遺 伝 子群 発現 機能解 析

A T M 遺伝子 群 ^の発 現^と機能 解析

‑ ト リ A T M , F R P 遺 伝 子^の組織^別, 発 生 段 階 別 発 現 量^の解 析 及 び^{ト リ A T M} 遺 伝 子^の

ノ ックアウ ト細 胞^{で の テロ メラ ー ゼ}活 性^の測 定 ^‑

金 沢 大 学 医 学 部医 学 科 外 科 学 第^一 講 座 ( 主任: 渡 辺 洋 字 教授)

金 沢 大学^{が ん}研 究 所 細 胞 制 御 研 究部 門 相月包分 子 病 態研 究 分 野 ( 主 任^:U｣本 健 ^一教 授)

加 藤 秀 明

毛 細^血管 拡 張 性 小 脳 失 調 症 (^{ata x}i^a‑tela ngi^{e cta sia}) ^は, 原 発 性 免疫 不 全症^に分 煙さ れ る常 染 色 体 劣 性 遺 伝 病であ り, その

臨床 症 状^は神 経 症 状, 免 疫 不 全, 高 発桶 性, 剤朋包^の放 射線感 受 性, 早期 老 化な ど多^{岐に わ た る. こ の原 因遺}伝子^atm (^{ata xia‑}

tela ngi e cta sia m utated) は, 細 胞 内情 報伝達 経 路^{に おい}て P 5 3 ^の上流に存在^し, 多様な役 割 を 担 う^こと が今 まで に わ か っ て^い る. また, aim b^Iコ ^ー ドする蛋 白 質, A T M はフ ォ ス ファチ ジ^ルイ^ノシ ト^{ー ル}3 キ ナ ^ー ゼ b^{ho s}phatid_yl in o sito1 3^‑k in a s e) ^ファミ リ ^ー に属し, F R P(^{F K B P‑r a}p^{a m}y^Cin a s s o ciated pr otein) 遺 伝 子 等, 類 縁 遺 伝 子は D N A 修 復, 細 胞 周期チェ ック ポ イ^ント, 減 数 分裂^の制 御に関 係し ている^. 本研 究で は, そのatm , 動 ^の発現 量 及び機 能に^{つ い}て解 析^{し た, ト リ}精 巣 由 来^cD N A ラ イ ブ ラ¹)

‑ か ら各 因 子 を^{コ ー ド}するcD N A(^{atm 6 0 3 b}p, 如 ^{5 13 b}p) ^を分 離L , 構 造 決 定を行^っ た後, 決 定し た塩 基 配 列に基^づきト リ^の

各組織に おける発 現 量 を^{ノ M} ザ^ンプロッ ト^ハイ プ リ ダ イ ゼ ^ー ションで解 析^{し た. atm T は}脳(^{br ain})^に, 顔 ^{で は}脳,心 臓(he a rt),

精 巣 (^{te stis}) ^で発 現^が確 認^{さ れ た.} また, ニ ワト リ産卵5,7,9,1 1 日 ヒ=^ニおけるatm , 卵 ^の発 生段 階 別 発 現 量に^つ き 同様に^{ノ ー} ザ ンプ^ロ ッ ト^ハイ プ り ダ イ ゼ ^ー シ ^ョンで解 析し た結 果, 融 加で は 7 日目^に, 頗 ^{で は 5 日}目に強^い発 現が み ら れ た^. また,

A T M およ び F R P 遺伝 子を, ト リ B リ^{ン パ}球 細 胞 株D T 4 0細 胞でノ ックアウ ト し た が, F R P ^ノック ア ウ ト馴 包^は, ホモ の段 階 で作 成 不可能であ^った^{. こ}れ は, F R P遺 伝 子^の欠 除^が胚 細 胞 致^死 (^{e mbr}yo niclethal) ^である 町能 性が示 唆さ れ た^･ 作 成し た A T M ^ノッ ク^アウ ト細 胞は_, 野 生型D T 4 0 馴 包と比 較^{し て}剃朋包増 殖 速 度^の低下を 認め る と共に, 有 意^{に テロ メラ ー ゼ}活 性^が増 加し て^いた^. 以 上の結 果^より, ト リ^αわ刀お よ びその相 同 遺 伝 子ノゆ^は発生^の初 期 段 階より 発 現し, 主に脳に強 く 発 現 する^こと は^{こ の}遺 伝子 群と小 脳 失調 などの神経 変 性との関連が示唆さ れ, ま^た, そ^の発 現^に関し て は そ れ ぞ れ異なった調 節 を うけ るも

のと考 えら れ た^. さ ら に, A T M 遺 伝 子^の機 能^{と し て}, 細 胞^の癌 化^と関 連 する テ^ロ メラ ^ー ゼ活 性 を 抑 制 する 可能性が示 唆さ れ た^.

