ース (99 atom%; Cambridge Isotope Laboratories, MA, USA) を 15ml 生理食塩水に溶かしたものを用いた また グルコース同位体注入実験終了 2 日後に同様にして尿素同位体注入実験を行った 採血は注入時刻 (10:00) の -10,-5,10,

安 定 同 位 体 を 用 い た 同 位 元 素 希 釈 法 に よ る 子 ウ シ の グ ル コ ー ス と 尿 素 代 謝 動 態 の 解 析 東 北 大 学 大 学 院 農 学 研 究 科 動 物 生 理 科 学 分 野 小 原 嘉 昭 ・ 林 英 明 背 景 と 目 的 ウ シ な ど の 反 芻 動 物 は 、 第 一 胃 、 第 二 胃 、 第 三 胃 、 第 四 胃 の ４ つ の 胃 を 持 っ て お り 、 第 一 胃 と 第 二 胃 は あ わ せ て 反 芻 胃 と 言 わ れ 体 重 600ｋ ｇ の ウ シ で そ の 容 積 は 180ｌ と 大 き く 、 そ の 中 に 多 く の 微 生 物 が 生 息 し 連 続 発 酵 槽 を 形 成 し て い る 。 ま た 第 四 胃 は 単 胃 動 物 の 胃 に 相 当 し 胃 塩 酸 を 分 泌 す る 。 ウ シ は セ ル ロ ー ス を 多 く 含 む 草 類 な ど の 粗 飼 料 を 第 一 胃 内 の 微 生 物 発 酵 に よ っ て 分 解 し 短 鎖 脂 肪 酸（ SCFAs）を 産 生 し そ れ を 主 な エ ネ ル ギ ー 源 と し て お り 、 さ ら に 微 生 物 態 蛋 白 質 な ど を 消 化 吸 収 す る と い う 単 胃 動 物 に は 見 ら れ な い 独 特 の 栄 養 摂 取 機 能 を 持 っ て い る 。 我 々 は 、 反 芻 動 物 の 栄 養 生 理 学 的 特 徴 を 明 ら か に す る た め に 安 定 同 位 体 を 用 い た 同 位 元 素 希 釈 法 に よ り 代 謝 を 定 量 的 に 捉 ら え 、 単 位 時 間 当 た り の 栄 養 素 の 移 行 量 と し て 生 体 内 で の 代 謝 を 観 察 す る カ イ ネ テ ィ ク ス 実 験 を 行 っ て き て い る 。 す な わ ち 1 5 N-尿 素 、1 5_{N- ア ン モ ニ ア 塩 を 用 い た 実 験 で は 、 消 化 管 と 血 液 で の 尿 素 の 動 態 と 第 一 胃 内 で の} ア ン モ ニ ア か ら の 微 生 物 合 成 速 度 の 測 定 (Obara and Shimbayashi,1980) 、1 5 _{N-尿 素 、}1 3 C-グ ル コ ー ス 、1 3_{C-プ ロ ピ オ ン 酸 を 用 い た 実 験 で は 尿 素 再 循 環 量 、 プ ロ ピ オ ン 酸 産 生 量 、 糖} 新 生 量 の 測 定 (Sutoh et al.1996)、 2_{H グ ル コ ー ス を 用 い た 実 験 で は 、 乳 牛 に お け る グ ル} コ ー ス 代 謝 を 動 的 に 捉 え る 実 験 を 行 っ て き て い る (Rose et al. 1998)。 こ の よ う に 安 定 同 位 体 を 用 い て 、 第 一 胃 と 体 内 に お け る 糖 代 謝 お よ び 窒 素 代 謝 や ホ ル モ ン の 変 動 、 栄 養 素 の カ イ ネ テ ィ ク ス に つ い て の 研 究 を 盛 ん に 行 っ て き て い る 。 反 芻 動 物 も 、生 後 間 も な い 頃 は ミ ル ク を 摂 取 し て お り 第 一 胃 の 機 能 が 発 達 し て お ら ず 、4 ～ 6 週 齢 で 粗 飼 料 を 摂 取 す る よ う に な る と 第 一 胃 が 急 激 に 発 達 し 徐 々 に 成 反 芻 動 物 の レ ベ ル に 達 す る こ と が 知 ら れ て い る 。 し か し 哺 乳 期 や 離 乳 後 の 第 一 胃 の 発 達 に 伴 う 代 謝 や 内 分 泌 の 変 動 、 特 に 哺 乳 期 に お け る 栄 養 素 の カ イ ネ テ ィ ク ス に 関 す る 研 究 は ほ と ん ど 行 わ れ て い な い 。 そ こ で 、 子 ウ シ を 用 い て 反 芻 動 物 に お け る 代 謝 ホ ル モ ン の 変 動 、 グ ル コ ー ス 代 謝 動 態 お よ び 尿 素 代 謝 動 態 の 成 長 に 伴 う 変 化 を 観 察 す る 実 験 を 行 っ た 。 方 法 実 験 動 物 ： 実 験 に は 、 4 週 齢 （ n=4）、 13 週 齢 （ n=5） 及 び 24 週 齢 (n=6)の ホ ル ス タ イ ン 種 仔 ウ シ 15 頭 を 用 い た 。仔 ウ シ は 2 週 齢 時 に 導 入 し 、6 週 齢 で 離 乳 を 行 い 、24 週 齢 ま で 飼 育 し た 。 実 験 動 物 を 定 常 状 態 に お く た め に 、 1 日 分 の 飼 料 を 4 週 齢 で は 6 回 (9:00 か ら 4 時 間 間 隔 )、 13 週 お よ び 24 週 齢 で は 12 回 (9:00 か ら 2 時 間 間 隔 )に 分 け て 2 週 間 前 に わ た っ て 給 与 し た 。 給 与 飼 料 は 日 本 飼 養 標 準 に 基 づ い て エ ネ ル ギ ー お よ び 粗 蛋 白 質 を 充 足 す る よ う に 設 計 し た 。こ れ ら の 子 ウ シ を 用 い て 1 3_{C お よ び} 2_{H グ ル コ ー ス 、}1 3_{C お よ び} 1 5_{N 尿 素 の} 安 定 同 位 体 の 単 一 注 入 に よ る 安 定 同 位 体 元 素 の グ ル コ ー ス 及 び 尿 素 カ イ ネ テ ィ ク ス の 成 長 に 伴 う 変 化 を 観 察 し た 。 同 様 に 血 漿 中 グ ル コ ー ス 濃 度 、 尿 素 濃 度 、 成 長 ホ ル モ ン (GH)、 イ ン ス リ ン 、 IGF-1 に つ い て も 観 察 し た 。 実 験 行 程 ： 4,13,24 週 齢 時 に 1 3_{C お よ び} 2_{H グ ル コ ー ス を 頸 静 脈 よ り 単 一 注 入 す る 安 定 同} 位 体 元 素 希 釈 法 を 実 施 し た 。 採 血 前 日 に 試 験 牛 の 両 側 の 頸 静 脈 に カ テ ー テ ル を 装 着 し 一 側 か ら 安 定 同 位 体 を 注 入 し 他 則 か ら 採 血 を 行 っ た 。採 血 は 、注 入 時 刻 (10:00)の -10,-5，5,10， 15,30,45,60,90,120,150,180, 240,300 分 後 に 行 っ た 。 注 入 す る グ ル コ ー ス の 安 定 同 位 体 溶 液 は [U-1 3_{C]D- グ ル コ ー ス (98.5 atom%; Shoko, Tokyo, Japan) お よ び [6,6-}2_{H]D- グ ル コ}

