哺乳動物ヘキソキナーゼの遺伝子構造と機能

(1)

/

H

甫乳動物ヘキソキナーゼの

遺伝子構造と機能

履歴書

論文目録

論文内容要旨

小暮健太朗

P

(2)

機式6 論文目録報告甲薬第

2

1 号￨氏名￨小暮健太朗

番号

'一

学位論文題目 _{晴乳動物ヘキソキナーゼの遺伝子構造と機能} 公刊論文 1. iEvolution of the type11hexokinase gene by duplication and fusion of the glucokinase gene with conservation of its organizationJ Kogure，

K

.

， Shinohara， Y.， and Terada， H. J. Biol. Chem.， 268(12)， 8422-8424， (1993) 2. iS.teady state transcript levels of the type11hexokinase and type 1 glucose transporter in human tumor cell linesJ Shinohara， Y.， Yamamoto，

K

.

， Kogure，

K

.

， Ichihara， J.， and Terada， H. Cancer Lett.，投稿中 3. iAlteration of enzyme function of hexokinase C-terminal half by replacements of restricted regions with corresponding regions of glucokinaseJ Kogure，

K

.

， Shinohara， Y.， and Terada， H. J. Biol.Chem.，投稿中公刊参考論文 1. iInitiation of lipid peroxidation in rat liver mitochondria by chelated iron-oxygen complexesJ Kawano， H.， Fukuzawa， K.， Kogure， K.， and Terada， H. J. Clin. Biochem. Nutr.，

1

1 .

.

21-30， (1991) 2. iSpermine accelerates iron-induced lipid peroxidation in mitochondria by modification of membrane surface chargeJ Kogure， K.， Fukuzawa，

K

.

， Kawano， H.， and Terada， H. Free Rad. Biol.Med.，

1

1 _

， 501-507， J)993)

(3)

版式6 報告番号甲薬第論文目録

2

1

号￨氏名

小暮健太朗

学位論文題目晴乳動物ヘキソキナーゼの遺伝子構造と機能 3. IEffect of inorganic phosphate on iron-induced lipid peroxidation in rat liver mitochondriaJ Kawano， H.， Kogure， K.， Fukuzawa， K.， and Terada， H. Biol.Pharm. Bull.， 16(11). 1094-1098. (1993) 4. IStructural basis of potent antiperoxidation activity of the tr)terpene celastrol in mitochondria: effect of negative membrane surface charge on lipid peroxidationJ Sassa， H.， Kogure. K.， Takaishi.Y.， and Terada， H. Free Rad. Biol.Med.. 印刷中その他(総説・単行本等〉 1.

I

微小差スペクトルによる生物試料の分析」小暮健太朗、寺田弘病態生理、 9(11)，858-863， (1990)

2 .

r

抗酸化剤としての感光色素」小暮健太朗、寺田弘 Fragrance Journal.n(7)， 100-104.. (1993)

- 一

(4)

.司

一一

械式

7

論文内容要旨報告番号￨甲薬第

2

1

号￨氏名

_{小暮健太朗}

学位論文題目 I

~南乳動物ヘキソキナーゼの遺伝子構造と機能

内容要旨ヘキソキナーゼは、グルコースを含むヘキソースの6位リン酸化を触媒する解糖系の律速酵素である . 晴乳動物に存在する 4種類のアイソザイムのうち、

I

.

m

型はおよそ 100kDaの非常に相向性の高い一本鎖ポリペプチドにより構成されている.これら 3種のアイソザイムは、それぞれ相向性の高， 2し本の 50kDaポリペプチドが重複・連結した形で構成されている. 一方、 W型 (グルコキナーゼ〉は約 50kDaの一本鎖ポリペプチドであり、 100kDaヘキソキナーゼにみられる重複構造の N-末端側半分および

c

-

末端側半分各々と相向性がきわめて高いことから、

I

.

m

型の 100kDaヘキソキナーゼは、 50kDaの先祖へ牛ソキナーゼが、一方で変異を経てグルコキナーゼなどの 50kDaヘキソキナーゼ遺伝子に、もう一方では、先祖遺伝子が重複と融合を経て 100kDaヘキソキナーゼに、進化したのではないかと従来考えられていた. しかしなが.ら、 100kDaへ牛ソキナーゼの遺伝子構造はこれまで解析されておらず、したがって、先祖ヘキソキナーゼの遺伝子重複による進化説は、推測の域を出ていなかった. そこで申請者は、すでに報告されている 100kDaラット H型ヘキソキナーゼをコードするcDNAの塩基配列をもとに作製したプロープを用いて、ラット肝臓ゲノムライブラリーのスクリーニングをおこない、ラット H型ヘキソキナーゼ遺伝子の一部分を得ることに成功した . その解析により明らかになった 100kDaIl 型ヘキソキナーゼ遺伝子の部分構造と、 50kDaグルコキナーゼ遺伝子の構造とを比較した結果、両遺伝子の対応するエクソンの長さ、およびイントロン挿入部位が完全に一致することを見い出した. さらにヒトの E型ヘキソキナーゼ遺伝子についても単離・解析を行いヒトグルコキナーゼ遺伝子の構造と比較したところ、ラットの場合と同様の結果が得られた.これらのことより、 100kDaヘキソキナーゼ遺伝子は、 2つの 50kDaグルコキナーゼ遺伝子からその構造を保存し

(5)