Ⅸey ^{w o r}ds ata xia^‑tela ngi ^{e cta sia, ata Xia‑tela n}gi ^{e cta sia m utated} ,pho sph atid_yl in o sitol^‑3 k in a s e_,

F K B F r ap^{a m} y^{c l n a S S O C}iated _pr otein_,telo m e r a s e a ctivit y

毛細 血 管 拡 張 性 小 脳 失 調 症 (^{ata xia‑tela n}gi^{e cta sia}, 叩 ^{1)2) は},

多彩 な 症状を里 する常 染 色 体 劣性 遺 伝 病^である が, ホ^モ接 合,

ヘ テ^ロ凄 合^に共 通^{し て}癌 家 族 歴, 特に乳 癌^の確 患 頻 度が高^{い こ} と が知ら れ て^いる^{3)4). ヘ} テ^ロ接 合^の保 因 者^{で は}免 疫 不 全 症 状 がな^い にもか か わ らず 乳 癌^の発生率^{は 正}常 女 性^の約5倍にもお よ び⁵⁾, A T 遺 伝 子 異常^の全 乳 癌 患 者に対 す^る関 与は 7 % 以 上 と

報告^{さ れ てい る. そ れ ゆ}え, そ^の原 因 遺 伝 子αわ明 (ata xiか tela ngie cta sia m utated) が発 癌 機 構に密 接^に関 与^{し ていること} が示 唆さ れ, Sa vitsk y ら^{6)7) の}グル ^ー プ に より1 9 9 5年, ポ ジ シ

ョナ^ルクロ^ー ニ ング b^{o sitio n al clo nin}g) ^{に よ って}同 定^{さ れ たこ} と は, 今 後^の乳 癌 をは じ め とする腫 瘍^の原 因, 病 態角開削^二お^い て大 きな 進 歩^であ^{っ た}と 言 え^{る. そ れ 以}来, こ の多機^{能 遺 伝 子}

に関 す^る研 究^が数 多く 報 告^{さ れ ている.}

癌 抑 制 遺 伝 了^･と して知ら れ るp5 3遺 伝‑^{f･は, 放 射 線D N A障} 害^や痛 遺 伝 子産 物^{な ど に よ るストレ スで,} 細胞 周 期 停 止ヤアポ ト^ー シ^ス (apop to sis) を 引 き 起^こすが, A T M 遺 伝 子^{は その}柳川包 内情 報 伝 達 系^でp5 3遺 伝 子^の上流に存 在し, 選択 的にp5 3遺 伝 子^･を活 性 化 する働 きがあ^{ること が わ かっ ている即∈)).} 今車^l我^々 は, そ^のA T M 遺 伝 子^の発 現 量お よ び機 能を解 析 する^ことを 臼 的と し て実 験 を 行^った. 機 能 解 析 を 進め る 上 で A T M 遺 伝 子^の 細 胞^レベルでの ノ ック ア ウ トを 行 う^にあたり, 当 教 室^{で は}高頻 度^で相 同^{D N A} 遺 伝 子 組^み換 え^{を おこ}す 細 胞 (^{ト リ B 7) ン パ}球 細 胞株D T 4 0細 胞^川)) を 使 用 する計 画であ^っ た^ので, ま ず, 未^だ 知^{ら れ ていな か った ト1) でのA T M} , F R P (^{F K B P‑r a}p^{a m}yCiⁿ

