総説動 物 細 胞 にお けるホ スファチ ジル コリン(エタノールアミン)の生合成とその調節石館光三・中澤泰男
生 体 膜 脂 質二 重 層 を構 成 す る主 要 な リ ン脂 質 ホ ス フ ァチ ジル コ リン お よび ホ ス フ ァ チ ジ ル エ タ ノ ー ル ア ミ ンの生 合 成 に 関 与 す る い くつ か の 酵 素 が 最 近, 単 離 ・精 製 され, 生 合 成 調 節 機 構 の解 明 が細 胞 レベル か ら 分 子 レベ ル あ る い は 遺 伝 子 レベ ル へ と移 行 しつ つ あ る 。 こ れ ら の リ ン脂 質 の 代謝 が, あ る 種 の 細 胞 情 報 伝 達 に 密 接 に 連 関 す る可 能 性 も指 摘 さ れ て い る 。 こ の 時 期 に 両 リ ン脂質 の 生 合 成 と そ の 調 節 機 構 に つ い て 研 究 の歴 史 を 踏 ま え な が ら整 理 し, かつ 将来 の展 望 を 考 え て み る こ とに した 。 は じめ に 動 物 細 胞 にお い て, そ の主 要 な膜 構 成 リン 脂 質 で あ る ホ ス フ ァチ ジ ル コ リ ン (PC) お よび ホ ス フ ァ チ ジ ル エ タ ノー ル ア ミン (PE) は, 共 通 の前 駆 体 ジ ア シ ル グ リセ ロー ル (DG) とCDP-コ リンお よびCDP-エ タ ノー ル ア ミン とか らそ れ ぞ れ 生 合 成 され る (図1)。 PCはPEの 段 階的 メ チ ル化 (S-ア デ ノ シ ル メ チ オ ニ ン, AdoMetを メ チ ル供 与 体 す る )に よっ て も合 成 さ れ, ま たPEは ミ トコ ン ド リア に局 在 す る ホ ス フ ァチ ジ ル セ リン (PS) 脱 炭 酸 酵 素 の作 用 に よ っ て も合 成 さ れ る こ とが 知 られ て い る^<1)>。 図1.動 物 細 胞 に お け る リ ン 脂 質 合 成 経 路Kozo Ishidate, Yasuo Nakazawa, 東 京 医 科 歯 科 大 学 難 治 疾 患 研 究 所 機 能 ・調 節 疾 患 研 究 部 門 (中毒 化 学) (〒101 千 代 田 区神
2-3-10) [Medical Research Institute, Tokyo Medical and Dental University, Kanda-surugadai, Chiyoda-ku, Tokyo 101, Japan]
Regulation of Phosphatidylcholine (Phosphatidylethanolamine) Biosynthesis in Animal Cells
Key word 【ホ ル フ ァチ ジ ル コ リン 生 合 成】 【ホ ス フ ァチ ジ ル エ タ ノー ル ア ミ ン生 合 成 】
40 蛋 白 質 核 酸 酵 素 Vol. 35 No. 6 (1990) 近 年, プ ロテ イン キ ナ ーゼC (Cキ ナ ーゼ) の発 見^<2)> を 契 機 に, い わ ゆ るCa^<2+>動員 ア ゴ ニス トの セ カン ドメ ッセン ジ ャー と して のDG^<3∼5)>および そ の 供給 系 と して の ホ ス フ ァチ ジル イ ノ シ トー ル (PI) 回路^<5∼7)>の存在 が 明 らか に され るに 至 り, 従 来, 生 体 膜 の構 成 成 分 と して 第 一義 的 な役 割 を 担 っ て い る と考 え られ て きた リン脂 質 (PL) が 重 要 な 生 理 機 能 に直 接 か か わ る も の と して, に わ か に注 目 され は じめ た 。 最 近 で は, あ る種 の細 胞 刺 激 に対 す る情 報 伝 達 にPCの 代 謝 的 分 解 が 深 くか か わ って い る例 も数 多 く報 告 され, い わ ゆ るPC回 路^<8,9)>の仮 説 が 提 唱 され て い る。 一 方 ,PCの 分 子 種 の1つ で あ る1-o-ア ルキ ルー2-ア セ チ ルsn-グ リセロ-3-ホ ス ホ コ リン が, 血 小 板 活 性 化 因子 (PAF) の本 体 で あ る こ とが実 証 され て^<10,11)>以来, 炎 症 関連 組 織 にお け る重 要 な生 理 活 性 物 質 と してそ の代 謝 機 序 に関 す る研 究 が多 方 面 か ら進 め られ つ つ あ る^<12)>。 これ らPCに 関す る最 近 の トピ ッ クス とは別 に, PC は血 漿 リポ蛋 白質 や 胆 汁 中 の主 要 な成 分 の1つ であ り, 血 中 トリ グ リセ リ ド, コ レス テ ロー ル の運 搬 や 代 謝, あ るい は腸 管 に お け る脂 肪 ・薬 物 の吸 収 に深 くか か わ っ て お り, そ の代 謝 調 節 機 構 の解 明 は, 近 年 ます ます 多 様 化 して き て い る種 々 の病 態 を考 え る うえ で非 常 に重 要 な研 究 課 題 とな っ て い る。 そ こ で本 稿 で は, 動 物 細 胞 にお け るPCの 生 合 成 とそ の調 節 機 構 につ い て現 在 ま で に得 られ て い る知 見 を ま と め, 今 後 の こ の分 野 で の研 究 方 向 の焦 点 を 筆 者 な りに 絞 っ て 述 べ て み た い。 また, PEに つ い て はPCの 場 合 と非 常 に類 似 し た酵 素系 を介 して生 合 成 され る こ と, お よ びPC合 成 の基 質 とも な り うる こ とを考 慮 し, そ の代 謝 調 節 につ い て も合 わ せ て考 え て み る こ と と した 。 1. PC (PE) 生 合 成 経 路 動 物 細 胞 にお け るす べ て のPLは ホ ス フ ァチ ジン 酸 (PA) を共 通 の前 駆 体 と して生 合 成 され る (図1) が, 1950年 代 前 半 に Kornberg^<13)> と Kennedy^<14)> の グル ー プ が ほ とん ど同時 に ラ ッ ト肝 膜 画分 を用 い てPA が グ リセ ロー ル-3-リ ン酸 とア シルCoAか ら生 成 す る裏 実 を報 告 した の が, PLの 生 合 成 に 関 す る 最 初 の 記 述 で あ っ た。 そ の 後, お もに Kennedy の グル ー プ が 中心 と な っ て, PAか らのPC (PE) 合 成 に, (1) 補 酵 素 と して CTPが 必 要 であ る こ と, (2) 中 間 体 と してCDP-コ リン (CDP-エ タ ノー ル ア ミン) を経 由す るこ と, (3) PAの 分 解 産 物 であ るDGが 直 接 の前 駆 体 であ る こ と, な どの 重 要 な ポ イ ン トが 次 々 に証 明 さ れ た^<1)>。現 在 で も 動 物細 胞 に お け るPC (PE) 合 成 の 主 要 経 路, CDP-コ リ ン (CDP-エ タ ノ ー ル ア ミン) 経 路 を しば しば そ の発 見者 に ち な ん で “Kennedy route” と よぶ こ とがあ る の も うな ず け る と ころ であ る。 