ー ス (99 atom%; Cambridge Isotope Laboratories, MA, USA)を 15ml 生 理 食 塩 水 に 溶 か し た も の を 用 い た 。 ま た 、 グ ル コ ー ス 同 位 体 注 入 実 験 終 了 2 日 後 に 同 様 に し て 尿 素 同 位 体 注 入 実 験 を 行 っ た 。 採 血 は 注 入 時 刻 (10:00) の -10,-5,10 ， 20,30,60,90,120,180,240, 300,360,480,600 分 後 に 行 っ た 。 注 入 す る 尿 素 溶 液 は [1 3_{C] 尿 素 (99 atom%; Phenome} Sciences, MA, USA)お よ び [1 5_N, 1 5_{N]尿 素 (99.6 atom%; Shoko)を 15ml 生 理 食 塩 水 に 溶 か し} た も の を 用 い た 。 分 析 代 謝 ホ ル モ ン 、 代 謝 産 物 の 測 定 ： 血 漿 GH、 イ ン ス リ ン 、 IGF-1 の 測 定 は ラ ジ オ イ ム ノ ア ッ セ イ 法 (RIA)、 血 漿 グ ル コ ー ス 、 尿 素 は 和 光 の キ ッ ト 比 色 法 で 測 定 し た 。 [6,6-2_H 2]D-グ ル コ ー ス ： 安 定 同 位 体 比 の 測 定 は 、 Wiecko ら (1976)お よ び Rose ら (1996)の 方 法 に 基 づ い て 行 っ た 。 血 漿 サ ン プ ル は 徐 蛋 白 後 上 清 と 同 量 の レ ジ ン (Duolite MB 5113 mixed resin)を 加 え 、 グ ル コ ー ス 画 分 を 得 、 凍 結 乾 燥 し 、 デ シ ケ ー タ ー で 分 析 ま で 保 存 し た 。 測 定 時 、 Pyrd/BBA 溶 液 1ml を 加 え 、 40℃ の ウ ォ ー タ ー バ ス に 入 れ 、 2 時 間 放 置 後 無 水 酢 酸 を 加 え て 混 和 し 、 １ 時 間 後 ウ ォ ー タ ー バ ス 上 で 窒 素 ガ ス と と も に ピ リ ジ ン を 蒸 発 除 去 し た 。 さ ら に 酢 酸 エ チ ル を 加 え 、 ガ ス ク ロ マ ト グ ラ フ 質 量 分 析 計 /GCMS(5890 series Ⅱ , Hewlett Packard, Washington, DC; JMS-SX 102A, Nihon Denshi, 日 本 )を 用 い て 同 位 体 比 を 測 定 し た 。

