Studies on Marine Bacteria Producing Lytic Enzymes−V川 Release of Lytic Enzyme from BacterialC釧s

Btl】1．Fac．Fishり Mie Univ．  

No．10：25…32   0ctol〕erl，1983  

Studies on Marine Bacteria Producing Lytic Enzymes−V川   Release of Lytic Enzyme from BacterialC釧s  

Isao SuGAHA！ミA，Koichiro HAYASHI，Toshio KIMUlモA  

and ChikaraJ‡NNO  

Faculty of f「isheries，Mie Univel・Sit〉′  

The release oflytic enzyme was studiedl）y WaShing and suspending the cells   in solutions coll仁aininglnOrgaれic salts or orgallic anio11S・  

rr‡1eユ・atio oflytic enzy王11el・elease（！illtO Ctlltul■e‖uids仁O tlle tOtallytic enzyI11e   I）1・OdしICed dul・i11g tlle gl・OWtIlOf stl■ain V 37lla（1a ten〔lency toincllea＄e Wit‡1   progression of抽e cttlture age・   

Inorganic sal拍and ol−ganic anionsしISedin this sとu（l〉′ eXhibited no s唱nificant   effect on t】1e release oflytic enzyI】1e frolⅥStltain V37cells．  

Mol・e tllan70％ of tllelytic enzynlelibel・ate（lseeme（lとOl）einstzlntaneOuSly  

†・elease（1fl−Om Strain V 37 ce11s．  

Key word8：ly仁；c enzさ′me，Illarine bacteria，enZ〉，nle release   

111a PreVious paper（SuGAモー王ARAβgβg．1981），t王1e effect oriIlOl・ganic salts oIlt】le  

release oflytic enzyme wasinvestigated usll嗜bど．Cteriaicells of strain V37grownfor  

60r8hoursin polypeptone・yeaSt eXtraCt me（lium cont2ining NaCl（0．5M）．Inorganic   Saits（0．5M）used werellOt efYreCtive for tlleiibel・atiollOflytic e】1Zyille．  

The pl・eSent PaPer deals with the effect cf differe11t COnCentrations orinorganic  

s2．1ts alld or卵11ic aIlio11S On tilelil）el●atio】10flytic e11Zyllle fI▲0ⅠⅥStrai11V37ce王is■  

ⅡIetl10ds   

Lytic activity was determined as〔1escribedI）rCViousiy（SuGAHARA eiai．1976，1978．  

1979．1980，】98i，1982）．  

Cultllre Of stmin V37producinglytic en2：yme  

Culturc oE strain V 37 capable ol producing lytic cnzyme was carried out as 

Release oflytic enzyme from strain V37cells  

Lytic enzyme released fl・Om Strain V37ceils was assayed as described previously  

（SuGA王1ARAどょ（‡g．1981）．   

26  

Lytic activity associated with strilin V37ce11s  

Strain V37cells，harvested by centriEugation，Were SuSPendedin O．05M Tris・HCl   buffer（pH7．0），andsonicaま1y treated for4minutesatOOCwithasonicator（Ultrasonics   W一揮う75）． After removing the cell（1ebris by centrifugation，lytic activity of the   Supernatant WaS deter111ined■  

Totallytic activity  

Totallytic activity was determined by addinglytic activity associatcd with the   Cells tolytic activity of the culture supernatant perlmlof cuiture fluidsL  

Results   

ExtrilCellular production oflytic e】lZyme by strain V37  

Fig．1shows the ratio oflytic activity releasedinto culture fluids to the totallytic  

㌘ヂポ。  

。  

●′●●●  

●  ■■＿  

lU空巾u﹂むdコS巴コl一⊃0−○   合字票蒜0事ヱ   8    6    4 0   0    0  

● ●＿●● r♪．  

●  

●  

︒  ︒︒ ○が  

︒q  

●  

2 000 0  1  

言霊d∈心dコの巴コlち0竃ゝだA芯0心じ芯ゝ﹂  

￣￣￣ー− 

′′  

。 ■  

−＝‥‥・・P。…‥‥  ア 

∩︶    0   0   0  

8凸P42  

0．5  1．0  1．5  

Growth（OD570）of＄trainV37cel］s  

Fig．1．Extracellular pl・OdtlCtion oflytic enzyme during the growth of strain V37，   

Studies on Marine】うac仁eria ProdもよCing Lytic E11ZylneS−ⅤⅠⅠⅠ  

27  

growtilpllaSe Of stl・ai11V37，and to reac王1a】ⅥaXiilltlTllValtle at tllellliddle of tlle  