平成1 0 年1 1月²⁴ 日受付, 平成¹¹ 年¹ 月^{2 5} 日受^理

A b br e viati｡ n S : A T, ata Xia^qtela ngi^{e cta sia};A T M , ata Xia^‑tela ngi ^{e cta sia m utated;bp, ba s e pair s; C H A P S, 3‑} [(^3‑

chol am idop^{r o}p yl) ^{dim eth}yla m m o nio] ^‑1‑p^{r O}P^{a n e S u}lfo n ate; F K B P_,F K 5 0 6 b inding p^{r o}tein; F R P, F K B P^‑r ap^{a m} y^Ciⁿ

a s s o ciated _pr otein; P B S,p h^{o s}phate buffe r s alin e;P I3, Pho sp h^atidyl in o sito1 3; ^rP^m ,r Otati o n p^{e r m}in ute;T B E, n is^‑

bo r ateE D T A;U V,ultr a vi01et

a s s o ciated pr otein) 遺 伝 子^{のクロ ー ニ ング}を 行^った. ま た, A T 患 者 由来^の細 胞^{で は テロ メ ア}(^telo m e r e) ^に関係 す^る染 色 体 異 常 が 以前^{よ り}知ら れ て おり^{1 1)}, 我^々はこ の点に^ついても 機 能 解 析 を進め た^.

材 料お よび方 法

Ⅰ. cD N A ラ イブラ リ ^ー の作 成

雄 成 鶏 (^{ニ ノックス}, 金 沢) ^{か ら}摘 出し た精 巣を組 織 変 性 溶 液(^{4 M グ アニ ジンチ オ シ アン}酸,2 5 m M ク^{エ ン}醸ナ ト リ ウ^ム,

0 ユM ′ラ^ーメ ルカ プ トエタノ^ー ル

,0^･5 % サ^ルコ シル) ^{に て}溶 解し,

小切片に分 断後, 迅 速に テ^{フ ロ ン}ホモ ジ ナ イ ザ ^ー (^ヤマ ト科 学,

東 京) ^{に て ホモ}ジ ナ イ ズ し た^. 溶 解 液は液 体 窒 素 ( 宇 野 酸 素,

金沢) ^{に て}速や か に凍 結 後, ‑ ^{8 0 ℃ で}保 存し た^. ホモジ ナ イ ズ し た ト リ 精 巣 溶 解 液1 0mlをフ タ ^つ き 遠 心 管 (C o r ning,

Ne wYo rk,U S A) ^に分 注^し, 2 M 酢 酸^{ナ ト リ ウム}(pH 4.0) ^を加 え て振 坦 後, 平 衡 化 酸 性^{フ ェ ノ ー ル}, クロ ロ ホ^{ル ム}イ ^ソア ミ^ル ア ルコ ^ー ル溶 液 (^{9 8: 2}) を 加 え^て混 合し, 氷上 で 1 5分 放 置^し た^. 低 温 遠 心 機 (ト ミ ^ー精工, 東 京) を 用^い て, 4℃, 3,0 0 0fj!1 転/ 分(^{r otatio n} pe r min ute,rpm)^のもと で 2 0 分 間 遠心し, R N A を含む氷 層を回 収し た^{. こ}れ に イ^ソプロ ピルアル コ ^ー ルを加 え て, 1 0分 間 放 置 後, 4 ℃, 3,0 0 0rpm で 1 0分 間 遠 心し, 沈 澱し た R N A に組 織 変 性 溶 液 を 加 え^た後, エ タノ ^ー ル沈 澱 を 行^った. 得ら れ た仝R N A は, 2 6 0n m に おける吸 光 度を測 定し, 1 0 D を 4 0_FL g/ ^ml と し て R N A 濃 度 を 測 定^{し た.} 仝R N A l m g か ら,

01i_gote x^‑d T 30 s up^{e r}( 宝 酒 造, 草 津) を 用^いて ポ リ A ^十R N A 2 0 /¹g を分 離^{し た. その}う ち^{ポ リ A + R N A 5}/^jgか ら Z A P^‑CD N A Synthe sis キッ ト(Str atage n e, LaJolla,U SA) を用^いて ト リ精巣

cりN A ラ イ ブ ラ リ ^ー を作 成し た.