[U-1 3_{C]D-グ ル コ ー ス ： 安 定 同 位 体 比 の 測 定 は 、 Sano ら (1996)の 方 法 に 基 づ い て 行 っ た 。} 前 処 理 に お い て 乾 固 さ せ た サ ン プ ル に TMSI-C(ジ ー エ ル サ イ エ ン ス )を 100μ l 加 え 、 シ リ ル 化 し て GCMS(DELTAp l u s_{, ThermoQuest, Germany)を 用 い て 安 定 同 位 体 比 の 測 定 を 行 っ た 。} [1 3_{C]尿 素 お よ び [}1 5_{N]尿 素 ： 安 定 同 位 体 比 の 測 定 は 、Sutoh ら (1996)の 方 法 に 基 づ い て 行} っ た 。 血 漿 を 徐 蛋 白 後 上 清 を 採 取 し 、カ ラ ム に 通 し て 、尿 素 画 分 を 得 た 。カ ラ ム に は 陽 イ オ ン 交 換 樹 脂 (AG 50W-X8 100-200mesh H＋_{form,Bio-Rad Laboratories)を 用 い た 。 凍 結 乾} 燥 機 を 行 い 、 [1 3_{C] 尿 素 用 に 0.05mg 、 [}1 5_{N] 尿 素 用 に 0.1mg の サ ン プ ル を 秤 量 し 、} EA/IR-MS(DELTAp l u s_{, Finnigan MAT, ThermoQuest, USA)を 用 い て 安 定 同 位 体 比 の 測 定 を 行} っ た 。 計 算 :本 実 験 に お け る グ ル コ ー ス カ イ ネ テ ィ ク ス に 関 す る 数 学 的 処 理 は Nolan ら (1974) の 方 法 を 用 い て 行 っ た 。 頸 静 脈 に 安 定 同 位 体 を 単 一 注 入 し て 経 時 的 に 安 定 同 位 体 の Atom% excess の 変 動 を 観 察 し て 、そ の 直 線 解 析 を 行 う と 、そ の 直 線 は 以 下 に 示 す ２ つ の 指 数 関 数 の 和 で 表 せ る 。

E=A

₁

e

m 1- t

_+A

2

e

m 2- t こ の 時 t=時 間 、 E は 1 3_{C も し く は} 2_{H グ ル コ ー ス 、}1 5_{N も し く は} 1 3_{C 尿 素 の Atom % excess、} A1、 A2 は 指 数 関 数 １ 式 、 指 数 関 数 ２ 式 に お け る に お け る Ｙ 軸 切 片 と な る 。 m1、 m2＝ 指 数 関 数 １ ， ２ 式 に お け る 速 度 定 数 (時 間- 1_{)を 示 す 。} グ ル コ ー ス 、 尿 素 の プ ー ル サ イ ズ は 次 式 で 表 さ れ る 。 Q=N/ A1+A2 こ の 時 、 N は 注 入 し た 同 位 体 原 子 数 を 表 す 。 イ リ バ ー シ ブ ル ロ ス (IL)は 次 の よ う に 計 算 さ れ る 。 IL=Q/A’