exponentialgrowth phase・This factindicates thatlyticenzyme producedin the cells  

Time eollrSe Of release ofly電ie eれZyme   

In the pl・eVious paper（SuGA！1ARA et al．1981），it was fotlnd that strain V 37ccils  

l10ur at300C．  

As shownin Fig・2，1ytic enzyme released from the cells grown fcr60r8．5hoLlrS   exllibited a nlaXilllumlevelat20欄30 miIluteS illCul）atio11． Tllerefore，for tlle release  

experimentin this study，incubation was carried out at 30 0C for 30 minutes with  

SIla‡くing，tlnless otllerWise noted．  

However，itis noticeable that the amount oflytic enzyme releascd at O mintlte  

WaS al）Out70−80％of theiⅥaXi‡malenzylⅥelibel■ation．  

Effeet ofinorganie salts eoIleentratioれ0れt‡1e rel紺Se Oflytie enzyme  

ⅣaCl：As show11in Fig．3，】10additio】1alefFect of NaCt（0．ト0．7M）was ol）SerVed   On the release oflytic enzyme from strain V37 cells grownin polypeptone・yeaSt   extract medium containing NaCl（0．うM）for6，8．5and23hours．respectively．   

Sodium chloride was not oniy effective for the release of materialsabsorbingat280  

Ce‖s grown for8．5hr  

Growth OD5700．817  

念茎10d  

∝  

0．8  

010 2030405060 010 2030405060  

Reaction time（min）  

Fig．2．Tinle COし1rSe Of release oflytic e11ZyIⅥe fI・0ⅠⅥ紬・ain V37celisgrow11   in polype郎One・yeaSt eX亡ract meditlm COntaining NaCl（0．うM）．  

CS：1さ′tic activity of cul仁しIre SupeI・natant，  

ⅥJ：1ytic activitylil）el・ate（lfroIⅥCeils（1ul・ing wasきIh針  

Ⅰモ：1ytic activityl◆elease（lrrom cells duringl11Cubation．   

28  

Cells grown for 23 hr  GrowthOD570   

1．296  

8   6   4   2  ︵U O O O  舎写票蒜0苧ご  

0 0．10．20．30．40．50．60．7 0  

nO    6  

0    0  忠言票蒜0事ヱ   4    2  0    0  

NaCT concentration（M）  

Fig，3、Effect of NaCIcoり．Centration on tllel・elease ofけticeIIZyIllefl・Ol11S仁l・ain Vう7   Cells growninI）0け】）e王）tOne義yeaSt eXtraCt111e（liu！ⅥCOntai11ing NaCl（0．5M）．  

11111froITltlle Cells grow！1for6a】1d8．5壬10urS，reS蔓つeCtiveiy，l）も1t eXllibited ani1111ibitoI・y  

e汀ect on tllat fronlt王Ie Cells growrlfor23110tlrS．1、Ile alⅥOunt Of28011111al〕SOrbi‡1g−  

materials released行om strain V37cells grown fol・8．うhours was more abundant than   tllat gl・OWIlfor601・23王10urS．TIlis facti‡1dicates tllat tllelevelof eIIZylTleまiberation   WaS110t always proportionalto tlle arnOunt Cf materials absorbing at280nm・  

LiCl，CaCl2，Ⅹ2SO4，迂3BO3：As shownin Fig．4，theliberation oflytic enzyme  

LiCl（0．11）．7M），CaCl望（0．ト0．7 M），K2SO′l（0．ト0．う M）and H浦0…l（0．l¶0．5 M），  

respectively．  

MgCl2，MgSO4，KCl，N乱H2PO4：It ca11l）e Seellin Fig．5tllat MgC12 0r KCI  

Stil11ulated tlle relea．se oflytic ellZyme行or11Strain V37cells growllfor6．501・7110urS．   