ま た, Kennedy が1961年 の総 説^<15)>に描 い たPL合 成 マ ップ が30年 後 の現 在 で もほ と ん ど改 良 の余 地 な く完 成 さ れ た もの と して 引 用 され て い る事 実 は お どろ くべ き こ とで あ ろ う。 1953年, Stekolら^<16)>はラ ッ トに 投与 した メ チ オ ニン の メチ ル基 が肝PCに 取 り込 ま れ る事 実 を報 告 し, この 過 程 がPLの レベ ル, す な わ ちPEへ の メチ ル化 に ょ っ て 生 ず る 可 能 性 を 示 唆 した 。 の ち に Bremer と Greenberg^<17)>が ラ ッ ト肝 ミク ロ ソ ー ム画 分 中 にAdo Metを メチ ル 供 与 体 と し, PEか らPCを 生 ず る酵 素 活 性 を見 いだ し, 同時 に この 活 性 が 肝 で 非 常 に 高 く, 肝 以 外 の臓 器 で は低 い事 実 を認 め た 。 現 在 では 動 物 肝 に お け るPC生 合 成 の30%程 度 が このPEメ チ ル 化 経 路 に よ る^<18)>と考 え られ て い るが, 実 験 系 の違 い に よ っ て も大 きな 差^<19)>があ り, 正 確 な と ころ は不 明 で あ る。 一 方, PSの 脱 炭 酸 に よ っ てPEが 生 ず る経 路 が 動 物 細 胞 に も 存在 す る (細菌 お よ び酵 母 で は こ の経 路 がPE 図2. コ リン お よ び エ タ ノ ー ル ア ミ ン か ら のPCお よ びPEの 生 合 成^<21)> (1) コ リ ン キ ナ ー ゼ (CK), (2) コ リ ン リン 酸 シ チ ジ リ ル ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ (CPCT) , (3) コ リ ン ホ ス ホ ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ (CPT), (4) エ タ ノ ー ル ア ミ ン キ ナ ー ゼ (EK) , (5) エ タ ノ ー ル ア ミ ン リ ン 酸 シ チ ジ リル ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ (EPCT), (6) エ タ ノ ー ル ア ミ ン ホ ス ホ ト ラン ス フ ェ ラ ー ゼ
(EPT), (7) PEメ チ ル トラン スフ ェ ラ ー ゼ (PEMT)。
動 物 細 胞 に お け る ボ ス フ ァチ ジ ル コ リン (エ タ ノー ル ア ミン) の 生 合 成 とそ の調 節 41 合 成 の 主 要 経 路 で あ る) 事 実 が1961年, Borkenha genら^<20)>によ り初 め て証 明 され た。他 のPL合 成 酵 素 の 多 くがERあ るい は 細 胞 質 に 存 在 す る のに 対 し, 本 酵 素 活 性 が ミ トコン ド リア 内膜 に局 在 す る事 実 は, 動 物 ミ ト コ ン ド リアの 起 源 を 考 え る うえ で 興 味深 い 。 この経 路 に よ るPEの 合 成 が全PE合 成 の どの 程 度 を 占め るか は, 細 胞 の種 類 に よ って ま ち ま ち の 結 果 が 得 られ て お り, 統 一 的 な 見 解 に は 至 って い な い よ うで あ る^<21)>。 II. PC (PE) 生 合 成 酵 素 系 図2に 肝 実 質 細 胞 に お け るPC (PE) の 主 要 合成 経 路 と各 段 階 を触 媒 す る酵 素 の細 胞 内分 布 を 簡 略 に 示 した 。 近 年, これ らの酵 素 の多 くが 動 物 組 織 か ら精 製 ・単 一 化 され る に至 り, 生 合 成 調 節 機 構 の研 究 が 従 来 の 細胞 レベ ル の実 験 か ら分 子 レベ ル あ るい は 遺 伝 子 レベ ル の 実 験 へ と移 行 しつ つ あ る のが 現 状 で あ る。 こ こで は 生 合成 の 各 段 階 の酵 素 につ い て, 現 在 ま で に得 られ て い る重 要 な知 見 を ま とめ てみ た い。 1. コ リ ン (エ タノ ー ル ア ミ ン) の 細 胞 膜 透 過 コ リン はPC合 成 の 前 駆 体 と して ば か りで な く, 生体 に とっ て欠 くこ と ので き ない 化 学 伝 達 物 質 ア セ チ ル コ リ ン (ACh) の基 質 と して 重 要 な 物 質 で あ るが, 生 体 内 で は 前 述 したPEの メ チ ル化 (次 い でPCの 代 謝 的 分 解) に よ って わ ず か な 量 が産 生 さ れ るの み で あ り, 動 物 は そ の需 要 の大 半 を 食餌 に 依 存 しな け れ ば な らな い 。 そ れ ゆ え, 細 胞 (と くに コ リン作 動 性 の 神 経 終 末) に は体 内 に 吸 収 され た コ リンを 効 率 よ く取 り込 む 何 か特 異 的 な機 構 が 存 在 しなけ れば な らな い, とい う推 論 が 古 くか らな さ れ て いた が, そ の機 構 が 実 証 され た の は1965年^<22,23)>の こ とであ った 。 そ れ 以 後, さま ざ まな 観 点 か ら コ リンの 膜 透 過 に関 す る研 究 が な され て きた が, そ の 経緯 に つ い て は筆 者 らの総 説^<24,25)>を参 照 い た だ く と して, こ こで は ポ イ ン トだ け を抜 粋 す る こ と に した い 。 (i) 動 物 細 胞 には2種 類 のキ ャ リア依 存 性 コ リン透 過 系 が存 在 す る。1つ は神 経 終 末 に局 在 す るNa+依 存 性 の高 親 和 性 (Kt<5μM) コ リ ン 輸 送 系 (SDHACT) とよば れ る も ので あ り, 他 の1つ は神 経 細 胞 以 外 に も普 遍 的 に分 布 す る 低 親 和 性 (Kt>30μM) コ リン輸 送 系 で あ る。 (i) 前 者 は とくに コ リン作 動 性 神 経 終 末 に 豊 富 で あ り, ACh合 成 と密 接 なか か わ りを有 す る。後 者 は赤 血 球 を 含 む す べ て の動 物 細 胞 に 分 布 し, Na+依 存 性 が 弱 く, ま たSDHACTの 強 力 な阻 害 剤 で あ る hemicholinium-3に 対 して 感 受 性 が 低 い 。 後 者 の系 に ょ っ て細 胞 内 に 取 り込 ま れ た コ リン はお も にPC合 成 に 利 用 され る。 (iii) こ の両 系 以 外 に, あ る種 の細 胞 では non-satu ratingな 透 過 系, す なわ ち 単 純 拡 散 に よ る コ リ ンの膜 透 過 が 認 め られ てい るが, い ず れ の実 験 も生 理 条 件 よ りは るか に 高 濃 度 の コ リンが 用 い られ てお り, そ の生 理 意 義 が 疑 問 視 され て い る。 (iv) エ タ ノ ー ル ア ミン の膜 透 過 につ い て も コ リンの 低 親 和 性 輸 送 系 に 類 似 した キ ャ リア の存 在 が認 め られ て い るが, 動 物 細 胞 にお け る こ の両 者 は 別 々 の キ ャ リア蛋 白 質 で あ る とす る知 見 が 多 い 。 (v) 上 記 い ず れ の 透 過 系 も単 離 され て は お らず, そ の分 子 的 情 報 の詳 細 は 明 らか で は ない 。 (vi) ち なみ に, コ リン の血 中 濃 度 は哺 乳 動 物 で は 種 差 に か か わ らず, ほ々ま一 定 で10∼15μM, また エ タ ノー ル ア ミンの そ れ は ヒ トお よび ラ ッ トで5∼20μM程 度 と 報 告 さ れ て い る^<24,25)>。 2. コ リ ン (エ タ ノー ル ア ミン) キナ ー ゼ コ リンキ ナ ー ビ (CK;EC2.7.1.32) お よ び エ タ ノー ル ア ミンキ ナ ーゼ (EK;EC2.7.1.82) は それ ぞ れ 次 の 反 応 を触 媒 す る。 コ リン+ATP」→^^^<Mg^<2+>>コ リンリン酸+ADP エ タ ノー ル ア ミン+ATP→^^^<Mg^<2+>>エタ ノー ル ア ミン リ ン酸+ADP 1953年, Wittenberg と Kornberg^<26)>が酵 母 抽 出液 中 に両 酵 素 活 性 を 見 いだ し, 同 時 に種 々 の動 物 臓 器 の ア セ トン粉 末 中 に も これ ら の活 性 が 存 在 す る事 実 を報 告 した の が, CK (EK) に関 す る最 初 の記 述 であ った 。 以後, 多 くの研 究 者 に よ り両 酵 素 の精 製 ・単 一 化 お よび 本 反 応 のPC (PE) 生 合 成 に お け る調 節 的 役 割 につ い て検 討 が 加 え られ て きた 。 そ の過 程 の詳 細 は値 の 総 説^<24,25)>にゆ ず り, こ こ で は現 時 点 ま で の動 物 細 胞 のCK (EK) に 関 す る情 報 の うち, 大 方 の コ ンセ ンサ ス が 得 られ て い る事 項 に つ い て述 べ る。 (i) 反 応 の至 適pHは8.0∼9.5の間 で あ り, 2価 カ チ オ ン と してMg^<2+>, リン酸 供 与 体 と してATPが そ れ ぞれ 必 須 で あ る^<24)>。 (ii) 一 部 の例 外 (シ ナ プ トソー ム, ミエ リン画 分 な ど の脳 組 織) を除 き, 活 性 は 細 胞 内可 溶 性 画 分 (細胞 質) に局 在 す る (図2)^<24)>。 (iii) 臓 器 間 あ るい は 同一 臓 器 内 に お い て も1種 のみ で な く2∼3種 の ア イ ソザ イ み と して 存在 す る^<27,28)>。
42 蛋 白 質 核 酸 酵 素 Vol.5 No.6 (1990) (iv) こ の 中 で 筆 者 らの 手 に よ り初 め て均 一 な標 品 に ま で精 製 され た ラ ッ ト腎CKは, SDS-PAGEで42K の単 一バ ン ドを示 し, ま た天 然 型 は そ の2量 体 と推 定 さ れ た^<29)>。ご く最 近, ラ ッ ト肝 よ り 精 製 ・単 一 化 され た CKア イ ソザ イ ム は47Kサ ブ ユ ニ ッ トを有 す る4量 体 と報 告 され た^<30)>。 (v) CKの 最 も特 徴 的 な 性 質 は, 種 々 の条 件 下 で そ の 活 性 が 顕 著 な誘 導 を 受 け る事 実 であ る。 筆 者 らは, ラ ッ トに 発癌 性 多 環 芳 香 族 炭 化 水 素 (PAH)^<31,32)>あるい は 四 塩化 炭 素 (CCl_4)^<33)>を投 与 した とき, 肝CK比 活 性 が 経 時 的 に2∼4倍 ま で 上 昇す る事 実 を 初 め て 見 い だ した (図3)。 このCK活 性 の誘 導 はCKmRNAの 合 成 促 進 を伴 う酵 素 蛋 白 質 の増 加 に起 因す るが, 肝 以 外 の臓 器 で は ま った く認 め られ なか っ た。 そ の後,上 記 化 学 物 質 の投 与 以 外 に も さ ま ざ ま な要 因 でCK酵 素 蛋 白質 の誘 導 合 成 が確 認^<24,25)>され, CK活 性 が そ の遺 伝 子 発 現 の段 階 で制 御 され うる事 実 が 明 らか に な った 。 (vi) PAHやCCl_4で ラ ッ ト肝 に 誘 導 され たCKは, 正 常 肝 に 存在 す るCKア イ ソザ イ ム とは 免疫 学 的 に 明 らか に 区 別 され る新 た な ア イ ソザ イ ム であ る こ とが 判 明 した^<28,29)>。 (vii) ラ ッ ト腎^<34)>, ラ ッ ト肝^<30)>より均 一 に ま で精 製 さ れ たCK標 品 が いず れ もEK活 性 を有 す るこ と, 各 々 に対 して調 製 した 特 異 的 抗 体 が ラ ッ ト臓 器 に おけ るEK 活 性 を も完 全 に 沈 降 阻 害す る こ と, CKの 精 製 段 階 各 標 品 に お け るEK/CK活 性比 が つ ね に一 定 の 値 を示 す こ と, な どの 事 実 か ら少 な く と も高 等動 物 に お い て はCK とEKは 同一 の蛋 白質 で あ る可 能 性 が きわ め て 高 い と 判 断 され る^<30,34)>。 以 上, 動 物 細 胞 に お け るCKに 関 して お もな 知 見 を ま とめ た が, こ の中 で最 も注 目 され る事 実 は, (1) CKと EKが 同一 蛋 白質 であ る こ と, (2) そ れ ぞ れ に ア イ ソザ イ ムが 存 在 す る こ と, (2) CK (EK) 活 性 は 他 のPC (PE) 合 成 系 酵 素 に は ま った く認 め られ て い な い遺 伝 子発 現 調 節 で の制 御 を 受 け る こ と, の3点 で あ ろ う。 現 在 い くつ か の 研 究 室 で ラ ッ ト肝 お よび 腎CKのcDNAクロー ニ ソ グが 進 行 中 で あ り, 今 後 は ア イ ソザ イ ム存 在 の意 義 遺 伝 子発 現 機 構 とそ の調 節 因 子 お よびPC (PE) 生 合 成 との相 関, な どの解 明 に新 た な展 開 が期 待 され る。 3. コ リン (エ タ ノー ル ア ミン) リ ン酸 シチ ジ リル ト ラ ン ス フ ェ ラー ゼ コ リン リン 酸 シチ ジ リル トラン ス フ ェラ ー ゼ (CP-CT; EC2.7.7.15) お よび エ タ ノー ル ア ミン リ ン酸 シチ ジ リル トラン ス フ ェ ラー ゼ (EPCT; EC2.7.7.14) は, そ れ ぞれ 次 の反 応 を触 媒 す る。
コ リ ン リ ン酸+CTP【double arrow】^^^<Mg^<2+>>CDP-コリ ン+PPi
