Deoxyribonucleic acid of amylase-producing bacteria IV. : On the viscosity of aqueous solution of various preparations prepared from acetone-dried cells
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(2) ア ミ ラ ー ゼ 生 産 菌 の デ オ キ シ リ ボ 核 酸IV ア セ トン 乾 燥 菌 体 か ら 調 製 した 標 品 水 溶 液 の 粘 度 大 村浩 久 ・渡 辺 健 治 ・藤 嶋 信 政*. Deoxyribonucleic acid of amylase-producing bacteria On the viscosity of aqueous solution of various preparations prepared from acetone-dried cells H. Omura, 細 菌 か らDNAを. K. Watanabe. 調 製 す る方 法 に つ い て は い ろい ろ. IV.. and N. Fujishima 一 つ と して ,そ の 溶 液 は極 めて 高 い粘 性 を 示 し,従 つ. の 報告 が あ るが,菌 の種 類 や 性 質 に 応 じて最 も適 当 し. てDNase活. た手 段 が選 ばれ なけれ ば な らない.ア. 起 こ る粘 度 の 低 下 を追 及 す る方 法 が あ り,我 々 も4)一. もす で に報 告 した よ う に2)DNA含 生 薗 の 約0.2%程. 度 のDNA一. ぎ ず,こ れ に対 してRNA一 酵 母 と 同様 にRNAに. ミラ ー ゼ生 産 菌. 量 が極 めて 低 く,. 燐 が 含 ま れ てい るに 過. 燐 は そ の15倍. 性 の測 定 法 に 基質DNAの. つ の方 法 と して 利 用 して い る ので,今 回 は種 々の 方 法 で 祖 たDNA標. 品 につ い て そ の粘 度 を 試 験 検 討 した,. 程 度 に多 く,. 富 む もので あつ てDNA調整. 実 験 及 材. 料 と して は望 ま しい もの で は なか つ た.そ の ため 本 菌 に つ い て も最 も適 した方 法 を見 出す 必 要 が あ る ので,. 分解によつて. び 考 察. 粘 度 の測 定 Ostwald型. 粘 度 計 を用 いDNA溶. 液2mlに. ついて. ア セ トン乾 燥 菌 体 を 用 い て多 くの 調 製 試験 を行 ない 種. 30℃ で 測 定 した.近 似 的 に水 に 対 す る相 対 粘 度nrel=. 々の 粗 標 品 を得 た.こ. t/tt(t:DNA溶. 液 の 流 下 時 間,秒;t':同. 合,問 題 は最 初 の 抽 出操 作 に あつ て リゾ チ ー ム処 理 な. 流 下 時 間,秒)と. して 求 め,ま た 比 較 の た め に還 元 粘. い し フェ ノ ー ル抽 出が一 応 利 用 出来 る こと を 認 め た.3). 度 ηsp/c=ηrθ1‑1/cも 算 出 した.こ こでcは100m1中. しか し一般 に細 菌 の 核 酸 は調 製 に際 し蛋 白質 や細 胞 壁. の溶 質 の9数 で あつ て,粘 性 は必 ず し もDNAだ. の成 分 を主 とす る多糖 類 等 と は離 れ に くい と 云 われ て. 基 くもの で は ない と思 わ れ る ので 標 品 の純 度 を 考 慮 す. お り,ア. る こ とな く標 品全 体 の量 で 計 算 した.. れ等 の 試 験 に 基 い て 本 菌 の 場. ミラー ゼ生 産 菌 の場 合 も例 外 で は な くて得 ら. れ た核 酸 の 純度 は甚 し く低 か つ た,た だ 蛋 白質 は ク ロ. DNA,RNA及. 