参 考 文 献
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4 8 ‑
に よ り 解 析 し た 結 果 、 ヒ ト
H
型 ヘ キ ソ キ ナ ー ゼ 遺 伝 子 の3
つ の エ ク ソ ン を 含 む こ と が 明 ら か に な っ た . さ ら に 、 ヒ ト グ ル コ キ ナ ー ゼ 遺 伝 子 の 構 造 を 比 較 し た 結 果 、 単 離 し た ク ロ ー ン の3
つ の エ ク ソ ン が グ ル コ キ ナ ー ゼ 遺 伝 子 の5
番 エ ク ソ ン か ら7
番 エ ク ソ ン に 相 当 す る こ と が 見 い 出 さ れ た . また、両 遺 伝 子 の 対 応 す る エ ク ソ ン の 長 さ お よ び イ ン ト ロ ン の 挿 入 位 置 が 、 完 全 に一致 す る こ と が 明 ら か に な っ た こ と か ら 、 ラ ッ ト の 場 合 と 同 様 に lOOkDa ヒト
E
型 ヘ キ ソ キ ナ ー ゼ 遺 伝 子 は 、2
つ の ヒ ト グ ル コ キ ナ ー ゼ 遺 伝 子 か ら 重 複 ・ 融 合 を 経 て 進 化 し た 可 能 性 が 示 唆 さ れ た ( 第3
章 )③ lOOkDaヘ キ ソ キ ナ ー ゼ と グ ル コ キ ナ ー ゼ の 機 能 的 性 質 を 決 定 す る 構 造 的 特 徴 を 明 ら か に す る た め に 、 lOOkDaラ ッ ト
H
型 ヘ キ ソ キ ナ ー ゼ の50kDac ‑
末 端 側 半 分 の あ る 領 域 を 、 50kDaラ ッ ト グ ル コ キ ナ ー ゼ cDNAの 相 当 す る 領 域 と 置 き 換 え る こ と に よ り 、 50kDaキ メ ラ へ キ ソ キ ナ ー ゼ を コ ー ド す る cDNAを 構 築 し た . さ ら に 大 腸 菌 に お い て キ メ ラ ヘ キ ソ キ ナ ー ゼ を 人 為 的 に 産 生 さ せ 、 そ れ ら の 機 能 解 析 を 行 な っ た . そ の 結 果 、 グ ル コ ー ス 結 合 や 触 媒 反 応 に 重 要 な 役 割 を 果 た し て い る 領 域 、 特 にGlc 6 Pに よ る 阻 害 反 応 に 関 係 し て い る 部 位 を 絞 り 込 む こ と に 成 功 し た . (第4
章 )5 . 2
何 故 ア イ ソ ザ イ ム の 生 じ る 必 要 が あ っ た の か ?本 研 究 に よ り lOOkDaヘ キ ソ キ ナ ー ゼ が グ ル コ キ ナ ー ゼ か ら 遺 伝 子 重 複 と 融 合 を 経 て 進 化 し た こ と が 明 ら か に な っ た . さ ら に 、 そ の 進 化 の 過 程 で 上 述 の よ う な 変 異 を 受 け る こ と に よ っ て 、 構 造 的 に は 似 て い る が 機 能 的 に 異 な る
4
種 の ア イ ソ ザ イ ム が 誕 生 し た 可 能 性 が 強 く 示 唆 さ れ た . し か し な がら 、 何 故
4
種 の ア イ ソ ザ イ ム が 生 じ る 必 要 が あ っ た の か 、 す な わ ち ヘ キ ソ キ ナ ー ゼ ア イ ソ ザ イ ム の 役 割 分 担 は ど の よ う に な っ て い る の か 、 ま た グ ルコ キ ナ ー ゼ が 遺 伝 子 重 複 ・ 融 合 し た 後 、 さ ら に ど の よ う な 順 番 で
1
‑‑‑皿型 ア イ ソ ザ イ ム が 形 成 さ れ た ( 進 化 し た ) の か 等 、 非 常 に 興 味 深 い 問 題 が 残 さ れ て い る .緒 言 で も 紹 介 し た よ う に 、
4
種 の ア イ ソ ザ イ ム は 機 能 的 性 質 ( す な わ ち 、 グ ル コ ー ス お よ びATPに 対 す る Krn値 や Glc‑
6‑
Pに 対 す る 感 受 性 な ど 〉 、 分 布組 織 お よ び 発 現 に 影 響 を 与 え る 因 子 な ど が 大 き く 異 な っ て い る (第
1
章、表 1
‑ 1)
. 具 体 的 に 列 挙 し て み る と 、I
型は、 Krn(Glc)、 Km(ATP)お よ び Ki い ず れ も 極 め て 小 さ く 、 脳 や 心 筋 に 特 異 的 に 発 現 し て お り 、 ミ ト コ ン ド リ ア に 可 逆 的 に 結 合 す る こ と に よ り 、 そ の 内 部 に お い て て 産 生 さ れ た ATPを 非 常 に 効 率 よ く 消 費 し て い る ( 第1
章 、 図1 ‑ 4 ) .