エ タ ノー ル ア ミン リン酸+CTP【double arrow】^^^<Mg^<2+>>CDP-エタ ノ ー ル ア ミン+PPi 1955∼56年, Kennedy と Weiss^<35)>は放 射 性 コ リン リン酸 (CP) のPCへ の 変 換 を ラ ッ ト肝 膜 画 分 を 用 い て 検 討 し, こ の変 換 に はCTPとMg^<2+>が 必要 で あ り, 中 間 体 と してCDP-コ リ ンを 経 由す る 事 実 を 見 い だ した 。 同 時 に, 同様 の 反 応 が エ タ ノー ル ア ミン リン酸 (EP) か らPEの 生 成 に も関与 す る事 実 を 明 らか に し, 上 記 の両 酵 素 がPCお よびPEの 生 合 成 に必 要 であ る と した 。 以後, と くにCPCTに 関 して は 多 く の研 究 者 に よ り種 々 の 酵 素 源 につ い て 性 質 の 解 明が 行 なわ れ た が, 詳 細 は 他 の優 れ た 総 説^<21,36,37)>にゆず り, こ こで は 本 酵 素 の特 徴 的 な 性 状 に つ い て のみ 触 れ る こ とにす る。 1963年, Schneider^<38)>はラ ッ ト肝 に お け るCPCT活 性 が ミク ロ ソー ム画 分 と細 胞 質 画分 の両 方 に分 布 し, 後 者 の活 性 は0℃ で数 目あ る い は37℃ で 数時 間 の イ ンキ ュベ ー シ ョンに よ り顕著 に上 昇す る事 実 を認 め た。 つ い で彼 らは, この活 性促 進 がPLの 添 加 に よ っ て も生 ず る 事 実 を 見 い だ し^<39)>, CPCTは そ の活 性 発 現 にPLを 要 求 す る酵 素 であ る こ とを示 唆 した。 そ の後, CPCTの 精 製 図3. 四 塩 化 炭 素 (CCl_4) 投 与 に よる ラ ッ ト肝CK活 性 の誘 導 の 経 時 変 化 (a) と誘 導 に対 す る ア クチ ノ マ イ シ ンDお よび シ ク ロヘ キ シ ミ ドの効 果 (b)^<33)> (a) 斜 線 部 分 お よび○ は 対 照 ラ ッ トで の値, ● はCCl_4投 与 ラ ッ トで の 値 を 示 す 。 (b) ●はCCl_4の み 投 与 した ラ ッ トで の値, ア クチ ノ マ イ シ ンD (△) はCCl_4と 同 時 お よび3時 間 後 に 投 与 。 シ ク ロヘ キ シ ミ ド (○) はCCl_4投 与3時 間 後 に 投 与 した 。 CCl_4投 与 に よ る肝CKの 誘 導 は シ ク ロヘ キ シ ミ ドに よ って は完 全 に抑 制 され る が, CCl_4投 与3時 間 後 に 投与 され た ア ク チ ノ マ イ シ ンDに よ っ て は 部 分 的 に しか 抑 制 され な い こ とを 示 す 。
動 物 細 胞 に お け る ホ ス フ ァチ ジル コ リン (エ タ ノー ル ア ミン) の 生 合 成 とそ の 調 節 43 が い くつ か の 研 究 室 で精 力的 に試 み られ た が, 本 酵 素 が 非 常 に凝 集 しや す い性 質 を有 す るた め に再 現 性 のあ る精 製 法 が 見つ か らず, 均 一 標 品 が得 られ た の は ご く最 近 の こ とで あ った 。Weinhold ら^<40,41)>はCPCTがPLを 要 求す る酵 素 で あ るこ と, お よび 凝 集 しや す い性 質 であ る こ とを十 分 に 考 慮 し, まず, ラ ッ ト肝 細胞 質 画 分 をPL 処 理 す る こ とに よっ てCPCTを 活 性 型 と した の ち, n-オ クチ ル グル コ シ ド (n-OG) あ るい は Triton X-100 (TX-100) 存 在 下 で 精 製 を 行 な い, 最 終 的 にSDS-PAGEで 約45Kの サ ブ ユ ニ ッ ト (天然 型 は2量 体^<42,43)>) を有 す る 均 一 標 品 を 得 るこ とに 成 功 した。 こ の 方 法 は 他 の 研 究 室 に よっ て も 再 現 よ く 追 試 され るこ と^<42,44)>が報 告 され, 最 近 ではCPCTに 関 して の種 々 の 実 験 が 従 来 の活 性 測 定 依 存型 か ら酵 素 蛋 白 質 レベ ルへ と 移 行 しつ つ あ る。 一 方 , EPCTに 関 して はCPCTほ どの 解 析 が進 ん で い な い が, そ の精 製 はす で に1975年, Sundler^<45)>によ り報 告 され た。 彼 が ラ ッ ト肝 細 胞 質 画 分 よ り通 常 の 方 法 精 製 したEPCTは, SDS-PAGEで 約50K, 天 然 型 の分 子量 は100∼120Kと 推 定 され, CPCTと 同 様2 量 体 で 存在 す る ら しい。CPCTと 異 な ってPLの 添 加 は 活 性 に影 響 を与 えず^<46)>, ジチ オス レイ トール の存 在 が 活 性 発現 に 必要 で あ る^<45)>。CPCTとは 精 製 の初 期 の ゲル 濾 過 の 段 階 で分 離 さ れ る^<45)>。EPCTがCPCTと は 別 の 蛋 白 質 で あ る 可 能 性 は, 他 の 実 験 か らも 示 唆 され て い る^<47)>。また, 動 物 細 胞 のCPCT変 異 株 を 用 いた 実 験 で も, 間 接 的 な 証 明 で は あ る が 両 者 の 独 自性 が 支 持 され た^<48)>。 CPCTの 他 のPC合 成 系 酵 素 にみ られ な い特 徴 は, 本 酵 素 が い わ ゆ る “ambiquitous” な性 質^<21)>, す なわ ち細 胞 質 と ミク ロ ソー ム 画分^<*1>(ER) の 両 方 に 分 布 し (図 2), 細 胞 の おか れ た状 況 に よ っ て そ の分 布 に 可 逆 的 な 変 化 を生 ず る事 実 で あ る。 前 述 した よ うに, 細 胞 質 画 分 のCPCTは そ の活 性 発 現 にPLを 要 求す るが, 細 胞 内 PLの 大 半 は膜 画 分 に局 在 す るた め, 生 理 的 に は こ の細
胞 質CPCTは “inert form” であ り, “reservor” と し
て 機 能す る, との考 え 方 が 支 配 的 に な って い る。CPCT の研 究 に 最 も熱 心 で あ っ たVanceの グ ル ー プ は種 々 の 細 胞 レベ ル の 実 験成 績 を も とにCPCTの “transloca tion” 仮説^<50)> (図4) を 打 ち 出 し, こ の仮 説 を 裏 付 け る 証 拠 を 次 々 に 発 表 した^<37)>。そ れ に よ る と, CPCTの 細 胞 内 分 布 は 次 の3つ の 要 素 に よ り 左 右 され る と い う。 第1は 脂 肪 酸 に 仲 介 され るCPCTの 細 胞 質 か ら小 胞 体 (ER) へ の移 行 で あ り^<51,52)>, 第2はcAMP依 存 性 キ ナ ーゼ (Aキ ナ ーゼ) の作 用 に よ るCPCTのERか らの 遊 離 (不 活 性 型 へ の移 行) お よび 脱 リン酸 化 に よ るそ の 逆 転 送 (ERへ の移 行)で あ る^<53,54)*2>。脂 肪 酸 を介 す る CPCTと 膜 との相 互 作 用 は 高塩 濃 度 で は 影 響 され ず, TX-100に よ り抑 制 さ れ る事 実^<55,56)>から疎 水 的 な結 合 に よ る とされ て い る が, こ の点 につ い て は異 論^<57)>もあ る。 