た形で重複と融合を経て進化したことが強く示唆された . このような進化を経て形成された附乳動物ヘキソキナーゼの 4極のアイソザイムは、 1次構造上の相向性が非常に高いにもかかわらず、その機能的性質は大きく異なることが知られている . すなわち、グルコキナーゼのグルコースに対するKm値は、 1----皿型ヘキソキナーゼの 100倍以上もの高い値を示し、特に反応生成物であるグルコース 6リン酸 (Glc-6-P)によって、 100kDaヘキソキナーゼは反応が阻害されるが、グルコキナーゼは阻害されない . そこで、相向性の高いヘキソキナーゼアイソザイム間における、このような機能的性質の違いを決定する構造的特徴の解明を目的として以下の研究を行った. これまでの報告から、 100kDaヘキソキナーゼの機能的性質は、その重複構造の C-末端側半分が担っていることが明かにされている. したがって、本研究では 100kDaラット H型ヘキソキナーゼの 50kDaC末端個JI半分 (HKC)に着目し、遺伝子工学的方法によって変異 HKCタンパク質を作製し、その機能的性質を HKCと比較することにより、研究目的の達成を試みた.具体的には、 HKCのアミノ酸配列を変えることなく数種の制限酵素認識部位を導入した cDNAを作製し、その HKCのcDNA中の ATPおよびグルコースとの結合推定部位を含む領域と、グルコキナーゼ cDNA中の相当する領域とをカセット的に置き換えることにより、 50kDaキメラヘキソキナーゼ cDNAを構築した . この組換え HKCのcDNAを取り込ませた大腸菌において、人為的にキメラ HKCタンパク質を発現させ、その機能解析を行なった結果、グルコースとの結合には広い範囲の立体構造が、逆に ATPとの結合には極めて限定された領域の構造が重要であることが明らかになった.また、 GlcートPによる阻害反応は、 HKC中のATP結合推定部位を含む領域をグルコキナーゼ中の相当する領域と置き換えることによって著しく低下した.

(6)

日南乳動物ヘキソキナーゼの

遺伝子構造と機能

1 9 9 4 年

(7)

②

日甫乳動物ヘキソキナーゼの

遺伝子構造と機能

1 9 9 4年

(8)

2 .

2

結果

2 .

6

新仮説に基づいて予測した

2.

2 .

7

フツ 2.

3

考察・参考文献イントロン挿入位置の確認・・・・・・

1

7

トE型ヘキソキナーゼの遺伝子構造の推定・

2

0 .

2

2 ・2

5 回

一一

一

時

一

ー

圃

4

(9)

第

3

章ヒト H型ヘキソキナーゼ遺伝子の単離および解析・・・・・・

2

7 -

-

3

1

第

5

章総括ヘキソキナーゼアイソザイムの進化とその役割分担・・・・・

4

9 -

-

5

3

3 .

1

序論・

3 .

2

結果

3 .

2 .

1

ヒト H型ヘキソキナーゼ遺伝子の

• 2

7 3. 2

.

2 PCR

法によるヒト H型ヘキソキナーゼ

c

D

N

A

断片の作製

•

2

8 ・

3

0 ・3

0

5 .

1

本研究の成果・・・・・・・・・・・・・・・・・・

4

9

5 .

2

何故アイソザイムの生じる必要があったのか ? ・・・

5

0

5 .

3

各アイソザイム分布組織におけるエネルギ一代謝の特徴・・・・・・

5

1

実験の部・・・・・・ . . . ・・・・・・・

5

5 -

-5

9

4 .

1 序論・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

3

2

4 .

2

結果

4 .

2 .

1 H

K

C

をコードする

c

D

N

A

の構築・・・・・・・・・

3

4.

断片の調製・・・・・・・・・・・・・

5

6

2 .

4 H

K

C

およびキメラ

H

K

C

構築のための

c

D

N

A

断片の調製・・・・・・・

5

6

2 .

5 H

K

C

およびキメラ

H

K

C

をコードする

c

D

N

A

の構築・・・

5

7

2 .

6 H

K

C

およびキメラ

H

K

C

の発現と大腸菌抽出液の調製・

5

7

4 .

2 .

4

キメラ

H

K

C

をコードする

c

D

N

A

の構築と大腸菌におけるキメラ

H

K

C

の産生・

4 .

2 .

5

大腸菌抽出液中のキメラ

H

K

C

の機能解析 4.

3

考察・参考文献

• 4

1

・

4

1 ・

4

3 • 4

8

2 .

7

大腸菌抽出液からの

H

K

C

の精製 2.

8

ヘキソキナーゼ活性の測定・参考文献

• 5

8 ・

5

8 ・

5

9

(10)

緒言

章

第

1

ヘキソキナーゼの機能的性質と構造的特徴グルコは、

6

位一リン酸転移酵素 ) (ATP:D-ヘキソースヘキソキナーゼ ATPの 7一位リン酸を転移ースをはじめとするヘキソースの

6

位水酸基に、解糖系における律速酵グルコース

-

6 -

リン酸を生成する酵素であり、し、クロマ晴乳動物のヘキソキナーゼ

(

E

C

2 .

7 .

l

.

1 )

は、素のひとつである (

1 )

.

トグラフィ一時の溶出位置の違いから

4

種類存在することが確認されてお 8

，，

﹃。

， .

言・

ヨ也

、ヨ

-6 2

‘

80 0，5 ~ 0，3空 ~ 0.1

IV

60

‘

。

20

-E

、

z

-E

2 E

。

E

f

I uent yol un'、e

，

ml 図 1- 1 . ラット肝臓ホモジネートのDEAE-celluloseカラムによるクロマトグラム : 実線はタンパク質の溶出パターンを、点線は

N

a

Clの濃度勾配を、白丸

(0

) は O.

5ml

グルコース存在下における、黒丸 ( ・〉は

100mM

グルコース存在下におけるヘキソキナーゼ活性をそれぞれ示している (

1 )

.

300 250 200 150 100 50

。

溶出位置の速い順に I--IV型あるいはしくは A--D型として〈図 1-1)

、

り

この

4

種のヘキソキナーゼの表 1

-

1

にまとめたように、呼ばれている (

1 )

.

様々なヘキソースグルコースに対するミカエリス・メンテン定数

K

m

が非常に小 1--皿型は

100kDa

の一本鎖ポリペプチドであり、を基質とし、うち、

(11)

100 - 1 . ラットヘキソキナーゼアイソザイムの機能的性質および嫌造的特徴(2) 表

1 、

_、

、

_、

、

_、

、

_。

、

s

、

・

.

_

ー

0-80

IV

1

1 H

e

x

o

k

i

n

a

s

e

1

60 40

g

E

﹀﹄ 0 ↑

c ω υ

﹄山 w n 比

P

a

r

a

m

e

t

e

r

K

"，

g

l

u

c

o

s

e

K

"，

ATP

K

j

g

l

u

c

o

s

e

6 -

P

v

s

g

l

u

c

o

s

e

v

s

ATP

4 .

5

0.49 60

1

5 A

p

a

r

e

n

t

k

i

n

e

t

i

c

o

n

s

t

a

n

t

s

(mM)

0.13 0.02 0.70 1.29 0.92 0.074 0.1-6 0.021 0.04

0 .