但 し A’ =A’ 1 + A’ 2 m1 m2

A’ 1、A’ 2 は 各 構 成 指 数 関 数 の t=0 の 時 の Y 軸 切 片 の 総 和 に 対 す る 一 構 成 指 数 関 数 の Y 軸 切 片 値 の 割 合 で あ る 。

本 実 験 に お い て 得 ら れ た 1 3_{C も し く は} 2_{H グ ル コ ー ス の Atom% excess は 図 11 の よ う に 表} す こ と が で き 、 上 記 の 計 算 式 よ り グ ル コ ー ス の プ ー ル サ イ ズ 、 代 謝 回 転 速 度 お よ び リ サ イ

ク ル 速 度 を 求 め た 。 ま た 図 に は 示 さ な か っ た が 、1 3_{C も し く は} 1 5_{N 尿 素 の Atom% excess の} 指 数 関 数 か ら 上 記 の 計 算 式 よ り 尿 素 の プ ー ル サ イ ズ 、 代 謝 回 転 速 度 お よ び リ サ イ ク ル 速 度 を 同 様 に 求 め た 。 統 計 :デ ー タ は 平 均 値 ±S.E.で 示 し た 。各 週 齢 間 の 変 動 に つ い て 、一 元 配 置 の 分 散 分 析 を 行 い 、 有 意 差 が 検 出 さ れ た 場 合 に は ダ ン カ ン の 多 重 比 較 検 定 で 解 析 し た 。 結 果 血 漿 GH は 週 齢 に 従 っ て 減 少 し 、血 漿 イ ン ス リ ン と IGF-1 は 週 齢 と 共 に 著 し く 上 昇 し た（ 表 １ ）。グ ル コ ー ス の プ ー ル サ イ ズ は 加 齢 に 伴 っ て 有 意 に 増 加 し た (表 1)。グ ル コ ー ス 代 謝 回 転 速 度 は 1 3_{C お よ び} 2_{H グ ル コ ー ス と も に 4 週 齢 か ら 13 週 齢 に か け て 、 す な わ ち 離 乳 後 に} 有 意 に 減 少 し た が 、 13 週 齢 と 24 週 齢 の 間 に は 有 意 な 変 化 は 認 め ら れ な か っ た 。 グ ル コ ー ス リ サ イ ク ル 速 度 も 同 様 に 、 離 乳 に よ っ て 激 減 し 、 そ の 後 の 加 齢 に よ る 変 化 も 認 め ら れ な か っ た 。 こ れ ら の 結 果 よ り 、 離 乳 に 伴 っ て ウ シ の グ ル コ ー ス 代 謝 回 転 速 度 お よ び リ サ イ ク ル 速 度 が 大 き く 変 化 す る こ と が 明 ら か と な っ た 。 尿 素 の プ ー ル サ イ ズ は 、 離 乳 (6 週 齢 )に 伴 う 有 意 な 変 化 は 見 ら れ ず 、 そ の 後 の 加 齢 に 伴 っ て 漸 増 し 、24 週 齢 時 で は 3.89±0.15gN と 有 意 に 高 い 値 を 示 し た (表 2)。1 5_{N 尿 素 の 代 謝} 回 転 速 度 に は 、加 齢 に よ る 有 意 な 変 化 は 認 め ら れ な か っ た 。一 方 、1 3_{C 尿 素 の 代 謝 回 転 速 度} は 、プ ー ル サ イ ズ の 変 化 と 類 似 し て 、離 乳 前 後 で は 有 意 な 変 化 は 見 ら れ な か っ た が 、24 週 齢 で は 有 意 に 増 加 し て い た 。 さ ら に 、 尿 素 の リ サ イ ク ル 速 度 も 、 離 乳 前 後 で は 有 意 な 変 化 は 見 ら れ ず 、24 週 齢 に 有 意 に 増 加 す る と い う 結 果 が 得 ら れ た 。こ れ ら の 結 果 よ り 、尿 素 代 謝 カ イ ネ テ ィ ク ス は 、 離 乳 で は 変 化 せ ず 、 そ の 後 の 成 長 に 伴 っ て 変 化 す る こ と が 明 ら か と な っ た 。 考 察 哺 乳 期 に お い て は 、 子 ウ シ は 栄 養 素 の 消 化 吸 収 能 は 非 常 に 高 く 、 グ ル コ ー ス の 代 謝 回 転 速 度 や リ サ イ ク ル 速 度 も 高 く 、 コ リ サ イ ク ル な ど を 介 し て 盛 ん に グ ル コ ー ス の 再 利 用 が 行 わ れ て い る と 考 え ら れ る 。離 乳 に よ る グ ル コ ー ス 再 利 用 の 減 少 は 、SCFAs か ら の グ ル コ ー ス 産 生 が 増 加 す る こ と に よ っ て 起 こ っ て い る の か も し れ な い 。 ウ シ の 第 一 胃 の 発 達 は ヒ ツ ジ な ど と 比 べ て 遅 く 、13 週 齢 で は 第 一 胃 の 発 達 が 十 分 で な い た め 、第 一 胃 で 分 解 さ れ ず に 下 部 消 化 管 へ 流 入 す る 栄 養 素 も 多 く 、 尿 素 再 循 環 機 構 が 十 分 に 働 い て い な い た め に 尿 素 代 謝 回 転 速 度 や リ サ イ ク ル 速 度 も 変 化 し て い な い 可 能 性 が あ る 。 そ の 後 の 第 一 胃 の 発 達 に よ り 、 尿 素 代 謝 回 転 速 度 や リ サ イ ク リ ン グ 速 度 は 増 加 し 、 血 漿 中 窒 素 速 度 も 増 加 し て い る こ と が 示 唆 さ れ る 。 文 献