Ⅰ^. シ^ー ク^{エ ン ス}

ヒト お よ び酵 母^のαわ乃, 如^{のホモ ロ ジー} 解 析に よ り両生物 間 で保存 度^の高^い領 域 を 選 定し, 当該^{ア ミ ノ}酸 配 列に対 応 す^るヒ トcD N A ^{の ヌ}クレオ チ ド配列に基^{づい て}P C R 川デ ジュネ^レー ト プ ラ イマ ^ー (^{エ ス ペ ック オ リ ゴサ ー ビス}, 筑 波) ^を設 定^{し た.} A T M プ ラ イ マ ^M は ヒ トcD N A の塩 基 番 号^{8 1 8 8‑8207} (5^'‑ A A G G G C C G T G A T G A C C T G A G^‑3^') ^{と 87 7 1‑8 7 9 0} (^5'‑ C A T G C C A T C C A C A A m C T C^‑3^') に, F R P プライ^{マ ー} は 6 9 7 9‑

69 9 8 (^5'‑A A G C C A A A A G A T G A C C T G A G^‑3^') ^{と 7 4 7 2}‑^7491(5'‑

A C A m G A A A T C T A C A T G T A^‑3^')に対 応す る^. 先に唯 備し た ト リcD N A ラ イ ブ ラ¹) ^‑ を用い て P C R を行^っ た. P C R 反 D N A サ ^ー マルサ イ ク ラ ^ー ( 宝 椚 造) を川い て, 熱 変竹せ9 5 ℃^, 3 0秒 間, ア ニ ^ー リングを5 0 ℃, 3 0秒 間, D N A の伸 長を7 2 ℃,

1分間と し_, これを1 サ イ クルと して3 0 サ イ クル行^{っ た.} 坤川高 さ れ た D N A 断 片を_pBlu e s c ri_{p t}K S(^‑)^ベク タ^ー( 東 洋 紡, 人 阪)に クロ ^ー ン化^し, 得ら れ た組^み替 え^{プ ラス ミ}ド を分 離^{し て}旛 基配 列を決 定^{し た}結 果, atm ,ノ痺^は対 応 するヒトcD N A領 域と そ れ ぞ れ 9 6 % , 9 7 .2 % の相 同 性^を示^{し た こ}と か ら ト リ A T M ,

F R P_cD N A の部 分 配列と判 定さ れ た^.

】肛^. ノ^ー ザンプロ ッ ト^ハイプリダイ ゼ ^嶋 ション

各プ ラス ミ ドを 大 量 精 製 後 制 限 酵 素 消 化^し, ベク タ ^ー か ら切 り 出さ れ た挿入 cD N A 配 列 を1 % ア ガロ ^ー ス電 気 泳 動し,

Ultr aCle an (M o Bio L d bo r ato rie s,Sola n a Be a ch,U S A) を 用^{い て} 精 製, 分 離し_, Prim e^‑It II ラ^ベ1) ^ング キ ット(^{Str ata}g^{e n e}) ^を用

い て_, プロ^ー ブ標 品 を作 成し た^.

ト リ各組 織, す なわち 脳 (br ain), 心 臓 (he a rt), 肺 (lu ng) ,

肝 臓 Giv e r)^, 刷 蔵 (pa n c r e a s), 精 巣 (^{te stis})^, 腎臓 (^{k idn e}y) ^よ り前 記^のように抽 出し た ポ リ A ^十R N A 6^.6/^ノg を 5 0 % ホ^{ル ム ア} ミ ド( 和 光 純 薬, 大 阪) と 1 7^.5 % ホル ム ア ルデヒド( 和 光 純 薬) と な る ように し て, 6 5 ℃ で 1 0分 間 変 性^を行^{っ た.} 引 き続 き,

2^.2 M ホル ムアルデ ヒド加1 % アガ^{ロ ー} スゲルを用^いて, 泳 動 綬 衝 液[^{0.2 M 3‑N‑モリ ホ リノープロ バ ン ス ルホン}酸,5 0皿M 酢酸 ナ ト リ ウムbH 7^.0), 1 0m M E D I A b^{H 8.0})] 中, 定電 圧5 5 ボ^ル ト に て電 気 泳 動し た後, ナ イ ^ロ ン メ ンブ ラ ン フ ィ ル タ ^ー (Hybo nd^‑N⁺ nylo n m e mbr a n e,A皿 e r Sha m ,Gr e e n wich, U S A) に

転 写し た. メ ンブ ラン フ ィ ルタ^ー を0.0 5 N水 酸 化ナ ト リ ウ^ム溶 液^{に 5} 分 間浸し た後, 2×S S C [^0.3 M 塩 化ナ ト リ ウム