4

2

0.21 0.026 100 ー. 10 0.1 0.01 0.001 20

。

0.2 0.8

0 .

4 S

u

b

s

t

r

a

t

e

s

p

e

c

i

f

i

c

i

t

i

e

l

e

c

u

l

a

r

w

e

i

g

h

t

s

96，α泊 99，5

∞

96.0

∞

98α沿 98，0

∞

98.0

∞

N

a

t

i

v

e

S

u

b

u

n

i

t

図 1-

2 .

ラットヘキソキナーゼアイソザイムのグルコース温度に対する比活性 : 図

1 .

と同じく

A

，

s

，

C

，

D

，はそれぞれ

I

-

I

V

型に相当する (

1 )

.

H

e

p

a

t

o

c

y

t

e

s

T

i

s

u

e

d

i

s

t

r

i

b

u

t

i

o

n

U

b

i

q

u

i

t

o

u

s

L

i

v

e

r

M

u

s

c

l

e

Kidney

A

d

i

p

o

c

y

t

e

s

U

b

i

q

u

i

t

o

u

s

B

r

a

i

n

Kidney

その分子量およびグルコースに対する

K

m

値の違いなどから大キナーゼ、は、

P

h

y

s

i

o

l

o

g

i

c

a

l

r

e

g

u

l

a

t

i

o

n

I

n

s

u

l

i

n

K

i

n

e

t

i

c

G

l

u

c

o

s

e

f

e

a

t

u

r

e

s

これら両者間の最も大きな機能的性質の違い別されているわけであるが、

G

l

u

c

o

s

e

I

n

s

u

l

i

n

K

i

n

e

t

i

c

f

e

a

t

u

r

e

s

R

e

v

e

r

s

i

b

l

e

s

u

b

c

e

l

u

l

a

r

l

o

c

a

t

i

o

n

6-リン酸 (Glc-6-P)によるグルコースリンヘキソキナーゼは低濃度のすなわち、酸化反応阻害の有無が挙げられる . 反応生成物グルコースとして、グルコキナーゼは低濃度Glc-6-Pに Glc-6-Pによって反応が阻害されるが、ヘキこのように、ン酸化反応が阻害されない (1-3). よってグjレコースリ

Km

ヘキソキナーゼことから

l

o

w

さいくおよそ

1

0 -

1

_--10-

3

_mM)

_(図

₁

_-

₂

₎

分子質量およびその機能的性質が大きソキナーゼとグルコキナーゼとは、グ W型は

50kDa

の一本鎖ポリペプチドであり、一方、とも呼ばれている . 近年の各アイソザイム cDNAのクローニングによりく 4 く異なってはいるが、 ( この性質からグルコキナーゼとも呼ばルコースに対する糖特異性を有しアイソザイム間における 1次構造の相同性が極めて高いことが明ら -12)

、

それに対する

Km

値も本論文中ではグルコキナーゼと呼ぶ〉、以降、れる、グルコキナーゼや

50kDa

特に

100kDa

ヘキソキナーゼは、かにされている .

K

m

ヘキソキナーゼとも 1 _ ，皿型とは対照的にhigh 大きく ( およそ

10mM)

、酵母ヘキソキナーゼと相同性の高し、

50kDa

ポリペプチド鎖が

2

本重複・連結グルコキナそのため

100kDa

ヘキソキナーゼ、は、した形で構成されている . 〈以降特に断わとグノレコ 1--阻型ヘキソキナーゼヘキソキナーゼは

I--m

型ヘキソキナーゼを指す ) このように、呼ばれている

(

2 )

.

らなし、限り、 n δ 2

(12)

噂

ーゼや酵母ヘキソキナーゼ様の子の重複と融合を経て進化したのではないかと考えられている

5

0 k

D

a

ヘキソキナーゼを先祖として、遺伝

(

4 -

1

2 )

.

しかしながら、ヘキソキナーゼの進化仮説については、その明確な証拠が得られていないために、未だに推測の域を脱していない . 上述のように、

4

種のヘキソキナーゼアイソザイムは相向性が非常に高いにもかかわらず、その機能的性質が異なるため、数多くの研究者がその機能的性質を決定付けている構造的特徴の解明に取り組んできた.

Stei

t

z

らのグループは、酵母ヘキソキナーゼのX線結晶解析を行ない、ヘキソキナーゼ分子内のグルコース結合部位

(

S

e

r

-

1

5

8

、

A

s

p

-

2

1

、

G

l

u

-

2

6

9

、

G

l

u

-

3

0

2 )

(

1

3 )

、およびグルコースリン酸化反応に伴うヘキソキナーゼの立体構造変化の様式 ( 図 1-3)を報告している (3). また最近では、ヘキソキナーゼ

c

D

N

A

に点変異を導入し、大腸菌で人為的に発現させたヘキソキナーゼ変異体の機能解析から、基質 ( グルコースおよび

A

T

P

)

との結合やリン酸化反応に重要なアミノ酸残基を推定したものが、いくつか報告されている (

1

4 .

1

5 )

.

しかしながら、ヘキソキナーゼの機能的性質を決定する構造的特徴を " 解明 " するには至っておらず、特に

G

l

c

-

6 -

P

による反応阻害に関与する構造的特徴についての情報は未だほとんど得られていない . ( b)

1 .

2

生体におけるヘキソキナーゼの役割このような構造的及び機能的特徴を持つヘキソキナーゼアイソザイムは、生体内における分布組織が異なることが知られている ( 表 1-1) . すなわち、 I型は、比較的糖代謝活性の盛んな脳、腎臓、などに

(

1 -

3

、

1

6 )

、 E 型は脂肪や骨格筋に

(

1 -

3 .

1

6 )

、E型はその生理的役割および分布組織がよくわかっていないが、一部がん細胞や正常細胞の核膜に存在が認められたという報告がある (

1

7 )

.

グルコキナーゼは肝臓とすい臓 β細胞にのみ特異的に存在することが知られている

(

1 -

3 )

.

脳や腎臓に分布している I型ヘキソキナーゼは、ミトコンドリア外膜に結合し ( 図 1

-

4 )

、ミトコンドリア内部で生成された

A

T

P

を効率よく利用図 1-

3 .