容 の水 の. けに. び 燐 の測 定. ロ ホ ル ム処 理 を 回数 多 く反 復 して初 めて ゲ ル を全 く生. 前 報2)記 載 の よ うに それ ぞ れ シ ステ イ ンー硫 酸 反応,. じな くな る程 度 に除 か れ るが,こ の状 態 で も尚 か な り. オ ル シ ンー塩 酸反 応 及 び 江藤 氏 の 方 法1)を 用 い て 定 量. の蛋 白が 核酸 成 分 中 に残 存 し,ほ ぼ完 全 に 除 か れ る牛. した.. 脾 臓 等 の場 合 と異 なつ て い る.し か し,こ こでDNA 区分 を ア ル コー ル で 沈澱 した 後,10%CaC12に. 溶か. しこれ に0.3容 ア ル コー ルを 加 え て 再 び 沈 澱 させ る. DNA標. 品. 前eq2・3)に述 べ た種 々の 標 品 を使 用 した が,そ に標 品IV‑6aに. の外. つ い て も測 定 した.こ れ は リゾチ ー. と,こ れ まで 堅 く結 合 して い た 蛋 白 は濃 食 塩 溶 液 中 で. ム法 によ る もので あつ て比 較 的 に弱 い 酵 素 で長 時 間 作. 解 離 され るよ うに な る ので,重 ね て ク ロ ロ ホル ム処理. 用 させ た 後,遠 沈 沈 降 物 か ら抽 出調 製 した.す なわ ち. を 数回 行 な う こ とに よつ て 完 全 に 除 くこ とが 出来 るよ. 予 め乳 鉢 で 磨 砕 した 細 菌 乾 燥 粉末5gを400mlの. うに な つ た.こ の よ うに して もDNA標. 0.05M燐. 品 に蛋 白 以 外. の 多 くの不 純 物 が 含 まれ る のを 免 れ な い こ と はす で に. 酸 緩 衝 液(pH7.2)‑O.14MNaCl‑O.01Mク. ェ ン酸 ソー ダ溶 液 に懸 濁 し,こ れ に凍 結 乾 燥 した卵 白. 報 告 した よ うに,そ れ 等 の収 量,純 度,吸 収 スペ ク ト. リゾ チ ー ム100mgを. ル,吸 光 度等 の値 か ら明 らか で あ る.DNAの. た 後8000r.P.m・. 特性の. MNaC1で2回 *現 勤 務 先:徳 山酸 素 工 業 株 式会 社. 加 え30℃. に1晩振盪. 作用 させ. で20分 間 遠 心分 離 した.沈 澱 を0.14 洗 溝 した後2MNaCI(0.01Mク. ン酸 ソー ダ含 有)300m1で1晩. エ. 冷 蔵 抽 出,8000r・P・m..
(3) Table. 1.. Preparation. IV-6a.. * Figures were expressed by the amounts of nucleic acids corresponding intencity developed by Cysteine-H2SO4 or Orcine-HC1 reaction. Table 2.. P : Powder. で30分. Viscosity. of 0.05 % aq. solution. 間遠 心 分 離 した 抽 出上 清 か ら常 法 に 従 い2倍 溶 か しク ロ. ロホ ル ム で除 蛋 白後 ア ル コー ルで 沈 澱,最 後 にア ル コ ー ル及 び エ ー テ ルで脱 水乾 燥 し24 .5mgの. 白色 粉 末 と. して得 た.こ の一 般 性 質 は 第1表 に示 す通 りで あ る. 各種 標 品 水 溶 液 の粘 度. よ りも,こ れ に 磨 砕操 作 を 組 合 せ て 調製 したIII‑2a がDNA純. 度 は 低 い に もかか わ らず 著 し く粘 度 が 高 か. つ た.こ れ らの こ とか ら磨 砕 操 作 が この 高粘 性 不 純 物 の夾雑 混入 を促 す 傾 向 が あ る よ うに思 われ る.