Studies o！1M鋸・ine Bac拍ria Pl・0（lしICingl．ytic EnzynleS−ⅤⅠⅠⅠ  

CeLIs grown for6hr   GrowthOD5700・363  

4  0    0  

念零票蒜0亭う  

∝   茅   の  

50∞N山  0      0  

1J  

2  0  

0 0．10．20，8 0A O．5  

K2SO4  

concentration（M）  

Ce s grown for6．5hr   

Growth OD,,, 0.319 

0 0．10．2 0．30．4 0．5  

H3B03  

Ce‖s grown for6hr   Growth ODs70 0.306 

4    2  0    0  

舎三石吋0芯ゝJ   50のN山  0  

0 0．10．20．3 0．4 0．50．6 0．7    LiCIconcentration（M）  

0 0．10．20．30A O．5 0．80．ア  

Fig・4・Effec亡Ofinorga王−ic salをS（ⅠノiCl，CaCl2，1く2SO−l，H藁BO3）on tlle王・eleaseoflyticenzyme   fl◆0111StrainV37cellsgrownini）01yI）eま）拍ne・yeaSteXtraCいme（1iLl111COntai】1ingNaCl（0．うM）．  

Cells grown for7hr   Growth OD5700．339  

Ce】ls g「own fo「6hr  

G「owthOD5700・308  

4    2  00  

合写票蒜0芋ご  

0．5  

（⊃  

く0  

くV   

l山  

0 0．10．2 0．30．4  0  

NaH2POヰ   KCJconcentration（M）  

COnCentration（M）  

Cells grown for 8 hr  G「ow†hOD5700・266   0．4  

倉烹ち警曇う   

0．2  

MgC12COnCentration（M）MgSO，lCOnCentration（M）  

アig・5・E〃ect ofi・10柑Zlnic salts（MgCl慧，MgSO−hKCl〜NaH3POJ箋）on the releaseoflytic el−Zyme  

fromstraillV37cellsgrowninl）OlyI）ePとOne・さ′eaSteXtl・actnlediuIllCOntai11ingNaCl（0．うM），  

30  

Siight stimulative effect o［NaH2PO．10r MgSO．．was aiso observed on the ＝beration of  

Remarlくableiiberation of materials absorbing at 280 nm was ol〕SerVed by the   a（1dition of KClor NaH2PO．l．  

Effett of orgaIlic乱れioれS On the release oflytie enヱyme   

AssllOWllillFig・6，Wllen tlle Cells were suspendedin every organic acid solution   usedin this studv at the concentrations of O．Ol，0．05 and O．10 M，reSPeCtively，the  

controIwithout added organic acid．This means that organic acid was not effective   for tlle release orlytic ellZyllle．  

Tlleliberation ofIllaterials al）SOrl〕i】1g at280nm was fotlnd toillCreaSe CO11Sideral）1y  

by the addition of organic acid，SuCh as fumarate and maleate・  

Ce＝sgrown for6hr   GrowthOD5TOO．469  

0  00  念写票蒜0筈ヱ   4    2  

0・010・050・100・010・OSO・10（M）   

Acetate Pyruvate   Ce［ls grown for5hr   Growth OD5700．301  

GeIl＄grOWnfor5hr GrowthOD5700・288  

4  2   0  0   0  

舎芝−0再ぷ︸h﹂   屈相関捌10 ゝ≡；0■0王  ∝  き  の0  

0・010・050・100、010・050・10（M）   

Malate Fumarate    Cells grown for 5 hr  GrowthOD57001334  

0・010・050・100‥？1？・050・10山）   

Maleate Ma】onate   

Cel］s grown for5hr   GrowthOD5ア00・283  

＞ 

0．5  

く）  

の  

N  Lリ   

0   

0．2  

0（扁  

1ytic enzynleか甘m StraiIlV37cells  

contain毒ng NaCl（0．うM）・  

0・010・050・100・010・050・10（M）O   

Citrate Succinate  

Fig．6，Effect of organic anions on旺e release of  

gl・OWnin polypel）tOne・yeaSt eXtraCヒmediu！Ⅵ  

Stu（王ies onかねrine8actel・iaproducing Lytic EnzyIlleS−Ⅴ王‡Ⅰ   31  

Time・iれdependentliberation oflytic enzyme  

Ass！−OWni−−Fig・2，aboもIt70−80％of111aXilⅥaleIIZyInel主beratio王1WaSSPOntaneOuSly   reieased Erom strain V 37cells grown for6and 8 hotlrS，l・eSPeCtively．CoLES and  