歯車母ヘキソキナーゼと基質 ( グルコース ) との結合様式のモデル図 :a)解離状態、 b)結合状態(3) 4 - F h J V

(13)

M ITOCHONOR ION CYTOSOL Glc -6-P (tト一一一一 ← 一一一-1 I VIO 1 PPP uo

哩乙

F447:C1.6-P2lf) Rib'5-pr---J A/+TrIoses I Tr iose-P i ↓ IC'" 1--→Pyruvote PRPP (f) Lipid ;

!

: B iosynthesis: Loc"tote

1 I

.

(t) R向A

I

ATP 、

。

nd'-

I

/from G Iycolysis¥ O N A " I I and J (t)

" 1

八 TCACycleノ Cell Oivision

a

Growth 図 1

-

4 .

ミトコンドリア結合性ヘキソキナーゼと細胞内糖代謝との関係犠式図

(

1

8 )

.

することにより、これら組織の高い糖代謝活性をまかなっていると考えられているく

1

8 )

.

Jilsonらのグループは、 I型ヘキソキナーゼが結合しているミトコンドリアを、キモトリプシンで処理し

N

-

末端アミノ酸

9

残基を切除することにより、ヘキソキナーゼがミトコンドリアから脱離したという結果を得ている . このことから彼らは、 I型ヘキソキナーゼはその疎水性 N-末端部分を錨のようにミトコンドリア外膜に埋め込むことにより結合しているのではないかと推察している

(

1

9 -

ところで、がん細胞は、脳の

1

0

(

2

，

2

3 )

.

1.

3

研究の目的このように、構造的に相向性の高いヘキソキナーゼアイソザイム聞において、機能的性質や分布組織が大きく異なることから、それぞれのアイソザイムは生体内において何らかの役割分担をしていることが予想される . 一 7

(14)

-したがって、その役割を分担するに至った経緯と理由を明らかにすることにより、生体特にがん組織におけるエネルギ一代謝や穂尿病の原因を考えるうえにおいて非常に重要かつ興味深い情報を得ることができると思われる . そのため本研究は、これらアイソザイムの生じた経緯、すなわち進化と、それらの機能的性質を決定している構造的な特徴の解明を目的とし、併せてヘキソキナーゼ各アイソザイムの存在意義 ( 役割分担〉について考察を行なった . . 考文献

1.

Ureta

，

T

.

(

1

9

7

5 )

i

n

!sozy.e 111; Develop.ental Biology

Olarkert

，

C

.

L..

Ed.)

，

pp.575

-

6

0

2

，

Academic Press

，

New Y

o

r

k

.

NY

2 .

Ureta

， T.

(1982)

Co.p. Bioche.. Physiol.

7

1

8

，

549 -

555

3 .

lilson.

1.

E

.

(1984) i

n

Begu1ation 01 Carbohydrate J/etab01isl1

(

B

e

i

t

n

e

r

，

R

.

，

E

d

.

)

.

V

o

1.

1

，

p

.

4

5 -

8

5

，

.

(1989)

Proc. Natl. Acad. Sci.

5 .

365 -

3

7

0

7 .

Thelen. A

.

P

.

，

and lilson

， 1.

E

.

(1991)

2

8

6 .

645 -

6

5

1

8 .

，

363 -

3

6

9

9 .

Nishi

，

S

.

，

Seino

，

S

.

，

and B

e

l

，l

G

.

1.

(1988)

Biochell. Biophys.

Bes. Co..un.

1

5

7

，

9

3

7 -

and Jilson

， J.

E

.

(1990)

2

7

，

26-34

1

2 .

l

truda

，

F

1

9

3 -

1

9

1

3 .

Bennett

，

1 .

S

.

，

and Stei t

z

， T.

A

.

(1980)

J

.

1101. Bi01. 140，

2

1

1 -

230

8

-1

4 .

J

.

Biol. Che..

2

6

，

5359

-

5362

1

5 .

Arora

，

K

.

K

.

，

Filburn

，

C

.

R

.

，

and Pedersen

，

P

.

L.

(

1

993 )

J.

Biol. Che..

2

6

8

，

1

8

2

5

9 -

18266

1

6 .

Grossbard

， L.，

and Schimke

，

R

.

T.

(1966)

J. BioJ. Che.. 241，

3546

-

3560

1

7 .

Prel1er

，

A

.

，

and Jilson

， J.

E

.

(1992)

2

9

4 .

482 -

492

1

8 .

Arora

，

K

.

K

.

，

and Pedersen

，

P

.

L

.

(1988)

J. Biol. Che.. 263，

17422

-

17428

1

9 .

Polakis

，

P

.

G

.

，

and Jilson

， 1.

E

.

(1985)

236

，

328 -

337

2

0 .

Xie

，

G

.

，

and Jilson

， 1.

E

.

(1988)

Arch. Bioche.. Biophys. 267，

2

2 .

Shatton

，

J

.

B

.

Morris

，

H

.

P

.

and feinhouse

，

S

.

(1969)

Cancer

Bes.

2

9

，

1161-1172

2

3 .

Sato

，

S

.

E

.

(1967)

Endcrinol

-ogy

8

1

，

1

3

9

7 -

1

4

0

4

2

5 .

Frank

，

S

.

K

.

，

and

Fromm

，

H

.

J

.

(1986)

249

，

6

1 -

6

9

2

6 . f

a

1 t

e

r

s

，

E

.

，

a

n

d M

c

L

e

a

n

，

P

.

(

1

9

6

8 )

B

i

0

c

h

e

.

J.

1

0

9

，

7

3

7 -

7

4

1

2

7 .

.

(1981)

J.

Biol. Chel1.

2

5

6

，

8699

-

8704

2

8 .

Arora

，

K

.

(1974)

N

.

，

August

， 1. T.，

and Horecker

，

B

.

L

.

Arch. Biochel1. Biophys.

1 &

5

，

2

4

0 -

2

4

6 V

.

7

，1

4129

-

4132

M

.

，

Singh

，

V

.

N

.

，

August

， ].

T

.

，

and Horecker

，

B

.

L.