ま た リ ゾ チ ー ム法 の場 合,長 時 間酵 素 を 作 用 させ た完 全 な溶 菌 液 か ら調 製 した標 品IV‑3aの. 品 につ い て そ の粘 度 を0.05%水. 測 定 し,第2表. preparations.. ; F : Fiber. 容 ア ル コー ルで 沈 澱 し,再 び2MNaCiに. 各 種DNA標. of various. to the color. 溶液で. に標 品 の純 度 と と もに示 した 。. 糸 状 標 品 が 必 ず しもDNA含. 量 の 高 い もの で あ る と. 粘度 は甚 だ 高 く,こ. れ に対 して ご く短時 間酵 素 処 理 して得 た プ ロ トプ ラス トか ら抽 出分 離 した 標 品IV‑4aの. 粘 度 は低 か つ た.. さ らに酵 素 活性 の弱 い 状 態 で長 時 間作 用 させ て 調製 し. は限 らない こ とはす で に述 べ た が,粘 度 に 於 て も同様. た標 品IV‑6aは. で あ る こ とが 第2表 か ら観 察 され た.す な わ ち粉 末 標. 白質 を 含 ま な い こ と及 び上 述 の磨 砕 効 果 を あ わ せ考 え. 品1‑1a,1‑2a,IV‑6a等. が 比 較 的 に高 い 粘 度 を示 す の. に反 し,糸 状 標 品III‑1aやIV‑4aが. 著 し く低 い 粘 性. を持 つ こ とか ら も明 らか で あ る.も ち ろん 糸状 標 品 で もIIF2a及. びIV‑3aの. 粘 度 は高 く粉 末標 品IV‑3b. この 中 間 で あつ て,こ. れ ら標 品 が蛋. る と,少 な くと も この 粘性 の高 い夾雑 物 の一 部 は細 胞 壁 の 構成 成 分 に 由来す る もの と思 わ れ る. 粘 度 と濃 度 との 関係 次 に溶 液 を 稀 釈 した場 合 の粘 度 の 低下 を測 定 した.. の粘 度 は低 く,一 般 に糸 状,粉 末 状 等標 品 の状 態 と粘. 第3表 は代 表 的 な 標 品 に つ い て の 測 定値 で あつ て,. 度 との 間 に は共 通 した 関係 は認 め られ な い.. 0.1%DNA水. ま たDNAの. 溶 液 を 原液 と し水 で 逐 次2倍 宛稀 釈 し. 含量 の 高 い もの が一 般 に高 い 粘 性 を示. な が ら求 めた 相 対 粘度 な らび に還 元 粘度 で あ る.稀 釈. す 傾 向 が 認 め られ るが,場 合 に よつ て は必 ず し もそ れ. に よ つて 相 対 粘 度 が 減 少す るの は 当 然 で あ るが,こ れ. ば か りと は限 らない こ とが1‑1aとIII‑la,或 とIII‑2aな. い しIV‑3aとIV‑3bと. はIII‑la. の比 較 等 か ら認. らの 標 品 に於 て は溶 質 墨 当 りの比 粘 度 を示 す 還 元 粘度 も同様 に低 下 した 。溶 液 が 稀 薄 に な れ ば 粘度 も ほぼ 直. め られ る.こ の こと は調 製 に当 つ て核 酸 と同 じ分 劃 に. 線 的 に誠 少 し第1図 に示 す よ うに8倍. 沈 澱す る不 純 物 もま た高 い 粘 性 を示 す こ とを推 定 させ. 釈 か ら以下 で は 直線 的 降下 が見 られ た.た だ この 場 合. る.しか も菌 体 を予 め 乳 鉢 で磨 砕 して 調 製 した1‑la及. 理 論 的 に は これ らの直 線 は相 対 粘 度1.0に 集 中す るは. び1‑2aが. ずで あ るが,実 測値 は1.0よ. 粉 末 標 品 に もか か わ らず 比 較 的 に粘 度 が高. く,ま た と くに フェ ノ ー ル処 理 だ けで 得 た標 品III‑1a. ない し16倍. 稀. り若 干 低 い値 に指 向す る. 傾 向を 示 した.も ち ろん この原 因,意 義等 は 明 らか で.
