2 る 際 に は 有 効 で あ る が ， 立 体 的 な 構 造 体 を 被 覆 す る 場 合 に は 無 電 解 メ ッ キ 技 術 の 方 が 適 し て お り ， か つ 簡 便 な 手 法 で あ る ． し か し な が ら ， 無 電 解 メ ッ キ で は 厳 密 な 膜 厚 制 御 が 困 難 と い う 問 題 が あ る た め ， こ れ を 克 服 す る 手 段 と し て ， 膜 厚 を モ ニ タ リ ン グ し な が ら 無 電 解 メ ッ キ 処 理 を 行 う こ と が 有 効 で あ る と 考 え た ． 光 フ ァ イ バ ー 先 端 に 被 覆 さ れ る 金 属 ナ ノ 薄 膜 の 膜 厚 を モ ニ タ リ ン グ す る 手 法 と し て ， フ ァ イ バ ー 端 面 の 吸 光 度 を リ ア ル タ イ ム で 測 定 す る こ と を 検 討 し た ． 光 フ ァ イ バ ー の 端 面 か ら 458 nm の 波 長 の 光 を 入 射 し な が ら 無 電 解 メ ッ キ 処 理 を 行 う と ， フ ァ イ バ ー 先 端 の 金 属 ナ ノ 薄 膜 の 膜 厚 が 増 加 す る に 従 い ， フ ァ イ バ ー 端 面 を 透 過 す る 光 強 度 が 減 少 す る も の と 考 え ら れ る ．透 過 光 強 度 か ら 換 算 し た 吸 光 度 を 指 標 と す る こ と で ，nm レ ベ ル の 膜 厚 変 化 を モ ニ タ リ ン グ で き る も の と 期 待 さ れ る ． そ こ で ， 単 純 な 無 機 化 学 反 応 で あ る 銀 鏡 反 応 を モ デ ル と し て ， 銀 ナ ノ 薄 膜 形 成 時 の 膜 厚 を モ ニ タ リ ン グ す る 指 標 と し て の 吸 光 度 の 測 定 に 着 手 し た ． 光 源 と 分 光 器 に 対 し て ， 被 め っ き 物 と な る 光 フ ァ イ バ ー を 一 直 線 上 に 配 置 で き る 装 置 を 自 作 し た(Fig. 1)． 装 置 内 に 取 り 付 け た ト レ ン ス 試 薬 に 光 フ ァ イ バ ー の 先 端 を 浸 漬 さ せ る と ， 銀 鏡 反 応 の 進 行 と と も に 吸 光 度 が 増 加 し た (Fig. 2a)．銀 鏡 反 応 後 の 銀 ナ ノ 薄 膜 の 膜 厚 を 原 子 間 力 顕 微 鏡 (AFM) で 計 測 し ， そ の 膜 厚 に 対 し て 光 フ ァ イ バ ー を ト レ ン ス 試 薬 か ら 取 り 出 し た と き の 吸 光 度 を プ ロ ッ ト し た と こ ろ ， 比 例 関 係 が 成 立 す る こ と が 明 ら か と な っ た(Fig. 2b)． こ の こ と か ら ， 吸 光 度 を 指 標 と し て ， 銀 ナ ノ 薄 膜 の 膜 厚 変 化 を モ ニ タ リ ン グ で き る こ と を 実 証 で き た ． さ ら に ， 実 際 の 銀 ナ ノ 薄 膜 上 で の SPR 誘 起 を 確 認 す る た め ， 膜 厚 モ ニ タ リ ン グ に よ り 光 フ ァ イ バ ー に 対 し て 50 nm の 銀 薄 膜 を 被 覆 し ， 光 フ ァ イ バ ー SPR セ ン サ ー を 作 製 し た ． 作 製 し た 光 フ ァ イ バ ー SPR の 検 出 感 度 は ， 2205 nm / RIU で あ り ， 十 分 な 計 測 性 能 を 示 し て い た ．
3 第 二 章 無 電 解 Ni/Au メ ッ キ 技 術 に よ る 光 フ ァ イ バ ー SPR セ ン サ ー の 作 製 技 術 の 確 立 と バ イ オ セ ン シ ン グ へ の 応 用 前 章 で 示 し た よ う に ，銀 ナ ノ 薄 膜 上 で SPR を 誘 起 す る こ と は 可 能 で あ り ，試 作 し た SPR セ ン サ ー は 金 ナ ノ 薄 膜 よ り も 高 感 度 計 測 に 適 し て い る が ，酸 化 さ れ や す い た め 長 期 保 存 は 難 し い ． そ の た め 実 用 面 か ら ， 一 般 的 な SPR セ ン サ ー に は ガ ラ ス に 金 薄 膜 を 被 覆 さ せ た も の が 用 い ら れ て い る ． し か し な が ら ， 無 電 解 金 メ ッ キ 技 術 に よ り ， 光 フ ァ イ バ ー に 金 ナ ノ 薄 膜 を 被 覆 す る SPR セ ン サ ー の 作 製 に 成 功 し た 事 例 は 皆 無 で あ る ．