J. Cell. Physiol.

9

1

，

2

8

5 -

2

9

2

-9

-4・圃圃圃・圃圃園田園一----一一一ー一一一ー一一一ー一一一一一一一一一一一一一一一ー一一一一一一一一一一一一一一一一一一ー一ー一一一一一一一

(15)

第

2 章ラット

H

型ヘキソキナーゼ遺伝子

の単離および解析

ゼをコードする遺伝子が、一方で変異を経て酵母ヘキソキナーゼやグルコキナーゼなどの低分子質量

(50kDa)

ヘキソキナーゼ遺伝子に、他方では、先祖遺伝子が重複と融合を経て

100kDa

の高分子質量ヘキソキナーゼに、それぞれ進化したのではないかと従来考えられている ( 図 2-2) (1-9). 2.

1

序緒言においても述べたが、

4

種類存在する、崎乳動物ヘキソキナーゼアイソザイムのうち、 I'""-'m型はおよそ

100kDa

の分子質量を有する非常に相同性の高い一本鎖ポリペプチドである三とがcDNAの解析から明らかにされている ( 図

2 -

1 )

(

1 -

4 )

.

さらに、これら

3

種の

lOOkDa

ヘキソキナーゼは

An

c

e

s

t

r

a

l

50 kDa

H

e

x

o

k

i

n

a

s

e

N

_C

昨

l

u

t

a

t

i

o

n

d

u

p

l

i

c

a

t

i

o

n

Hexokinase Type 1

-

1

1 ₁

₀

kD

a

Hexokinase Type IV (

G

l

u

c

o

k

i

n

a

s

e

)

N~~総総齢、~c

50 kDa

_{50 kD}

_a

_G

_l

_u

_c

_o

_k

_i

_n

_a

_s

_e

₁

₀

_kD

_a

_H

_e

_x

_o

_k

_i

_n

_a

_s

_e

Y

e

a

s

t

Hexokinase

図 2

-

2 .

従来提唱されているヘキソキナーゼ進化仮説の模式図

N

_C

_50kDa

図

2-1

.

ラットヘキソキナーゼアイソザイムおよび酵母ヘキソキナーゼのサイズの比較近年、酵母ヘキソキナーゼおよびグルコキナーゼについては、その遺伝子の詳細な構造解析がなされいるが

(

l

O

.l 1 ) 、残念ながら、高分子質量

(

1

0 OkDa)

ヘキソキナーゼに関しては、その遺伝子構造の解析が未だされていない. したがって、その進化を遺伝子レベルで議論することは不可能であるため、上述したようなヘキソキナーゼの遺伝子重複による進化説は、推測の域を出ていない . そこで、我々は

lOOkDa

ヘキソキナーゼの進化について、遺伝子レベルにおいて検討することを目的として、ラットの

100kDa

ヘキソキナーゼ遺伝子の単離・解析を行なった . 極めて相同性の高い

50kDa

ポリペプチドが

2

本連結した形で構成されていることが知られている

(

1 -

4 )

.

一方、時乳動物グルコキナーゼは酵母ヘキソキナーゼと同じ約

50kDa

の一本鎖ポリペプチドであり、崎乳動物の

100kDa

ヘキソキナーゼアイソザイムの重複構造における N-末端側半分および

c

-

末端側半分各々と相向性が非常に高いことが報告されている (5). これらの

ことから、 I'""-'ffi型の

100kDa

ヘキソキナーゼは、

50kDa

先祖ヘキソキナー

10 -E E ・ E ・ -E ， ‘ . .

(16)

2.

2

結果 2.

2 .

1

スクリーニングプロープの作製ラットのゲノム DNAライブラリーからヘキソキナーゼ遺伝子を単離するために、まずスクリーニング

7ロープを作製した .

図 2-3は、ラット各組織およびラット腹水がん細胞株AH130における I

A

B

_C

m w U 同庁 ω 日刊日初日刊訂即 U 叩げ ω M m w ∞ UMNnωUM 刊日初口日 nuMU07 仙 7 m w ∞ 7MNnωMM 刊ロ初げ刊行副 ω 竹 U m げ O M m w ∞ ゆ川 H N U N 乃和制 1 2 3 4 3 1 6 1 7 1 8 2 9 2 W 2 m 3 け 3 門 M 3 U 3 N 4 刊リ 4 U T げ引 m s V ・ ' w ω m a n 一 M E ，