(4) Table. Original. solution:. Decrease. of. viscosity. I mg DNA preparation/ml. Fig.. な い が,さ. 3.. 1.. Relative. viscosities. らに 少 な くと も測 定 した 諸 標 品で は比 較 的. に近 い点(0.94,0・98)に それ ぞ れ 集 中 す る2つ の グ ル ー プに分 け られ るよ うで あつ た . 食塩の影響 一 般 に蛋 白質 核 酸 等 高分 子 物 質 の 液溶 が示 す 高 い粘. by. dilution.. H2O. of. preparations.. に調 製 したDNA標. 品 を使 用 す る場 合 に は稀NaC1溶. 液 等 の 塩類 溶 液 に溶 か し脱 イ オ ン水 に 溶 かす と変 性 す る と云 われ て い る.ア ミラー ゼ生 産 菌 か ら種 々の 方 法 で 調 製 したDNA標. 品 に 於 て も同 様 で あ つ て,そ の 純. 度 の如 何 に かか わ らず水 溶 液 の粘 度 はNaCl添. 度 が 電解 質 を加 え る こと に よつ て低 下す る こ と は知 ら. りか な り低 下 した.第4表. れ て い る.ま たDNAの. をOstwald粘. 調 製 に 際 して は,こ れ ま で も. しば しば述 べ た よ うにNaCi溶. 液 を 使用 す るが,さ. ら. NaCl溶. は0.05%DNA水. 度 計 の 中 で1mlの. 加によ 溶 液1ml. 水 ま た は0.02M. 液 と 混 合 した 後 そ の 粘 度 を 測定 した もの で.
(5) Table 4. Effect of aq. solutions. of of. NaCI on the viscosity DNA preparations.. あ る. こ こで 例 え ば標 品III‑2aとIV‑2aと 合,前 者 は後 者 よ りもDNA含. を比 較 す る場. 量 は低 い に もか か わ ら. ず,そ の 水溶 液 の 粘 度 は高 く前 述 の よ うに 高粘 性 不 純 物 の存 在 を 明 らか に 示す が,さ. らにNaCl添. 加 による. 粘 度 の 減 少 も甚 し く,従 つ て この夾雑 物 もまたNaCl 存 在下 で は粘 度 の 低下 を来 す もの と推 定 され る.類 似 の こ とは 同 じDNA純 これ らとIV‑3aと またNaC1の. 度 の1‑2aとIV‑6aな. い しは. の 比 較 検 討 か らも認 め られ る.. 濃 度 を 低 くす れ ば勿 論 粘度 の低 下 度 を. 減ず る こ とは相 対 粘 度 及 び還 元 粘 度 を 示 した第5表 か ら明 らか で あ る.実 験 は 第4表 に 準 じて 行 なつ た. NaCl添. 加 の 影響 はDNA溶. らず 認 め られ10‑4Mな 低 下 が 起 つ た.さ. 液 の粘 度 の 大 小 に か か わ. い し10一5Mで. らに10‑3M付. も 若干 の粘 度. 近 まで は影 響 はか な. り強 い よ うで あ り,ま た 粘度 の高 い もの ほ ど比 較 的 に 影 響 を 受 け 易 い よ うに 思 わ れ る. そ の 他 の無 機 塩 類 の影 響 こ のよ うな 粘度 の低 下 はNaClだ. け に限 る もの で な. い こ と は蛋白質 等 と 同様 で あつ て,他 の塩 類 によ つ て も観 察 され る こ とは第6表 に 明 らか で あ る.. I-la : 0.1oo DNA 1 ml+0.02 M NaC1 (H20) 1 ml II-la : 0.55 % DNA 1 ml+0.02 M NaC1 (H20) 1 ml Others : 0.05 % DNA 1 ml+0.02 M NaC1 (H2O) 1 ml Table. 5.. Effect. of concentration. I-la : 0.1 °o DNA 1 ml + NaC1 1 ml Others : 0.05 % DNA 1 ml +NaC1 1 ml. す なわ ちKC1やNH4Cl,或 DNAとRNAと of NaC1 on the. は 核酸の 調製 に 於て. の大 別 に用 い るCaC12,も viscosity.. し くは.