こ の結 合 に脂 肪 酸 が どの よ うな形 で 関与 す るか, は 不 明 であ る が, BSAに よっ て 脂 肪 酸 を捕 捉 す る と, CPCT も膜 か ら遊 離 す る とい う^<55,58)>。また, 脂 肪 酸 の 作用 は 強 力 で, Aキ ナ ーゼ 作 用 に よっ て生 じた遊 離 型CPCT (リ ン酸 化 され た酵 素?) を も膜 へ 結 合 させ る^<59)> (図4)。 translocation に 関 与 す る 第3の 因子 と して はKentら の グ ル ー プ に よ り提 唱 さ れ た膜 側 の脂 質組 成 変 化 が あ げ られ る^<60,62)>。膜 画分 のPC含 量 が減 少す るか, あ るい は DG含 量 が 増 加 す る と, 細 胞 質CPCTが 膜 へ 移 行 し, 活 性 型 に な る とい う説 で あ る。 以 上 のCPCTの translocation に よ る活 性 調 節 機 構 の基 盤 とな る最 大 の要 因 は, そ のPC合 成 速 度 との 連 関 にあ る。 す なわ ち, PC合 成 を 促進 す る状況 で は 多 く の 場 合, 同時 にCPCTの 細 胞 質か ら膜 へ の移 行 が 観 察 さ 図4. CPCTの 細 胞 内 “translocation” の モ デ ル *1 Kentら^<49)>は最 近, 膜 結 合CPCTの 細 胞 内 局 在 性 を 詳 細 に 分析 した 結 果, 小 胞 体 で は な く, 核 膜 に 最 も 多 く分 布 して い る と報 告 した 。 *2 ご く最 近, ラ ッ ト肝 よ り 精 製 され たCPCTがAキ ナ ーゼ に よ り リン酸 化 され, 同 時 に 活 性 が 抑 制 され る との 証 拠 も 出 され た^<44)>。
44 蛋白質核酸酵素 Vol. 35 No. 6 (1990) れ る事 実 であ る^<36,50)>。しか しなが ら, これ らの結 果 の大 半 は in vitro あ るい は 培 養 細胞 レベ ル で の 実験 に よる もの で あ り, in vivo で は た してCPCTの transloca tion が実 際 に起 き て い るか ど うか の証 拠 は乏 し く, こ の 点 が 今後 の課 題 で あ ろ う。 CPCTに 関 して は主 と して 現 象 的 な 側面 か らの 膨 大 な研 究報 告 が あ るが, 精 製 標 品 が 得 られ るよ うに な っ た 現 在, (1) cDNAの ク ロー ニン グ と構 造 解 析, (2) 膜 結 合 お よび 脂肪 酸 結 合 ドメ イン の 同 定, (3) Aキ ナ ー ゼ リン酸 化 部 位 の 同定 と活 性 調節, (4) 種 々条 件 下 に お け るmRNA の 定 量 と遺 伝 子発 現 に よ る活 性調 節 の可 能 性 の解 析 な ど, よ り直 接 的 な現 象 の裏 付 け が な され る条 件 が備 わ った と い え る。 4. コ リ ン (エ タ ノ ー ル ア ミ ン) ホ ス ホ トラ ンス フ ェ ラ ー ゼ コ リンホ ス ホ トラ ンス フ ェ ラ ー・ゼ (CPT ; EC2 .7.8. 2) お よび エ タ ノー ル ア ミン ホ ス ホ トラ ンス フ ェ ラー ゼ (EPT ; EC2.7.8.1) は, それ ぞれ 次 の 反応 を触 媒す る。 これ らの酵 素活 性 が 動 物肝 の膜 画分 に 存在 す る事 実 が Kennedy と Weiss^<35)> に よ って発 見 され て 以 来, 種 々 の 酵 素 源 を用 い た 性 質 の 解 明 に 関す る報 告 は 数 多 い が, 精 製 の 試 み は ほ とん ど な され て い な い 。 発 見 の 当 初か ら CPTとEPTが 別 々 の酵 素 で あ ろ う とす る知 見 が 得 ら れ て い た が, そ の後 の 報 告 の 多 く も 両 酵 素 の 基 質特 異 性, カチ オ ン要 求 性, 界 面 活 性 剤 に対 す る挙 動, 熱 お よ び プ ロテ ア ー ゼ に 対す る安 定 性 な どに顕 著 な 差 が認 め ら れ る事 実 か ら, この知 見 を 支 持 した^<63∼67)>。ただ し, 両 活 性 を 完 全 に 分 離 した とい う例 は い ま だ に 見 当 た らな い^<64,67)>。Polokoffら^<68)>はCHO細胞 のEPT変 異 株 を単 離 した が, この細 胞 に お け るCPT活 性 が正 常 であ った 事 実 か ら, 両 酵 素 が別 々 の構 造 遺 伝 子 産 物 であ る可 能 性 を 強 く示 唆 した 。 一 方, PAFの 合 成 に関 与 す る血 小 板 のCPT (1-o-ア ル キ ル-2-ア セチ ル グ リセ ロ ール を基 質 とす る) は異 な る分 子種 で あ る との報 告^<69)>もあ る。 CPTの 細 胞 内分 布 に関 して は, 当 初 はERに 局 在 し^<70)>, 他 の 細胞 内膜 画 分 に 認 め られ る活 性 はERの 混 在 に よ る もの^<71,72)>と考 え られ て い た が, そ の 後, 分 画 技 術 の 進 歩 と とも に ゴル ジ画分^<73,74)>, ミ ト コン ドリア 外 膜^<75)>, 核 膜^<76)>にも分 布 す る事 実 が 明 らか に され た 。 た だ し, 基 質 と して 内 因性DGを 用 い た 場 合 と, 外 か らDG を添 加 して酵 素 活 性 を測 定 した 場 合 とでは, 酵 素 の分 布 に有 意 な 差 が生 ず る事 実^<77)>も指 摘 され て い る。 一 般 的 に は 細胞 内CPT活 性 の大 半 がERに 存 在 す る と考 え て よ さ そ うで あ る (図2)。 CPTもEPTもER膜 に強 く結 合 した, い わ ゆ る 膜 内在 性 蛋 白質 と して存 在 す るが, 膜 を 可 溶 化 す る よ う な濃 度 の各 種 界 面 活 性 剤 で と く にCPT活 性 は 完 全 に 失 活 す る事 実^<78)>から, そ の活 性 中心 近 傍 のPL環 境 が 酵 素 の高 次 構 造 を保 持 す る の に重 要^<79)>と考 え られ て い る。 ま た, 膜 に非 透 過 性 のCDP-コ リ ン (CDP-エ タ ノール ア ミソ) を基 質 とす る こ と, プ ロテ ア ーゼ な ど の処 理 に よっ て容 易 に失 活 す る こ とな どか ら, 活 性 中 心 を含 ん だ 少 な く とも酵 素 の一 部 分 は 細 胞 質 側に 顔 を 出 して い る と 思 わ れ る^<80,81)>。 CPTに 比 べ て界 面 活 性 剤 に 対 して 安 定 なEPTに関 して, 最 近 そ の精 製 が試 み られ た。Roberti ら^<82)>はラ ッ ト脳 ミク ロ ソー ム 画分 を0.1%DGを 含