bq

，

μ7お7おsuμmaMAvmmhxnuhku m m m m h m 川氏 m m m m 川口町如氏 m m 山内総伐印刷惚民民間以司剛山川川町制剣山川一 m m 終日川川守， F ・、 -p u -内戸 u ' a ，， . . 岡山川 m m m h M M m 一M m h 仰向山町山一 m p w 叫ん川町山川凶川川刷 M 州知山凶山川 m m 川山一川町内側一山山川 ω ω 一印刷川附附川 m 川町 JUmm 一 M M m m 川 ⋮ ω ⋮ 山川 E G -C T r ・ -GI C C C S A F e r c e E U T F T n c r T Y E r c u c g c a G S E V G S T D C e T s c u c s A F A u -c u G E A r G Y E t -s 一 G Y T A C C I T C E A s c h c h T l T e G e A S A Y G I G E T e c r c t A Y ι l A Y c r T h A 1 T E G V E h A l -1 e T e c h G I T e A -1 -E l T A A C G E T C C H A T A T A l E L A S A A T T G G A S E t C A G A A L E G A L E P T P E H T L T E A T G G 一E L A N A I G G A H C H 一 C G E E C A T I C E -A A -I A T T C F T O A Y C P G S E r G I C S E P T e A U G t A a c r T P G u c a c n G t T O C V E P E t -F L E E Y G S A U C Y T U -r E C C E T T C C A y c r G I A S A V E e I a E Y A S T l A i I e c t A V A S T e E l A S T e r ﹄﹁ G I A S T E -c y c t A Y T e G I T e -G e T I C C 6 1 7 A T T E P E E E A A L T S E V T E C A A -c c A M G A T T G A C L E A A A A H C P G G G A A H 一 T C C G A L E L C G E L -A S E C G E T T 1 ι -E C 1 C C A T E C U E S A Y G u c s G S G I C a c p G t A O G u c s c -G U T r c t A F T -G U T F T n E r -c v c r C U E S A a c s -C Y T -T A A E C -e A B C I A -A Y A Y T a c l A S T e c r T e E Y r a A l c e T a c h T a T e c e A S A Y 一心 A G e -e A i c l A Y -G I -G C A -T C C L E H G E G E A L A L G V G A G a R A M C P E L T C G V G G T S G V A I C V C L T S A A T T 一 C C A S E L E H C A A L 一 C G C E C E C T T E -C E T C T I C A T e G r T U T O G u c a E C a c n G Y G s c r c e G U E r f r G U G a A Y G u c r A a G I C S -T n c e c g E g C Y T r -c P T C A C T I G C r h c h T e E F A i r h E i A S G I A Y c e T i r e c c c e A l C I G -A I C e c -a G V -A 5 7 1 G r G r c l A V -A S C C A T C T A C T P A T C L E P E C T P G A A A G G A L A S A I C L I S T S G G G A G G G G T S G A G V T C -A A A l E A E A G G T T 一 G A T T A G I T - R ，， -ー -PL?BAmp ・、 V A ' P L H M M M U 肘日叩日凶 M n 日 w m u 日 U H M M M 代制 M M U 町民いリ日円印刷 M 凶 M W M L m m d 引 M H m 剖氏同一ば叩 m M M M m ω u n 印刷一叫凶行 α 刈仏日 H G T C G A T C A A -A L C G G V A S T P G G C L C G A S G C C A C L C H G G C G G V A L G V G A -G A A M G G C L T C C L 一 G G C T G G G T G E -i l l -C A T A C T T -c p I a c u c a E e G S I e C Y E a -e A s c r c a I p c u c r G ﹁ T U A o c y c e c a c n -G Y G E A r C E C u I r -c r G A T T A I 何日 ω “ 日以口ほ白川灯 M M W 灯ハ回以日似行内 M 切 M 川町仙川町臥師口 M M 山川日品川口同氏 U 何回以刊剛氏 umMM 一回以 M W 日比 UKMM 口凶 M 山一 k h ω α K M U H ' ' 守 a -F a -F ﹂ r u - R v a p u A I T -A Y T a c r A n T r c p T r A Y G U G Y C a G r c l c e G S G U T p c e E S A y -c r -T E G u c e c a G n G Y -A U A A A G G I 目印 UW 回引白川 M W M 以 M 山臥 M M m 回以 U U 回以内札制日 h u h 刊行内 M W U U M M M U M W 印引 U W M H 一円内 ω U M M は U 似 M N M 印 N U 一叫以 M 引 M ω ω 打 p u P E -ー -P I M F U P U P U -a 内 Y -A I G S A u c u E e A U G P T e C Y G P G n A n G S C 9 T Y C 9 G n E S G U C ﹁ G t G S G I A Y -A a c e c g T g A a c p -E u c I G A T G M 印 M W U U 口 U M H 口同 MhHMH 回目 UMhHU 引 UNMMW 目前印引目前以引 M U H U K K M h M W U U M 叫以一氏 M H 内白い削印い州日以臥 M 一口 U U H 印同日 H P U F U -! ー -P U P U T t A R -n y ' E A G n G y c e c n G S G F C P E l c u G s c e G U G r E E C -c g c r c a c r c y A r T P c r -A Y G g C Y T l T a c -c e c A A G A T 口 u u 日日以円内 U U M W 刊し日以前引胤臥以 M W H 内臥以 M 附 MMUUM 印 U M U 目白川 M W 印 U M m M M M 山一回以 MU 回以 U h 日以 uh 一行内同日目印 uu p U T E -マ a T E p u -R F L T E A C G I A S G u c n c p C I T e T e G E G Y E u c e c r C ﹁ T P c a c u G u c e G t c p c u c y 一 G P E n A g G n c g c y -c r c G T G A T E G T a A Y A I A S A S T a T h T i T e G I T e T l c e c h A S C I T e -e T I T e E r T e E l -G r A l G r A I G r G I -c e E T A G A T T C G V A L E G A A C A C V T P A I A N G C -L A I T S A T G A G A C L T L A l A N T T E L E G -T C E C A C G C A G G -T S A C T E E T E G -a A E T T T 似 m ω 山側仰凶川伊川町剛山山山川町凶 M M m h m 凶叫ん川 m 削山知 m M m 川町内川州制 - m 戸市川畑阿川町一川一仰山川附川 h m 凶叩川 m 山山一印刷旧制川川町川川 F U P U -a 内 A M m '