(6) Table. 0.5% DNA aq. solution Table 7.. Table. * Atkins-Pantin 0.5 % DNA aq. solution DNaSeの. 6.. Effect. 1 ml + Salt solution Effect of concentration. 8.. Effect. of. some. salts. on the. viscosity.. 1 ml of MgSO4 on the viscosity.. buffers. on. the. viscosity.. 1 ml + 0.2 M Buffer 1 ml. 賦 活 剤 と して 活性 測定 の場 合,常. れ るMgSO4等. of some. に添 加 さ. い ずれ の塩 に よ つ て も粘 度 の低 下 が惹. した. そ の結 果,第7表. に示 す よ うに溶 液 の粘 度 は10‑2M. き起 こ され た.そ の 低F度 は塩 類 の種 類 に よつ て も多. で 最 も低 くそれ よ り以 下 で は再 び影 響 は 緩 和 され て 粘. 少 の 相 違 は あ るが,む. 度 の 低 下度 は少 くな る.こ の傾 向はCaCl2で. え ばKCIやNH4Clで. し ろ塩 の 濃度 が 強 く影 響 し,例 はNaClと. 同 様 に 濃度 の減 少. に よつ て 粘 度 の低 下 度 は 緩 和 され た.し か し2価 イ オ ンを 生 ず るCaC12やMgSO4の あつ て10一IMと10‑2Mと 場 合 には10‑2Mの. 場合 には 若 干 問題 が で は殆 ど差 はな く,極 端 な. 場 合 の 方 が10一1Mの. 場 合 よ りも却. この こ と はDNase賦. 塩 類 に よ る粘 度 の低 下 作 用 は ま た単 独 の 塩 類 だ けで な く緩 衝 液 等 で も認 め られ る. 例 え ば第8表 に 示 す よ う に本 菌 のDNase測 ら利 用 す るAtkins・Pantin緩 KC1)を. つ て 粘 度 が 低 か つ た. 活 剤 で あ るMgSO4の. に と くに注 意 しな け れ ば な らな い.す. 場合. な わ ち粘 度 法. に よ り 活 性 を 測 定 す るに 際 しMgSO4の. 添加だけで. も同 様. に認 め られ た.. pHの. 定 に専. 衝 液(H3BO3‑NaCO3・. 始 め トリス,燐 酸 塩,醋酸 塩 等 の 各緩 衝 液 も 如 何 に か か わ らず 粘 度 の 低 下 を惹 起 した.さ. に極 端 な場 合 と してHCIやNaOH中. ら. で も同様 の傾. 向 が見 られ た.. も基 質 溶 液 の 粘 度 が低下 す るが,し か もそ の 添加 量 も特 異 的 な 影 響 を 及 ぼす もの と 推 定 させ る.従 つ て MgSO4に. 対 し と くに 顕著 な挙 動 を 示 した標 品IV‑4a. に つ い て さ ら に 詳 細 にMgSO4濃. 度 の 影響 を検 討. 終 りに貴 重 な 菌株 を分 与 され 使 用 の許 可 を賜 つ た大 阪市 立 大 学 福 本寿 一 郎教授 に 心 か ら御 礼 申上 げ ます..