そ こ で 本 章 で は ，無 電 解 Ni/Au メ ッ キ 技 術 に よ る 光 フ ァ イ バ ー SPR セ ン サ ー の 作 製 法 を 確 立 し た ． こ の メ ッ キ 反 応 は 銀 鏡 反 応 よ り も 複 雑 で あ り ， 具 体 的 な 工 程 は 以 下 の 通 り で あ る ．ま ず ，ガ ラ ス 製 の 光 フ ァ イ バ ー に 触 媒 と な る パ ラ ジ ウ ム を 吸 着 さ せ ， メ ッ キ 処 理 に よ り ガ ラ ス と の 密 着 性 に 優 れ た ニ ッ ケ ル を 被 覆 さ せ た ． そ の 後 ， イ オ ン 化 傾 向 の 差 を 利 用 し て ，ニ ッ ケ ル を 溶 出 さ せ る と と も に 金 を 被 覆 さ せ た（ 置 換 メ ッ キ ）． そ の 際 ， 厳 密 に 50 nm の 膜 厚 で 光 フ ァ イ バ ー に 金 ナ ノ 薄 膜 を 再 現 よ く 被 覆 す る た め に は ， ニ ッ ケ ル メ ッ キ お よ び 置 換 型 の 金 メ ッ キ 反 応 処 理 中 に お い て ， 膜 厚 変 化 を モ ニ タ リ ン グ す る 必 要 が あ る ． 単 純 な Ni メ ッ キ 反 応 で は ， 銀 鏡 反 応 と 同 様 に ， 光 フ ァ イ バ ー を メ ッ キ 浴 か ら 引 き 上 げ た と き の 吸 光 度 と ナ ノ 薄 膜 の 膜 厚 に は 比 例 関 係 が 成 立 し た ．一 方 ，ニ ッ ケ ル が す で に 被 覆 さ れ て い る 光 フ ァ イ バ ー を 用 い る Ni/Au 置 換 メ ッ キ 反 応 で は ， 吸 光 度 で 膜 厚 変 化 を 測 定 す る こ と が で き な い た め ， 膜 厚 モ ニ タ リ ン グ の 指 標 と し て 反 射 率 を 適 用 し た ． ニ ッ ケ ル と 金 の 反 射 率 が 異 な る た め ， メ ッ キ 反 応 の 進 行 と と も に 反 射 率 が 変 動 し た ． フ ァ イ バ ー 表 面 に ニ ッ ケ ル が 極 微 量 し か 残 存 し な く な っ た 時 点 で ， 反 応 速 度 が 著 し く 低 下 し ， 反 射 率 は 飽 和 し た ． ニ ッ ケ ル お よ び 金 ナ ノ 薄 膜 の 膜 厚 を 反 射 率 で モ ニ タ リ ン グ す る こ と で ， 光 フ ァ イ バ ー SPR セ ン サ ー を 作 製 す る 際 の 最 適 条 件 を 決 定 し た ． 最 適 条 件 で 作 製 し た 光 フ ァ イ バ ー SPR セ ン サ ー で 計 測 し た SPR ス ペ ク ト ル を Fig. 3a に 示 す ． SPR シ グ ナ ル は 金 薄 膜 の 界 面 の 屈 折 率 に 応 じ
4 て 変 化 す る ．屈 折 率 の 標 準 物 質 と し て ，化 学 的・物 理 的 に 安 定 な ス ク ロ ー ス を 用 い て ， セ ン サ ー の 性 能 を 評 価 し た ．SPR ス ペ ク ト ル は ，ス ク ロ ー ス 濃 度 に 依 存 し て 長 波 長 側 に シ フ ト し た ． 濃 度 に 対 し て ， ス ペ ク ト ル の 極 小 値 で あ る SPR 波 長 の 変 化 量 を プ ロ ッ ト し た と こ ろ ，非 常 に 良 好 な 相 関 関 係 を 得 る こ と が で き た(Fig.3b)．ま た ，検 出 感 度 は 1809 nm / RIU と 見 積 も ら れ た ． こ れ は 既 報 の 真 空 蒸 着 法 や ス パ ッ タ リ ン グ 法 で 作 製 さ れ た セ ン サ ー と ほ ぼ 同 等 の 感 度 で あ っ た ． 