, 0^.0 3 M ク^エ ン醸三 ナ ト リ ウム ニ水 和 物] 溶 液 中で 6 0秒 間 振 塗し て^ア ルカ リ固 定^を行^{っ た}後, 紫 外 線(^{ultr a violet},U V)^{クロ スリンカー} (Str atage n e) を 用い てR N A をメ ンブ ランに固定し た^. メ ンブラ

ンをプレハイ プ リ ダ イ ゼ ^ー ション韓 衝 液[^{5 ×S S C},5 0 % ホル ム ア ミ ド,5 × デ ン^ハ ルト溶 液 (0^.1 % ポ リ ビ^{ニ ル} ピロリ ドン_, 0.1 % ウ シ血 清^ア)L/ブ ミ^ン, 0.1 % フ ィコ ^ー ル), 0.5 % S D S, 1 m

g/ 変 性サ ケ精 子D N A] 中で 2 時 間, 4 2℃で プ^レハ イ プ リ ダ イ ゼ ^ー ショ ンし た. そ^の後,

:! 2p で標 識し たα加官プロ ^ー ブ[6 0 3塩 基 対(^ba s e p^air s

,bp)] を最 終 濃 度が 1ng/ ^{ml と}な^{る よ}うに^ハイ プ リ^バッ グ(^{コ ス モ バ}イ オ, 東 京) 内に加 え, 4 2 ℃ で振 塗さ せ な が ら 1 6 時 間^ハイ プ リ ダ イ ゼ ^ー ショ ンを行^{った. ハイ プ リ ダ} イ ゼ ^ー ショ ン彼^{の メ ン}ブ ランを6 5 ℃の2 ×S S C 溶 液 中で 1 5分 間²回, 0.5 ^×S S C 溶 液 中^{で 1 5}分 間²回洗 浄 を 行^い, ‑ ^{8 0 ℃ で}

オ ^ー ト ラ ジ オ グ ラフ イ ^ー を行^い, バイ オ イ^{メ ー} ジアナライ ザ ^ー (B A S l O O O) ( 富^{士フ イ ル ム}, 浜 松) を 朋^いて, プロ ^ー ブの放 射活 性 を 測 定し た^. 使 用し た^{メ ン}ブラ ンは 0^.5 % S D S 中で, 9 5℃,

1 0 分 間振 漁 後, 再び 1 0 分 間, 室 温で滅 菌 蒸留 水 中に浸 す^こと に よ⁸)^' 再^ハイ プ¹) ダ イ ゼ イ ション(^{r eh}ybrid iz atio n) ^に用^いた. すな わ ち, こ の同じメ ンブラ ンを用^{い て}カ少^{プロ ー ブ}(5 1 3 b_p) ,

コ ント^{ロ ー ル}と し ての_′ゴ^ーアク テンプロ ^ー ブ(^{4 8 6 b}p) ^で, 再 度^ノ

R in a s edo m aim ^‑ ヰ ^{ÅTM pr obe}

†_B †_Ⅹ. †_Ⅹ †_B

Ne o m y^cin

†B †_{Ⅹh ｡}

Histi di^{n o}l

†_B †Ⅹ

‑ †Ⅹh B

4 kbp

F ig^.1.T he pa rtialr e strictio n m ap ofthe ch icke n A T M ge n o mic

lo c u s s u r r o u ndinge x o n swh ich e n c odetheP I 3^‑kin a s edo m ain.

(^A) ^{T he wil d‑}t y p^{e r e S}trictio n m ap^. T he n u cle oti dele ng th betw e e n the tw o Ba mH I site s w a s6 k bp^.(^B) ^{T he n e o m}ycin ta rgeted ÅT M ge n o miclo c u s,T he clo s ed sq^{u ar e} in dic at_{e s}the n e o mycin ge n e(^{2 k b}p)^{.T he n u cle otidele n}g^th betw e e n the

Ba mH I a nd X hoIsite s w a s4 k bp^.(^C) ^{T he} g^{e n o m}iclo c u s of A T M ta rgeted by pla cing ^the h isti din ol _ge n e^. T he clo s ed

Squ a r eindic at_{e s}h istidin ol g^{e n e}(2 k bp)^.T he n u cle oti dele ngth betw e e n the Ba mH I a nd X hoI site s w a s4 k b p^.B, Ba mH I;K,

埠^{乃Ⅰ;Ⅹ,g わαⅠ;Ⅹも,j 肋βⅠ;二炬1B, 助βⅠ弧d 助 椚月Ⅰ.}