温泉水中の水素産生菌: 材料分析室利用研究成果、そのXXVII(4)

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温泉水中の水素産生菌

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材料分析室利用研究成果その

XXVII(4)

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蓮井瑞尚

_{・小林健太}

_・斎藤貴

１工学部応用化学科

工学研究科博士前期課程応用化学・バイオサイエンス専攻

Hydrogen producing organism in hot spring

―Research works accomplished by using materials analysis facilities :XXVII(4)―

Mizunao HASUI1_{, Kenta KOBAYASHI}2_{, Takashi SAITO}1

Abstract

In recently, development of the energy not to use the fossil fuel has been demanded, and hydrogen attracts attention as a clean energy. However, some problems are left about H2 manufacturing method. The final

aim in this study is to obtain hydrogen-producing bacteria having high hydrogen-producing ability. As a pre-stage, we searched bacteria that produce hydrogen by metagenomic analysis for microorganism in hot spring water as one of search sources. 3 samples of hot spring water in Kanagawa and 6 samples in Shizuoka were analyzed for hydrogen-producing bacteria. As a result, two hydrogen-producing bacteria were detected in the hot spring water in Shizuoka.

Keywords: hydrogen producing organism, hot spring, metagenomic analysis _まえがきクリーンエネルギーとは、電気や熱に変えても、二酸化炭素_(CO2)や窒素酸化物(NOX)などの汚染物質を排出しない、またはそれらの物質の排出が相対的に少ないエネルギー源を言う。わが国では、高度経済成長期以降、大気汚染などによる人の健康や自然環境への影響が社会問題となり、クリーンエネルギーの開発及び導入が進められている。本研究は、クリーンエネルギーの中でもバイオマスエネルギーに着目した。温泉水に含まれる水素産生菌の水素発酵を利用した水素の製造法は発案されているが、温泉源水中の水素産生菌の定性的解析や単離、培養に関する報告はほとんどない。1,2)_{そこで温泉水の培養を行い、増殖した微生} 物群に対してメタゲノム解析を行い、水素産生菌の探索を行った。その内、培養中に水素ガスが確認された場合、単離・培養を行い水素産生菌の遺伝子的同定を行った。 _{実験装置および測定方法} 温泉水に生育している菌の中から水素産生菌を得るために集積培養方法を用いて、嫌気性条件下で目的の水素産生菌が生育しやすい培地環境で培養を行った。3)_温泉源を Table 1 に示した。始めに、温泉水中に生息する微生物群の遺伝子解析を網羅的に行い、かつ水素産生菌の存在を知るために、メタゲノム解析を行った。さらに、集積培養により温泉水中の水素産生菌による水素の産生を確認するため、_{GC-TCD を用いて水素の測定を行った。そして、水} 素産生が認められた場合、単離することで水素産生菌の取得を試みた。その後、単離したコロニーを再度培養し、_16S rDNA 遺伝子的同定を行うことで、水素産生菌の菌株名を確認した。さらに、淘汰培養を行い水素産生菌を得た後、水素産生能の評価を行うため、回分培養による連続培養を行い、水素、メタン、二酸化炭素の発生量、pH、菌体濃度および、波長660 nm での光学的濃度(OD660)の経時的挙動を測定した。4,5) [研究論文] 温泉水中の水素産生菌（蓮井・小林・斎藤） 37