確 立 し た 技 術 で 作 製 し た 光 フ ァ イ バ ー SPR セ ン サ ー が ， 生 体 機 能 の 理 解 に 有 用 な “ そ の 場 ” 計 測 技 術 に 応 用 で き る 可 能 性 を 示 す た め に ， エ ク ソ ソ ー ム に 対 す る 応 答 性 能 を 調 べ た ． エ ク ソ ソ ー ム の 計 測 技 術 は 未 だ に 未 成 熟 で あ る た め ， 物 理 的 ， 化 学 的 な 内 外 の 刺 激 に 対 す る 細 胞 か ら の エ ク ソ ソ ー ム の 分 泌 量 に 関 す る 基 本 的 な 情 報 は 不 足 し て い る ．そ こ で ，光 フ ァ イ バ ー SPR セ ン サ ー の 金 薄 膜 表 面 に anti-CD 63 抗 体 を 物 理 的 に 吸 着 さ せ て ， エ ク ソ ソ ー ム の 個 数 依 存 的 な 応 答 を 観 測 し た ． テ ト ラ ス パ ニ ン の 膜 タ ン パ ク 質 で あ る CD63 は ，エ ク ソ ソ ー ム の マ ー カ ー と し て ，イ ム ノ ア ッ セ イ 等 で 利 用 さ れ て い る ． 種 々 の 濃 度 の 乳 が ん 細 胞 (MCF-7) 由 来 の エ ク ソ ソ ー ム を 含 む 溶 液 に セ ン サ ー を 浸 漬 し た と こ ろ ，エ ク ソ ソ ー ム の 個 数 が 増 加 す る と と も に ，SPR 応 答 が 大 き な 値 を 示 し た(Fig.4)．こ の セ ン サ ー で は ，エ ク ソ ソ ー ム を “ノ ン ラ ベ ル ”か つ “リ ア ル タ イ ム”で 計 測 で き る だ け で な く ，セ ン サ ー が 微 小 サ イ ズ で あ る こ と か ら ，細 胞 近 傍 に お け る“そ の 場 ”計 測 も 可 能 で あ る と 考 え ら れ る ． ま た ， 本 法 は ， ELISA 等 の 既 存 の エ ク ソ ソ ー ム 計 測 法 よ り も エ ク ソ ソ ー ム の 検 出 感 度 に 優 れ て い た ．
Fig.4 (a) A sensorgram for 20,000 particles of
MCF-7 exosomes (b)
The calibration curve of MCF-7 exosomes. Slope values were estimated the sensorgrams at the
range form 60-300 sec.
Fig.3 Performance of the
5 総 括 光 フ ァ イ バ ー に 金 属 ナ ノ 薄 膜 を 被 覆 す る 手 段 と し て ， 複 雑 な 構 造 体 に 金 属 被 膜 を 形 成 さ せ る 無 電 解 メ ッ キ 技 術 が 適 し て い る が ，nm オ ー ダ ー で 金 属 ナ ノ 薄 膜 の 膜 厚 を 制 御 す る こ と が 課 題 で あ っ た ． 本 研 究 で は ， 無 電 解 メ ッ キ 反 応 に よ り 変 化 す る 金 属 ナ ノ 薄 膜 の 膜 厚 を リ ア ル タ イ ム で モ ニ タ リ ン グ す る こ と に よ り ， こ の 課 題 を 解 決 し た ． 無 電 解 メ ッ キ 処 理 時 に お け る 金 属 ナ ノ 薄 膜 の 膜 厚 モ ニ タ リ ン グ 技 術 を 開 発 し た 例 は な く ， nm レ ベ ル の 膜 厚 を 計 測 す る 際 に ， 吸 光 度 や 反 射 率 が そ の 指 標 と し て 利 用 で き る こ と を 実 証 し た 例 も な い ． 本 研 究 で 確 立 し た 光 フ ァ イ バ ー SPR セ ン サ ー の 作 製 技 術 は ， 従 来 の 作 製 技 術 を 革 新 す る も の で あ る ．光 フ ァ イ バ ー SPR セ ン サ ー は ，“ ノ ン ラ ベ ル か つ リ ア ル タ イ ム ” に 生 体 高 分 子 を “ そ の 場 ” 計 測 で き る 可 能 性 を 秘 め て お り ， 生 体 機 能 の 理 解 が 求 め ら れ る 研 究 領 域 の 発 展 に 貢 献 し う る も の と し て 期 待 さ れ る ． 【 研 究 成 果 の 掲 載 誌 】