む1%TX-100で 可 溶 化 し, つ い でDEAE-BioGel Aお よびBio
Gel HPT (ヒ ドロキ シ アパ タ イ ト カ ラ ム) を 用 い て EPT活 性 を 約1,200倍 ま で 精 製 した 。 最 終 標 品 は SDS-PAGEで20∼60Kの 間 に5本 のバ ン ドを 呈 し, ま だ均 一 とは言 い が た い が, 最 初 の高 度 精 製 の例 と して 十 分 評 価 に値 す る と思 わ れ る。 CPTに 関 す る研 究 は, 安 定 な可 溶 化 標 品 を得 る のが 困難 で あ る事 情 か ら, 大 半 が生 体 膜 そ の も の を用 いた 実 験 に よる が, 一 般 的 な反 応 の性 状 と して次 の事 項 があ げ られ る^<36,79,87)>。(1) 外 因性 のDGに よ り活 性 が著 し く促 進 す る。(2) 内 因性DGレ ベ ル を上 昇 させ る と活 性 も上 昇 図5. CPTと そ の 基 質CDP-コ リンお よびDGと の結 合 モ デ ル 点 線 部 分 は 特 異 的 認 識 部 位 を 示 す 。
動 物 細 胞 にお け る ホ ス フ ァチ ジ ル コ リン (エ タ ノ ー ル ア ミン)の 生 合 成 とそ の 調 節 45 す る。(3) de novo 経 由 (PAの 水 解) に よ って 生 じた DGが 優 先 的 にCPTの 基 質 と して 利 用 され る機 構 が 存 在 す る。 す な わ ち, de novo 経 路 で生 成 したDGが, 他 の膜 内DGプ ー ル と混 同す る こ とな く, PC合 成 に使 わ れ る よ うな “チ ャン ネル 系” が 存 在 す る と い う仮 説^<83,84)>が出 され て い る。(4) CPTはCDP-コ リ ンの分 子 構 造 の シチジン-4-ア ミノ基, リボ ー ス の2'-OH基, 2 つ の リン酸 結 合 部 分 お よび コ リンのN^+を 同 時 に認 識 し, きわ め て 結 合 特 異 性 が 高 い^<85)> (図5)。(5) 活 性発 現 に Mg^<2+>ある い はMn^<2+>を 要 求 (ど ち らの 要 求 性 が 強 いか は酵 素 源 に よ る ら しい) し, Ca^<2+>によっ て 強 い 阻 害 を受 け る。 と くにCa^<2+>に よ る阻 害 は 生 理 的 濃 度 (μM以 下) で十 分 起 こ り うる。(6) DGの 脂 肪 酸 組 成 に対 して 若 干 の 特 異性 を示 す 。(7) 反 応 は 可 逆 的 で あ り, CDP-コ リン/ CMPの 濃 度 比 に よ って 方 向 性 が 決 ま る。(8) CPT反 応 は 酵 素量 に よっ て制 御 され る の で は な く, 基 質 (CDP-コ リン とDG) の レベ ル に よ る と の見 方 が 強 い^<36,79)>。 筆 者 らの研 究 室 で は最 近, ラ ッ ト肝 のCPTを 単 離 す る 目的 で [^<32>P] CDP-コ リソ を 用 い た direct photo-affinity label 法 を検 討 した結 果, 興 味 あ る い くつ か の新 知 見 を 得 た の で紹 介 した い 。 まず 最 初 に数 種 の界 面 活 性 剤 を 用 い て肝 ミク ロ ソー ム 画分 か らのCPTの 可 溶 化 を 試 み た 結 果, CPTは 非 イオン 性 界面 活 性 剤 (TX-100, n- OGな ど) に よっ て は いず れ も不 可 逆 的 な失 活 を も た ら し, わず か に イ オ ン性 の デ オ キ シ コー ル酸 (DOC) の み が 有 効 で あ った 。 この事 実 はCPTの 活 性 保 持 に脂 質 二 重 層 の形 態^<86)>が必 須 で あ る こ とを 示 唆 した (図6C)。
DOC可 溶 化 標 品 をDOC存 在 下, Superose 12に よ る
ゲ ル濾 過 を行 な っ た結 果, CPT活 性 は ボ イ ド画 分 のみ に溶 出 し, 脂 質 を含 む 巨 大 凝 集 体 と して 回 収 され たが, こ の操 作 に よ りCPT比 活 性 は4倍 に 上 昇 し, 活 性 回 収 率 約40%で あ っ た 。 この 標 品 をCPT部 分 精 製 標 品 と してDOC除 去 の の ち, 別 途 合 成 した [^<32>P] CDP-コ リ ン とイン キ ュベ ー ト し, つ い で254nm紫 外線 を10∼ 15分 間照 射 した。 試 料 中 の 蛋 白 質 をTCAを 加 え て 沈 殿 させ た の ち, 蛋 白 質 に 取 り込 ま れ た 放 射 活 性 を 測 定 し た結 果, CDP-コ リン は 紫 外 線 照 射 依 存 的 に 蛋 白質 画 分 へ 取 り込 ま れ, ま た, こ の結 合 に はMg^<2+>の 存 在 が 必 須 図6. 界 面 活 性 剤 に よ って 可 溶 化 さ れ た 膜蛋 白 質 の 予 想 さ れ る形 態^<86)>
A (micellar binding), B (monolayer binding) は非 イ オン 性 界 面 活 性 剤 の 場 合, Cは 低 濃 度 のDOCの 場 合 を それ ぞれ 示す 。 図7. 紫外線 照射依存的なCDP-コ リンの蛋白質へ の結合 照射0分 においての放射活性はCPTが 基質 と結 合 した ま ま酸 沈殿 した ものか, あ るいは基質 の一部が内在性DGと 反 応 し, PCを 生成 した もの と思われ る。 ▲はMg^<2+>のない 場 合。
46 蛋 白 質 核 酸 酵 素 Vol.35 No.6 (1990) で あ っ た (図7)。CPT活 性 と同様, CDP-コ リン の蛋 白 質 へ の結 合 は μMのCa^<2+>で 完 全 に抑 制 され た 。 さ ら に, この結 合 は, 共 存 す る比 放 射 性 のCDP-コ リンお よ びCDP-エ タ ノー ル ア ミン に よ って 濃 度 依 存 的 な 抑 制 を 受 け た が, CPやCDPに よ って は 影 響 を 受 け な か った (図8)。 これ ら の事 実 はCDP-コ リンが 紫 外 線 照 射 依 存 的 に結 合 した 蛋 白 質 がCPT (EPT) で あ る可 能 性 を 強 く示 唆 した (図5参 照)。 次 に, TCA不 溶 画 分 に つ い て SDS-PAGE→ オ ー ト ラジ ォ グラ フ ィー の 順 に 操 作 し, [^<32>P] 結 合 蛋 白 質 を 同 定 した結 果, 18Kと25K相 当 の位 置 に強 い放 射 活 性 を 示 す2本 のバ ン ドが 検 出 さ れ た。 す な わ ち, こ の2本 がCPT (EPT) のCDP-コ リ ン結 合 部 位 を 含 む ポ リペ プチ ドであ る可 能 性 が 強 く示 唆 され た。 現 在, この2本 の バ ン ドの単 離 と精 製 を 検討 中 で あ る。 5. ホ ス フ ァ チ ジ ル エ タ ノー ル ア ミ ンメ チ ル トラ ンス フ ェ ラー ゼ
PEメ チ ル トラン ス フ ェラ ー ゼ (PEMT ; EC2.1.1.
