変動と異なって.

今回の結果において銭群では, へ Jレパー T 調1111包 αβT 紺|胞陽伯率の上昇,

C  D 

4 陽性制胞/CD B 細胞比, T/ 日比の地大が認められた.以上の ことから,鍛刺激がこれまでに報告されているス トレスによるリンパ球サプポピュレ-'./ョンの変 動とは興なることが示唆される

鍛刺激による免疫系への刻印の機構としては,

opiate peptides の役割や, 鉱山l激によって知党一 自律神経系が活性化された後,副\"1髄質から放出 される epinephrin ならびに enkephalin の役割l が報告されているい的. また銭通屯刺激がリン バ球地殖反応.),抗体産生応答7), N K 活性的を 地強するという報告もされている

これらの結果は銀灸の免疫応答調節が以下の二 つのメカニズムによることを示唆する 第一に知

~L神経・Ij 1極神経・ 自律神経を介する調節として,

リンパ系組織を支配する神経線維向身から放出さ れる分子による調節であり,第二に税床下部一下 重体一則\"1 (↑!tJ抑)系の放出するJln 中ホ Jレモンに よる ~lj節である 22) 鍛灸と免疫系の民Ii!l!の研究で は, 神経・免疫・内分泌系を一つの布b としてとら え.また中枢での反応と局所反応をも考慮するこ とが重要であろう.今回の結果は, 自律神経によ るリンパ球の Ifn 中への移行の制御としても考えら

(9)

明治鎖灸医学第 11号 61-69 (1992)  69 

れうる 今後自律神経機能及びリンパ球活性の両 面からの銭灸の効果を検討して行きたい。

文献

1 )龍 伯堅著!丸山敏秋訳治療の原則と方法,黄帝 内経慨論第二版?東i!f学術出版社,千葉県 pp73 -81 凶89

2) 定方 昭夫 「自然治癒力」を考える 7 宗教学と医療 2 講座人1M] と医療を考える 2 ,初版! 弘文堂!東京都 l pp67-91, 1卯1

3)  Bossy J: Immune Systems, Defense mecha  nisms and acupuncture Fundamenlal and  practica 1.aspects. A m  J Acupuncture, 18: 219 

‑232. 1990 

4) ,く obayashi T el al  Relationships between  ryodoraku autonomic ncrvous patterns and  immunological lcvels.  ト m  J Acupunclure  14 ; 23-28, 19邸

5) Nagano K  Immune enhancemenl lhrough  acupuncture and moxibustion : Specific  treaュ tment for allergic disorders, mild inf配 tious

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参照

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