(7) 総. 場 合 よ りは粘 度 は低下 した.ま たNaClの. 括. M付. ア ミ ラー ゼ生 産 菌 の乾 燥 菌 体 か ら種 々 の方 法 で 調製 したDNA粗. 標 品 水 溶 液 の粘 度 につ い て検 討 し若 干 の. 知見 を得 た.. 濃 度約10‑3. 近 まで は 影 響 が 強 い こ と,高 粘 性 標 品 ほ ど 感 受. 性 の 高 い こと が認 め られ た.さ. らに この場 合,高 粘 性. を 示 す一 原 因 とみ られ る夾雑 物 もNaC1溶. 液 中で は 粘. 度 を 減少 す る もの と推 定 され た.. 糸 状 に得 られ たDNA標. 品 が 必 ず し も高 い 粘 性 を示. そ の他 の電 解 質,KC1,NH4C1,CaCI2,MgSO4等. す と は限 らず,一 般 に糸 状,粉 末状 等 標 品 の 状態 と粘. で も多 少 の 相 違 は あ るが 大 体 類 似 の 傾 向 が 認 あ られ. 度 と の 間 に は共 通 した 関係 は認 め られ な かつ た.ま た. た.し か しMgSO4或. 粘 性 発 現 がDNA含. は 必 ず しもそ の 濃 度 に比 例 せ ず10‑2Mで. 量 だ け に直 接 比 例す る もの で は な. はCaC12の. 場 合,粘 度 低 下 度 そ の影 響 が. い こ と,前 処 理 と して乳 鉢 磨 砕操 作 ま た は長 時 間 リゾ. 最 も強 かつ た.こ の よ うな電 解 質 によ る粘 度 低 下 作用. チ ー ム処 理 を行 なつ て 得 た 標 品 の粘 度 が高 い こ とな ど. は 単 独 の塩 類 だ け で な く種 々の 緩 衝 液 やHCI,NaOH. か ら夾雑 物 の一 部 も粘 性 発 現 に 関与 して い る もの と推. に よ つて も惹 起 され た.. 定 した. 水 溶 液 を稀 釈 す る とそ の相 対 粘 度 は低 濃 度 に於 て直 線 的 に減 少 す るが,無 限 稀 釈外 挿 値 は1.0に 集 中せ ず それ よ り若 干低 い値 に指 向 す る傾 向を 示 した.ま た少 な くと も供 試 標 品で は近 接 した点 にそ れ ぞ れ集 中す る 2群 に分 け られ た. DNA標. 品 をNaClの. よ うな 電解 質 溶 液 に 溶 か す. と,そ の純 度 に 関係 な くNaCl濃. 度 に応 じて水 溶 液 の. 文. 献. 1)江. 藤 守総,1954.九. 2)大. 村 浩 久 ・渡 辺 健 治 ・徳 永 純一,1961.九. 大 農学 芸 誌,14:543. 大農. 学 芸 誌,18:381. 3)大 村 浩 久 ・渡 辺 健 治,1961.九 大 農 学 芸 誌,18: 399. 4)渡. 辺健 治,1959.九. 大 農 学 芸 誌,17:269.. Summary Viscosities of aqueous solutions of DNA preparations which had been isolated from acetonedried cells of amylase-producing bactera by several procedures were estimated. In general, viscosity had no relation with the fibrous appearance or powdery one of preparations. The high-DNA preparation made a solution of much higher viscosity than that from preparation of low-DNA content. However, in some cases, the viscosity of the later was higher than that of the former. This observation suggested that certain contaminants in preparation also contributed to the viscosity. Asusual, viscosity was reduced more or less by adding NaCI as well as by dilution. The effect of salt was maintained even in 10`4 or 10-5M of final concentration, regardless of the viscosity of aqueous solution of DNA preparation. The rate of decrease of viscosity by NaCI tends to be much higher in the solution of higher viscosity than in that of low viscosity. The viscosity due to the contaminants cited above was presumed to be reduced by NaCl. Similar reduction of viscosity was also observed by KC1, NH4C1, CaC12, or MgSO4. Of course the viscosity was reduced usually much effectively in higher concentration of salts. However, in the case of MgSO4 and CaC12, the viscosity was the lowest in 10-2M of final concentration. Some buffers, such as Tris, acetate, phosphate, A-T or even HCI and NaOH, also had the same ability to reduce the viscosity. These experiments must be called especially when we use the preparation obtained for some object, for example the substrate of the viscosimetric estimation of DNase activity..
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