17) は, 次 の3段 階 の メチ ル 化 反 応 を 触 媒す る。 PE→^^<AdoMet>ホ ス フ ァ チ ジ ル モ ノ メ チ ル エ タ ノ ー ル ア ミ ン (PMME) →^^<AdoMet>ホス フ ァ チ ジ ル ジ メ チ ル エ タ ノ ー ル ア ミ ン (PDME)→^^<AdoMet>PC メチ オ ニン の メチ ル 基 が エ タ ノー ル ア ミンに渡 され, コ リン を生 成 す る経 路 が 動 物 体 内 に存 在 す る事 実 は古 く か ら知 られ て いた が, こ の反 応 がPE→PCの 段 階 で の み 起 こ り, CDP-エ タ ノー ル ア ミン経 路 の 水溶 性 中間 体 の段 階 で は起 こ らな い事 実 を 初 め て 証 明 した の は Bremer と Greenberg^<88)> (1959年) で あ っ た。 そ の後, 彼 ら は (1) AdoMetが 直 接 の メチ ル供 与 体 で あ る こ と, (2) こ の 活 性 は ミ クロ ソー ム膜 画 分 に 局在 す る こ と, (3)生成 物 の 95%はPCで あ り, 残 りはPMMEとPDMEで あ る こ と, (5) 至 適pHは10∼10.5と ア ル カ リ側 に あ り, 活 性 に はSH基 が関 与 す る こ と, (6) 他 の臓 器 に比 べ て肝 で 圧 倒 的 に活 性 が 高 い こ と, な どの 事 実 を 次 々 に 明 らか に した^<89,90)>。 以 後, 本 酵 素 系 の ミク ロ ソー ム膜 か らの可 溶 化 ・精 製 お よび, 3段 階 の メチ ル 化 が 同一 の酵 素 に よっ て触 媒 さ れ るか 否 か, また, こ の経 路 で 生 成 され るPCがCDP-コ リン経 路 で生 成 され るPCと 機 能的 に異 な る運 命 を有 す るか 否 か, な どが 大 き な研 究 課 題 とな っ た 。 Mato らの グル ー プ^<91)>はラ ッ ト肝 ミク ロ ソー ム よ り CHAPS^<*3>を 用 い てPEMTを 可 溶 化 した の ち, 本 酵 素 の精 製 を 試 み, 最 終 的 に 約850倍 の精製 度 (可溶 化 標 品 に 対 して) で25Kサ ブ ユ ニ ッ トを有 す る2量 体 (50K) を 得 た 。 こ のサ ブ ユ ニ ッ トは 放 射 性8-ア ジ ド-AdoMet に よ り特 異 的 に photo-affinity label され る事 実 か ら, 彼 らは この ポ リペ プ チ ドがPEMTの 触 媒 サ ブ ユ ニ ッ ト で あ る と結 論 した^<92)>。一 方, Ridgway ら^<93)>はTX-100を 用 い て 可 溶 化 した ラ ッ ト肝 ミク ロ ソー ム 由来 のPEMT を精 製 し, 最 終 的 にSDS-PAGEで18.3K相 当 の位 置 に 単 一バ ン ドを有 す る標 品 を 得 た。 精 製 度 は ミ ク ロ ソー ム 画 分 に 対 し約950倍, 可 溶 化 標 品 に 対 して は1,400 倍 を 示 した 。 この標 品 に対 して得 た ウ サ ギ抗 体 に よ る ウ ェス タ ン ブ ロ ッ トの結 果 は, 18Kポ リペ プチ ドのみ を 検 出 した^<94)>。これ らの結 果か ら彼 らは, Mato ら の報 告 した50K2量 体 はPEMTで は な い と結 論 し, ラ ッ ト 肝 のPEMTは18K単 量 体 と して のみ 存 在 す る と した 。 ラ ッ ト肝 に お け るPEMTは1種 のみ であ り,こ の酵 素 が3段 階 の メチ ル化 を 同時 に触 媒 す る とい う可 能 性 が 強 く示 唆 され て い る^<17,89,95)>一方, 肝 お よび そ れ 以 外 の臓 器 に も2種 の酵 素 が 存在 し, メ チ ル トラン ス フ ェラ ー ゼ IはPE→PMMEを, ま た, メ チ ル トラン ス フ ェラ ー ゼIIは 残 る2つ の 段階PMME→PDME→PCの 反 応 を 触 媒す る との 知 見 が, お もに Axelrod の グル ー プ^<96∼100)> に よ り 提 唱 され て い る。 この2種 の 酵 素 は 至 適pH, 図8. [^<32>P] CDP-コ リンの 蛋 白質 へ の紫 外 線 照 射 依 存 的 な結 合 に 及 ぼ す 構 造 類 似 化 合 物 の 影 響 ● : CDP-コ リン, ▲ : CDP-エ タ ノ ール ア ミン, ○ : コ リン リン酸(CP), ■ : 5'-CDP. CDP-コ リン の添 加 は濃 度 依 存 的 な 阻 害 を 示 す の に 対 し, CDP-エ タ ノー ル ア ミンは 約 50%ま で しか 阻 害 しな い 。CPお よび5'-CDPは [^<32>P] CDP-コ リンの 蛋 白質 へ の 結 合 に ほ とん ど影 響 を 与 え な い こ とが わ か る。
*3 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propane sulfonate
動 物 細 胞 に お け る ホ ス フ ァチ ジル コ リン (エ タ ノー ル ア ミン) の 生 合 成 とそ の 調 節 47 AdoMetに 対 す る親 和 性, Mg^<2+>要求 性 な ど に著 しい差 が あ る とい う。 た だ し, 前 述 の よ うにPEMT活 性 は肝 で 圧 倒 的 に 高 く, 他 の 臓 器 で は非 常 に低 い事 実か ら, 肝 以 外 で の 本 活 性 の 意 義 に つ い て は よ く 理 解 され て い な い 。Hirata ら^<101)>の主 張 した, あ る種 の細 胞 情 報 伝 達 に PEMTが 関 与す る とい う仮 説 に対 して も, 現 在 は否 定 的 な見 解 が 多 い よ うで あ る^<102)>。 従 来, 肝 に お け るPEMTの 存 在 意 義 と して, CDP-コ リン経 由で 生 成 され に くい polyunsaturated PC分 子 種 を 供 給 す る こ とに あ る とい う考 え方 が あ った が, 精 製 酵 素 を 用 い た 最 近 の 実 験^<103)>ではPEMTにPE分 子 種 選 択 性 が 認 め られ ず, む しろ 従 来 の知 見 はPC分 子 種間 の代 謝 回 転 速 度 に違 い が あ るた め に生 じた結 果 で あ る ら しい^<89)>。 一 方 , PEMT活 性 が肝 で顕 著 に高 い事 実 か ら, こ の 経 路 で合 成 され るPCが 何か 肝 特 異的 な機 能 と関 連 す る の では な い か との 観 点 で, リポ蛋 白 質分 泌 へ の影 響 が検 討 され た 。 しか しな が ら, 結 果 は肝 細胞 か ら分 泌 され た VLDLやHDLの 中 に, PEMT経 路 で合 成 され たPC が 選 択 的 に 取 り込 ま れ る可 能 性 は否 定 され, む しろ リポ 蛋 白質 合 成 ・分 泌 の プ ロセ シン グにPEMTは 直 接 関 与 しな い^<104,105)>とい う結 果 が 得 られ た。 現 在 まで の と ころ, PEMT経 路 で合 成 され たPCの 特 異 的 な 機 能 は 解 明 され て い な い が, 生 体 内 にお け る唯 一 の コ リン合 成 経路 と して重 要 な意 義 を有 す る のか も し れ な い 。 事 実, CDP-コ リン経 路 が 抑 制 的 な種 々 の生 理 条 件 で はPEMT活 性 の充 進 が 認 め られ て お り^<89)>, た と え ば コ リン欠乏 時 の肝 で はPEMT活 性 が有 意 に上 昇 す る^<94)>とい う。 ま た, 細 胞 内 のcAMP^<106∼109)>やCa^<2+ 110)> の 上 昇, あ るい は細 胞 のTPA^<111,112)>処理 (Cキ ナ ーゼ 活 性 化) は, CDP-コ リン経 路 に よ るPC合 成 の抑 制 を もた らす 一 方, PEMT活 性 を促 進 す る との報 告 が 多 い 。