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Table 1 Hot spring water Hot spring name Sampling place Spring quality A 湯元館神奈川県アルカリ性単純温泉 B 信玄館神奈川県アルカリ性単純温泉 C ぶなの館神奈川県アルカリ性単純温泉 D 熱川静岡県塩化物・硫酸塩温泉 E 花吹雪静岡県塩化物・硫酸塩温泉 F ヘルシーパーク裾野静岡県カルシウム・ナトリウム塩化物温泉実験結果と考察温泉水中の集積培養を行い、水素を産生している培地から水素産生菌の単離を行ったところ、地点C から得られた菌株 C は嫌気性条件下のみで培養されたことから絶対嫌気性であり、一方、地点_{D の菌株 D は通性嫌気性菌で} あった。また、単離・培養で得られた菌体が水素産生菌か判断するために淘汰培養を行い、水素産生菌の選出を行い、水素産生能を評価した。その結果、菌体_{C、D ともに培養} 時間の経過とともに液体培地の濁度が上昇していることから、菌の増殖が確認された。また、培養中に気泡の発生が確認されたため、測定したところ、水素が確認されたことから、菌株C、D は水素産生菌であることが分かった。水素産生菌である菌体C および D について、水素産生能の評価を行った結果をTable 2 に示した。 C 株では、培養 31 時間後、デュラン瓶の液体培地 500 ml から計 273 ml、D 株は嫌気性条件下では、培養 24 時間で計47 ml、好気性条件下は、培養 24 時間で計 107.8 ml の水素が発生した。Table 2 はD(+)グルコースを標準物質としたフェノール硫酸法により分析した結果である。各菌株の水素産生能は、C 株が 0.85 mol-H2 /mol-glucose となった。D 株の好気性及び嫌気性条件下では、それぞれ_{0.15 及び 0.34 mol-H}2/mol-glucose となった。淘汰培養により水素産生菌と判別された_{C 株と D 株に} ついて_{16S rDNA 解析を行った。C 株の 16S rDNA 遺} 伝子解析結果をTable 3 に、D 株を Table 4 に示した。また、_{Fig.1 と Fig.2 は C 株 D 株それぞれの分子系統樹} である。_{Fig.3 は C 株に関する SEM 像である。SEM で} 観察したところ、形状は円筒状の桿菌で直径218 nm、長さ648 nm であることが分かった。

以上のことより、_{C 株は}Clostridium diolisであり、 D 株はEnterobacter ludwigiiであることが明らかとなった。

Table 2 Hydrogen-producing ability of hydrogen-producing bacteria, substrate resolution rate and

accumulation of hydrogen production Strain/Growth condition Hydrogen-producing ability [mol-H2 /mol-glucose] substrate resolution rate [%] accumulation of hydrogen production [mL] C/under anaerobic condition 0.85 94.6 273 D/ under aerobic condition 0.15 93.5 47 D/ under anaerobic condition 0.35 92.1 107.8

Table 3 Gene analysis results for C strain Strain name Total

score Homology [%] Clostridium diolis SH1 1299 95 Clostridium beijerinckii McCoyA67 1297 95 Clostridium roseum 1997 95

Fig.1 Molecular genealogical tree for C strain Table 4 Gene analysis results for D strain

Starain name Total score

Homology [%]

Enterobacter ludwigii EN-119

1413 98

Enterobacter cloacae sub sp. Dissolvens LMG 2683

1406 98

Enterobacter cloacae 279-56 1404 98 神奈川工科大学研究報告　B‐41（2017）

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Fig.2 Molecular genealogical tree for D strain

Fig.3 SEM for C strain

まとめ

今回、温泉源水より2 種類の水素産生菌を取得することに成功した。遺伝子学的同定より_{C 株は}Clostridium

diolis、D 株はEnterobacter ludwigiiであることが分かった。また、D(+)グルコースの分解量から水素産生能を評価したところ、C 株は 0.85 mol-H2/mol-glucose であり、当研究室でこれまで取得した水素産生菌の中で、同培養条件の下で最も水素産生能の高い菌株を取得できた。以上より、温泉源水についてメタゲノム解析による水素産生菌の探索を行い、取得した水素産生菌の遺伝子的同定と水素産生能の評価を行うことができ水素産生菌を取得できた。参考文献木村浩之：地下圏微生物を利用した新エネルギー生産システム今中忠行：超好熱菌による廃棄バイオマスからの連続水素生産環境テクノロジー学会誌別府輝彦：バイオテクノロジーテキストシリーズ新・微生物学河野孝志和田克士李玉友野池達也：有機性廃棄物からの嫌気性水素発酵に及ぼす有機酸濃度の影響水環境学会誌上村毅小西仁微生物による水素製造法水素発酵第巻第号温泉水中の水素産生菌（蓮井・小林・斎藤） 39

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