GROSS（1967b）王一ePOrted t】1at‡）art Of surface located pe11icillinase o上敷坤わ血路m〟鵡川‰  

WaSliberatedinstantaneously byinorganic al−ions，SuCh as phosphate and arsenate．  

CoLES aIld GlモOSS（1967a）aiso〔lemonstrated that citrate was more effective than  

dicarl）0Ⅹylicor monocarboxylicacidsfor the time・indcpendentliberationofpeniciilinase  

rI■Otl15■／ 小／いん川【1〟＝川′・川∫．   

Therefore，anattemPtWaSmadetodemorlStrateWhethertime−independentliberation   Oflytic enzyme from the ceils grown for23−24hours can be observed using O．4M  

NaH2PO′蔓a−−d O・1M sodiし11−1Citl・ate SOlutions・As sllOWlliIIFig．7，a壬〕Out8うー柑0％of  

念モ蔓ち僧nまゎ﹂  

Cells grown for23hr   Grow川OD5TOl．203   0，8  

空軍ギ芯蒜   4 0  2  0  

0ゝ﹂  

0 10 20 30 40 50 60 0 60  

0・2MN甜2PO4用・1MSodium￠itrate c釧sgrownfor28・5hr  

Cells9rOWn for23hr  

GrowthOD5701・12ア  

1．0  

6  

W   4  

卜       2  

0 10 20 30 40 50 60 0 60 010 20 30 40 50 60 0 60  

Reaction time（min）   Reaction time（min）  

O14M NaH2PO4   011M Sodium citrate  

Fig−7・7、ime・in（1ependentliberationoFlytice11ZymefromstrainV37cells grownin  

】）01yI）ePね11e・yeaSt eXtraCt mediuln COntaining NaCl（0．うM）．   

う2   Isao Suc；A王IARA，Koichiro HAYA引一！Ⅰ，Toshi（）K川リーミA an（lChikar；lJ‡NポO   

maximalenzymeliberation wasimmediatelyl・eleasedfrom strain V37cells grown ror   23−24hours，When the ceiis were washed andincul）ated with O．4M NaH慧PO⊥）and O：l  

M sodium citrate soiutions．Spontaneousliberation oflytic enzyme from the eells  

grown for2うhours also s壬−OWed pIi虚pe11dence・  

Discussion   

MALVEAUX and SAN CLEMENTE（1967）reportcd that the amount oflccsely・l）Cund   acid pilOSp壬1ataSe eltlted fromぷ哩如血抑制用灯蝕 de王：ended on p‡ia11dionic strengtll・  

Accordingto them，elution of thc enzyme was maximally efrected withi．OM KCl（pH   7．5）fro汀Ilog・Phasc cclls，but stationary−Phasc cells required twice the concentration   of KCl．′r王1eyi11Ferre〔1t王1aもpart of tlle aCid pi−OSP王1ataSe O仁駄ゆ触玩w蝕＝紬 g ∫is  

associated witllt王1e Cells tllrOtlgllelectrostaticintel◆aCtiollS・   

Howevel・，PoLLOCK（1961）s咽geSte（lt王1at‡〕e】1icillinase of月∠ヱ〔・〆／g〜′∫ぶ‡∠ゐ′∫′∫∫WaSI10t  

In thisstudy，the amount oflyticenzyll二e released from strain V37cellsscarcely  

illCreaSed by tlleadditionofi】10柑anicsaltsat tlle COユーCentratiol−S Of O・ト0・7M（Figs▲  

3wう）．   

O11thc other hand，CoLl；S and GROSS（1967a）suggested thatlGW COnCeI血●ations  

（0．01，0．05M）of organic acidswere effective fo王・t圭一eliberatio110f penicil血ase≡from   助坤わ血抑肌ば飢昭購．However，Or卵nicacids did】−Ot eXl−il）it a stil−Ⅷ1ative effect on  

tlle releaseoflytic enzyme fm11ュStrain V37ce11s（Fig・6）・More tha−170％of tlle   lit）eratedlyticenzy汀把WaSi11StaIltaneOuSly released frol−−Strain V37（Figs・2a！1d7）・   

TllelⅥeC王IanislⅥOf rele∂、Se Oflytic e11ZylⅥe frolⅥStraillVう7cellsisIlOt yet Clear・  

Further studies on the release oflytic enzyme are necessary・  

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−−岬 

1／‡Ⅰ．AtltOlyticactivityofbactel・iacaI）ableof f）rOdLICinglさ′tic enzyme・蹴〟り9：3ト37・