PEMT自 身 が これ ら の状 況 で covalent modification に
よ る調 節 を受 け るか 否 か は未 解決^<113)>の問 題 と して 残 さ れ て い るが, 肝 特 異 的 なPEMT遺 伝 子 発 現 の問 題 とと もに 重要 な今 後 の研 究 課 題 とな る で あ ろ う。 III. PC (PE) 生 合 成 の 調 節 と 機 能 PC (PE) 合 成 にあ ず か る個 々 の酵 素 につ い て の情 報 の うち, と くに重 要 と思 わ れ る知 見 を こ こ ま で紹 介 して き た。 そ れ で は, (1) 動 物 細 胞 にお け るPC生 合 成 は 実 際 に どの 段 階 で, ど の よ うな機 構 で調 節 され て い る ので あ ろ うか 。 (2) 新 た に合 成 され たPC分 子 に 何 か 特 異 的 な 機 能 が あ るの で あ ろ うか 。 これ らの単 純 な疑 問 に 対す る明 快 な 解 答 は 残 念 なが ら 今後 の研 究 に 委ね な け れば な らな い が, こ こで は 現 時 点 に お け る筆 者 な りの 考 え 方 を 述 べ て み た い と思 う。 まず (1) の疑 問 に対 して で あ るが, Infante ら^<114∼116)> は ラ ッ ト肝 に お け るPC (PE) 合 成 の 水 溶 性 中 間 体 な ら び に コフ ァ クタ ー の プ ー ル サ イ ズ か ら理 論 的 な 考 察 を 加 え, PC (PE) 合 成 の律 速 段 階 は 初 め の2段 階, す な わ ちCK (EK) とCPCT (EPCT) の両 方 に あ る と結 論 し た。 以来, 多 くの研 究者 に よっ て 種 々 の モ デ ル 実 験 が 行 なわ れ て き た が, CK (EK) に 関 して は ア イ ソザ イ ムの 存 在 と遺 伝 子発 現 を 伴 う酵 素 量 の 調 節 (長 期 的 調 節) が 明 らか に され, 一 方, CPCT (EPCTで は 認 め られ て い な い) に 関 して は細 胞 内 translocation お よび covalent modification (両 者 は 密 接 に連 関) に よ る翻 訳 後 修 飾 的 な調 節 (可逆 的 な短 期 的 調節) が 提 起 され て い る。 興 味 深 い の は, この逆 の 調 節, す な わ ちCK (EK) に 対 す る 短 期 的 な調 節, あ るい はCPCT (EPCT) に 対 す る長 期 的 な調 節 機 構 の存 在 を示 唆す る知 見 が ほ とん ど見 当 た ら な い事 実 で あ る。細 胞 はPC合 成 の充 進 あ るい は 抑 制 の 情 報 に対 し, そ の 質 的 な 差 を 見わ け, 2つ の タ イ プ の調 節 を うま く使 い分 け て対 応 す る の か も しれ な い。CK (EK) お よびCPCT (EPCT) が い ず れ も均 一 な 精 製 標 品 と して 得 られ る よ うに な っ た 現在, さ らに 詳 細 な分 子 レ ベ ル で の調 節 機 構 の 解 明 が な さ れ つ つ あ る よ うに 思 う。 他 方, PC (PE) 生 合 成 調 節 の 最終 的 な 究 明 は, 各酵 素 の単 離 とそ れ らの in vitro 再 構 成 に よ って 初 め て な され うる も の で あ ろ う。 残 され たCPT (お よびEPT) の精 製 ・単 一 化 に は な お相 当 な 困難 が 予 想 され るが, 近 い将 来 ぜ ひ わ れ わ れ の手 で克 服 した い と考 え て い る。 次 に (2) の疑 問 に対 して は, 最 近, 肝 に お け るPC 合 成 とVLDL分 泌 との関 連 で興 味 あ る知 見 が 報 告 され た。Vance らの グル ー プ^<117∼119)>はコ リン お よび メチ オ ニ ン欠 乏 食 で3日 間 飼 育 した ラ ッ トの肝 細 胞 ではPC合 成 能 の低 下 と とも にVLDL分 泌 の著 しい 減 少 を 認 め た 。 HDLお よび 他 の血 漿 蛋 白質 の分 泌 は 正 常 で あ った 。 こ の事 実 は細 胞 にす で に存 在 す るPCはVLDLの 分 泌 に 利 用 され ず, 分 泌 の ス テ ップ に は 新 た なPC合 成 が 要 求 され る可 能 性 を示 唆 した^<117)>。事 実, こ の肝 細 胞 の 培 地 中 に コ リン, メ チ オ ニ ンあ る い は リ ゾPCを 添 加 し, PC 合 成 を高 め る条 件 に戻 す と, 再 び 正常 なVLDLの 分 泌 が 回 復 した^<118)>。こ の とき, エ タ ノー ル ア ミン, モ ノ メチ ルエ タ ノ ール ア ミン あ る い は ジ メ チ ル エ タ ノー ル ア ミン
48 蛋 白 質 核 酸 酵 素 Vol.35 No.6 (1990) で は効 果 が な か った 事 実 か ら, 他 のPL種 で は置 き換 え る こ とが で きず, 新 た なPCの 合 成 がVLDLの 分 泌. に 不 可 欠 で あ る と判 断 され た^<119)>。ま た, PEMT反 応 で PEか ら合 成 され るPCはVLDL中 に あ ま り取 り込 ま れ な い 事 実^<104,105)>につ い てす で に 述 べ た が, 同 じPE で もPSの 脱 炭 酸 に よ り生 じたPE由 来 のPCは 非 常 に 効 率 よ くVLDLに 取 り込 まれ る とい う結 果 も得 られ た^<120)>。これ ら の事 実 はVLDLの ア ッセ ン ブ リに寄 与 す るPCの 合 成 が, 他 の細 胞 構 築 (あ る い は修 復) に利 用 さ れ るPCの 合 成 とは別 の場 所 で, 別 の機 構 で行 なわ れ る可 能 性 を示 唆 して お り^<74,121∼123)>, 今 後 の よ り詳 細 な 実 験 的 証 明 が期 待 され る。 お わ りに 本 稿 ではPC (PE) 生 合成 とそ の調 節 機構 につ い て動 物 細 胞 で 得 られ た 知 見 のみ に 絞 っ て 解 説 し た 。 同様 の酵 素 系 を有 す る酵 母 で は, こ こに 述 べ た酵 素 の ほ とん どの構 造 遺 伝 子 が, お もに 欠 損 変 異 株 を利 用 し た 相補 性 テ ス トに よ りす で に 同 定 さ れ, 発現 調節 の 解 析 が な さ れ つ つ あ る。 これ らに 関 して は 最 近 の総 説^<125,126)> を参 照 い た だ きた い 。
文
献
(文献番号を太字に した ものは特に重要な文献であ ることを示す)1)
Kennedy, E. P.: in Phosphatidylcholine
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