・

a R T ' A c c n G E T S G t c e T e G Y T Y c e c n G u y P T e c g c p c s G n c p c n G U C U T e T e -G t c y c u G u c a A r -c P A S -C T P U T m M M M 灯 h u . h M h n 内竹内目以回以川い M M 臥 N U U M M 日目前臥心的印刷日以臥 M M 前臥 N M 口 u n 内 MH 一 Mh 回以口 U 口 U 白川 Mm 一 ω M M h 剛 MMmM 円 GC 一 -G G h E C M m m ω 州側一山川 ω M M 削 - w 州・ m m h m 伽川凶 mh 川畑山山町・山町 h m 仙川 ω 仰向山一m m 川町凶山一山町凶一 M M m m m 川町一川町制 m 山山一 m m m m m m ⋮ 山川町 -P L マ t p h u p h w r u m 悶 MM 制 -m p m m 川町内側仙山川側仙川町 ⋮ m 知則 .MM 川町 -m m 川町制印刷 mM 叫 m m 相川町川町山附仙町内一印刷 M M m w m 凶 m 削刷ゆ一刷 . M m w m 州側 m m E G -F T T A C T T T C U E S G Y A g G U T P G n c s c g c y c a G u c e G U G u r a A U G U G u c p c r A g T l 一 T S C U G B E S T r c u -G o y a T C C C C I C T e c r G I G r T e A S A i G V G r G l c l A I T -A l T E E -A l A l A l A S G E E F T a -G Y T E G r G Y c h T e -c r c l T T T T G T T E L C A G E A A E L G A C G T E C A G E G A G G A 1 G G E L C A C C C C C E C A A S C A G V τ 9 C C L C A T C A I C L -c p G A C C A G G p u c -1 1 1 4 1 4 J E l -A A C T T mm 側仙 m h w 仰山仙 m M m 凶作山 M M 叫ん川川州川一開制 ω m 川卯山山川町凶 m 阿山町山川町内側山山川伊山一川畑町如川畑山川 m M M M 一町一山川一山悶悶川町制 -ー -Y E P -u p L ' v ' p h w A A G r G g G o c u A U A S T a G 円 G U C P G S T e c s c y G g T g E s c y c y T E C P C S T S 一G g T U G r c r G I C P -G U G g E c -A S M U M 山目前民計口ほ臥引 M W ぽ似日以臥川 U M M M W M H 印刷出 U M 灯印灯 M W 印引印 NMM 日以前印刷刊匂一四 U U 凶 MmMKUUMUM-口凶印灯臥口 UUM 叫 F M Y -l a 内 P ﹂ p u a 内 P U ヲ₂ G G c e c g T ﹁ C Y c a A ﹁ G S T P T P c e c l T P G r c s c -c r G t T P G E E S A U T e c s -A Y G u c e G u c u G u -T P c e G T T A E c m H 附 M U M m 白山町 M M 山川 M W M M U ・M M H U W 砧・ M M m M W 引い同 M W M h ω M M U_州刊匂 U M M H 白川一郎以臥引行内臥円 MUUMUu-NMMMHUH 凶臥以内山 G -E Y -Y ' p l w v ・ ' ' v s A A U T r A r T n c e c n E g T P A V E U G U G r c a c n A a T a A g A O G g G n c r G a T o -G U T P T P A e G S G Y -A g c g C A T E T T ⋮ 一 H H F H F H M M M H U U 目釘臥前日以臥引口 U F H H m 一 M M 白川町一白川町一叫釘白骨一目 U 日以 M U 山町川町計一一一凶日臥 - M 臥 -MMHHMU 回以一 M U 目前日日刊行町内山 -A ハ p u a n p u ・内 v ' T E S T e c g c p c s E s c e T r G U A g E e C I G -G U G S G I A g T r G s c l c n A u c p -G U G I C e G n G I T g 一 GICSGTAGGA m 刊向 M H M U 削臥れ印刷日 . h M H M W 臥日目 U M H U ぬ印刷臥引 M W 訂ぬ M U M 刊 M W U ぬ MM 臼引臥 M 一仙以町山肝ハ u u u 尚印訂一 u h F W M 印臥氏日日 -I l l -P U Y ﹄ Y t p u -n P U C E a G U G I G r c p c s G U E Y G t E P E U T P T S A S I S G a G s c a C Y T e G n G n M u 一 M W 口同日 ω 口げ戸ほ Mm-凶作 caACT--T U G A 臥臥 m h M m 以前日向口 U 回以町一向臥伯口凶以前 F W M W U e h 日以 M W 日以回以 MHUU 円以 M L G N U -印以日以口 U F H M H M M ﹁ L 年 F 白川 MM 日目白同 -F L F L A M n p し a a n v l m 川 h m 凶 mmmm 削 m h m m 山川町中川附 m h 附川棚畑山一川町一川町同州附刊一川町中川一問削・川削山山川川 i m 一 M-wm 山山川川町川川口川叫ん山川山一 ⋮ u m m M m 川 m F L B -7 ' γ ' p u a R F ﹂ Y 4 C G E I u c r G g G U C E G I T r c p G u c l c r G U A 9 T 9 G I G U G I T g c p c s S U E Y -G i T p e n c e c r A g T s -c a C C A C C C M M 陶口凶 M m M h 川口山凶行内 u h M m M M M 以 u h M m 臥引日 U 日い川町同臥 U U 同日 h 刊以前刊匂刊ほ日以 -M h ￨臥師以前打内 M K M U M 川一白川白目白川川口， a - a E E E ﹂ -P L P しす 1_{・内} P - u r -A T S E r f o A l c n G ﹁ G I G E T e c r G U G U G n G P G S G t G u c r G l c e T O C ﹁ T s c u 一 Ter-gGSCPAeGt-TrACGTTT 印印刷 M 山町 u n u h u u 日 HUhMMh 灯 H M M U U 臥 U U U 刊行 M W M u m u u M w u h 刊行内町肘 M m m h 円口 U 一行川内日前 M W 臥 M M H M h -M 山川町 H M u m ω c -ー -T G T C G A C G r G U G U A g c r c e T P G E T S A g c u c e G U G u c a T a T U T r T g c u c e c l T r G u -G I G -T ﹁ TPGsei-ceAAGCTC G c e A I T e E r c h T h A S T e A i G F A I T h -e r e c l C I T e c h G ﹁ T e T h T a c h A l 一 T a T a c h A S A Y T a 一 TlGCTAAG U T S E C T t C A A T T P G A A H E H C A C G T F T L E L G A G A C L A R T E A C L T P G V A T G G 一_G V G V A T G A A L C V 一 AlAGTAAA -A 内 F ﹂ T ' P - M F H W 且丹江氏 M M 叩刊目日出 M W 目 hmuq 白い川町叩刊何回旬凹町 u m m 創刊 M U M M M 印 m M U M M 印 U 刊以刊引刊以一目い川行 K M M 日開 M 叩 M P 一日制 MHU 口口 M T G A G A A H E L G G A T A A A T E A A l G G T S E P G V T P G A C G C P G V G G T S G V A M G V -A T A l G G T C G A A L -E L E G A A G T ・ -n -Y E v ' r u A m p u v t m 川山 m -w 州 .mm 削川知山川町内山内川剛山町川一肌町内川 lmm 仙閉山仰向叫ん川町川町凶制ん山川陶山川川町 ⋮ 州制一郎川則一 u m h 附加 m 川町一川一町一川川則的山一山 M Y -ー -a a n p U A n p L A -n 7 8 日目 d k 剖 M M U 司日 w u w M u H M M M 灯 m M V U 肘印刷印同日間 G H M 凶刊引印刷叫いリ日町 M M U 肘町句一日 ω u w 同同日 U M M 行 M 一以凶 MGAU 日 M G A M C L G V E A G G G G G G G V G G A A T T A T C L G A C P M L C H A " c L G G A I G G A T 印前一 nu 日 N M M M M L H U h n 内一 GAMMMCCT

123456 123456 123456

... 陣惨

.