Nolan J.V., Leng R.A. (1974) Proc. Nutr. Soc. 33, 1-8. Obara Y. and Shimbayashi K. (1980) Br. J. Nuti. 44:295-305

Rose M.T., Itoh F., Matsumoto, M., Takahashi, Y., Obara Y. (1998) J.dairy Res 65:423-431.

Rose M.T., Obara Y., Fuse H., Itoh F., Ozawa A., Takahashi Y., Hodate K., Ohashi S. (1996) J. Dairy Sci. 79, 1734-1745.

Sano H., Fujita T., Murakami M., Shiga A.(1996) Domest. Anim. Endocrinol. 13, 445-451. Sutoh M. Obara Y., Miyamoto, S. (1996) J. Agric. Sci. (Camb) 126:99-105.

図 11.

2

_H,

13

_{Cグルコース単一注入によるatom% excess の推移}

Aは

2

_{Hグルコース、Bは}

13

_{Cグルコースの週齢ごとの推移を示す}

0.01

0.10

1.00

10.00

0

50

100

150

200

250

300

350

Time after injection (min)

2

H

-at

o

m

%

e

x

cess

4w

13w

24w

A

0.0001

0.0010

0.0100

0.1000

1.0000

0

50

100

150

200

250

300

350

Time after injection (min)

13

C-at

o

m

%

ex

cess

4w

13w

24w

B

表 １ ． ウ シ の 加 齢 に 伴 う グ ル コ ー ス 及 び カ イ ネ テ ィ ク ス の 変 化

mean±S.E.

a,b,c:異 な る 文 字 間 に 有 意 差 あ り (Ｐ ＜ 0.05;Duncan’s test)

表 ２ ． ウ シ の 加 齢 に 伴 う 尿 素 カ イ ネ テ ィ ク ス の 変 化

4w 13w 24w

Plasma Urea-N (mg/Ndl) 3.86±0.45c _4.77±0.28b _7.79±0.29a

Urea pool size (gN) 1.49±0.32b _1.32±0.30b _3.89±0.15a

Urea irreversible loss (mgN/min・ kg Bw)

15_{N-Urea 0.20±0.03 0.18±0.04 0.24±0.02} 13_{C-Urea 0.21±0.07} b _0.20±0.05 b _0.47±0.07 a

Urea recycle rate

(mgN/min・ kg BW) 0.01±0.04b 0.02±0.02 b 0.24±0.07 a mean±S.E.

a,b,c:異 な る 文 字 間 に 有 意 差 あ り (Ｐ ＜ 0.05;Duncan’s test)

4w 13w 24w GH(mg/ml) 9.06±1.53a _8.08±0.85b _5.25±0.68b Insulin(μU/ml) 1.2±0.3b _18.7±1.7b _62.7±14.3a IGF-Ⅰ (mg/ml) 28.8±6.7c _84.7±10.9b _106.3±11.5a Body weight(kg) 48.1±1.3c _105.6±3.1b _190.0±4.6a Plasma glucose (mg/dl) 103.1±7.5b _115.4±3.9a _91.6±2.2c

Glucose pool size(g) 22.78±1.08c _37.15±3.11b _59.93±3.48a

Glucose irreversible loss (mg/min・ kg BW)

U-13_{C-glucose 14.18±2.40}a _8.94±0.81b _8.73±0.48b

6,6-2_{H2-glucose 16.64±3.14}a _9.01±0.99b _8.93±0.47b

Glucose recycle rate