図 2-3 ラット各組織およびラット腹水がん細胞株AH130から単離した全川のノーザンフロット解析 :A ---Cは各々 1---皿型ヘキソキナーセに対するプロープを用いたものでありレーン

1-6

は各々、肝臓、腹水がん細胞AH130、腎臓、心臓、長格筋、脳から単離した全RNAであるリボソーム川の2悦 18Sの位置は矢印で示しである (12). 型から皿型ヘキソキナーゼ遺伝子のmRNAへの転写をノーザンプロット解析により調べたものであり (12)、我々は既に、 H型ヘキソキナーゼが、がん細胞株 AH130にのみ特異的かつ強力に転写されていることを見いだしてい

る(12)・この細胞のmRNAから逆転写した cDNAを鋳型として、 cDNA境基番号

(図 2-4) 2283番から 2829番の領域をPCR法により増幅し、得られた547bp のcDNA断片を E型ヘキソキナーゼ遺伝子のスクリーニングのプロープとした ( 図

2

-5) . 図 2-4. ラット 11型ヘキソキナーゼcDNAの全塩基配列 (4):四角で囲んだ部分は本研究中 PCR法により作製したスクリーニングプロープである . 12 ₁₃

(17)

2 .

2

ラット肝臓ゲノムライブラリーのスクリーニングこのプロープを用いて、ラット肝臓ゲノム DNAライフラリーの 10 6個のプラークをスクリーニングし、図

2 -

5

に示す

1

種類のファージクローン (RH K-gF)を得た. 得られたクローーンRHK-gFをEcoR1で処理し、プラスミドに組み込み塩基配列を調べた結果、 H型ヘキソキナーゼのアミノ酸コード領域

0 .

8 k

b

p

および

3 '

末端非翻訳領域を含むことが明らかになった ( 図 2-

5 )

.

図中、黒のボックスは、スクリーニングに用いたプロープの相当する領域を示す. ThelenとWilsonによって決定された E型ヘキソキナーゼcDNAの塩基配列 ( 図

2 -

4 )

(

4 )

に基づいて、サザンプロット解析 ( 今回、結果は示さない ) および塩基配列の解析を行なった結果、得られたゲノムクローン RHK-gFに含まれるアミノ酸コード領域は、 AからEの

5

つのエクソンから構成されており、各イントロンの末端はGT-AG配列を保持していたことから、このクローンが、ラット H型ヘキソキナーゼのゲノム遺伝子であることが確認された . 各エクソンは、それぞれcDNAの塩基番号

2133

-

2232

、

2233

-

2

4

1

、

1

8

4

、

1

5

6

、

2

3

4

、

1

4

2 b

p

であることが明らかになった . これらのことから、今回得られたゲノムクローンに含まれるエクソンは、分子内に重複構造を持つヘキソキナーゼの後半半分 (c一half) の

c

-

末端領域に相当することが明らかになった .

2 .

3

RHK-gFとグルコキナーゼ遺伝子との構造比較次に、すでに構造が明かになっているラットグルコキナーゼ遺伝子と、我々が単離したラット E型ヘキソキナーゼ遺伝子との構造比較を行った (図 2-o) . これまでの数多くの研究者により、ラットグルコキナーゼ遺伝子の構造はかなり詳細に解析されている

(

1

0 .

1

1 )

.

それらの報告によれば、グルコキナーゼ遺伝子は、

1

0

個のエクソンから構成されており、興味深いことにこの遺伝子は、すい臓

S

細胞と肝臓でのみ組織特異的に発現し、さらにはそれらの組織に特異的な

2

種類の第

l

エクソン (

1 β

と

1 H

)

が存在する. なお、この章においては、 Gi (iは任意の数 ) としてグルコキナーゼ

H

e

x

o

k

i

n

a

s

e

t

y

p

e

I

cDNA

s

c

r

e

n

i

n

'

#

'

<v6> _ら手'~ 図 2

-

5 .

得られたゲノムクローンRHK田 gFの構造およびcDNA上の相当する領域遺伝子の個々のエクソンを呼ぶことにする iはグルコキナーゼ遺伝子上流から下流方向に向かう順に各エクソンの番号を示す〈つまり、

G

1

0

はグルコキナーゼの

c

-

末端をコードする

1

0

番エクソンを意味する、という具合いである ) . 図

2 -

6

は、上段がラットグルコキナーゼ、下段がラット H型ヘキソキナーゼ各々の cDNA塩基配列であり、太線はイントロンの挿入位置を示す . 今回単離したラット H型ヘキソキナーゼ(RHK-gF)の各エクソンA から

E

と、それに相当するラットグルコキナーゼのエクソン

6

から

1

0

を重ねてみると、驚くべきことにイントロンの挿入位置および各エクソンの長さが完全に一致することが見いだされた . すなわち、一次構造において非常に相向性の高かった両者の遺伝子間においても共通の構造が保持されていることが明かになったわけである . なお、前述のエクソンの名称の付け方に従い、単離した E型ヘキソキナーゼ遺伝子の各エクソンA-Eは、 E型ヘキソキナーゼ後半部分 (c一half) に相当することから、それぞれ

哺乳動物ヘキソキナーゼの遺伝子構造と機能

/

H

甫乳動物ヘキソキナーゼの

遺伝子構造と機能

履 歴 書

論 文 目 録

論文内容要旨

小暮健太朗

2

1

号￨氏名￨小暮健太朗

'一

K

.

K

.

K

.

K

.

1

1

.

.

K

.

1

1

_

2

1

小暮健太朗

I

2

.

r

- 一

一 一

7

2

1

小 暮 健 太 朗

~南乳動物ヘキソキナーゼの遺伝子構造と機能

I

.

.

.

.

.

.

.

m

c

-

I

.

.

.

.

.

.

.

.

m

日 南 乳 動 物 ヘ キ ソ キ ナ ー ゼ の

遺 伝 子 構 造 と 機 能

1 9 9 4 年

②

日 甫 乳 動 物 ヘ キ ソ キ ナ ー ゼ の

遺 伝 子 構 造 と 機 能

1 9 9 4年

目次

1

1

9

1

.

1

1

履歴書

論文目録

一一

_{小暮健太朗}

日南乳動物ヘキソキナーゼの

遺伝子構造と機能

日甫乳動物ヘキソキナーゼの

遺伝子構造と機能

2 生体におけるヘキソキナーゼの役割・