一方、
E
型は、 I型 に 比 べ Krn(Glc)はl桁 オ ー ダ ー が 、 Krn(ATP)は 2倍 程 度 大 き く 、 基 質 に 対 す る 親 和 性 が 若 干 低 い . ま た 、H型 は イ ン ス リ ン や 血 糖
値 に よ り そ の 発 現 が 制 御 さ れ る こ と が 知 ら れ て お り 、 骨 格 筋 や 脂 肪 組 織 に 特 異 的 に 発 現 し て い るm
型は、 Krn(Glc)、Ki値 が ほ ぼ I型 と 同 じ で あ る が、 Krn(ATP)が 他 に 比 べ て 若 干 高 い . 皿 型 の 特 徴 と し て 、 基 質 ( グ ル コ ー ス〉 濃 度 が 高 い 場 合に 、 リ ン 酸 化 反 応 が 抑 制 さ れ る こ と が 知 ら れ て お り 、 肝 臓 、 腎 臓 、 部 分 切 除 後 の 再 生 肝 、 肝 が ん 細 胞 や 筏 膜 な ど に 分 布 が 確 認 さ れ て い る が 、 そ の 生 理 的 な 役 割 は 未 だ に よ く わ か っ て い な い . も し か す る と 、 あ る 条 件 下 に お い て の み 発 現 し 機 能 す る の か 、 あ る い はI型 お よ び H
型 の 控 え と し て 存 在 し て い る の か も し れ な い .W
型 、 す な わ ち グ ル コ キ ナ ー ゼ は 他 の ア イ ソ ザ イ ム に 比 べ 、 Krn(Glc)、 Ki い ず れ も か な り 大 き く 、 グ ル コ ー ス お よ びGlc‑
6‑
Pに 対 す る 親 和 性 が 極 端 に 低 い . グ ル コ キ ナ ー ゼ はE
型 同 様 、 肝 臓 に お い て イ ン ス リ ン に 、 す い 臓β
細 胞 で は 血 糖 値 に 応 答 し 、 こ の2
つ の 組 織 に の み 特 異 的 に 発 現 し て い る .こ の よ う に 、 皿 型 を 除 く 各 ア イ ソ ザ イ ム は 、 そ れ ぞ れ 組 織 特 異 的 に 分 布 し て い る わ け だ が 、
I型 と H型 な ど は ど ち ら か
一方が 発 現 す れ ば 機 能 的 に は ほ と ん ど 問 題 な い よ う に 思 え る の だ が 、 そ の よ う な 特 異 的 な 組 織 分 布 に 何 か 意 味 は あ る の だ ろ う か ?5 . 3
各 ア イ ソ ザ イ ム 分 布 組 織 に お け る エ ネ ル ギ 一 代 謝 の 特 徴そ こ で 、 皿 型 以 外 の ヘ キ ソ キ ナ ー ゼ が 分 布 し て い る 各 組 織 に お け る エ ネ ル ギ 一 代 謝 の 特 徴 を 調 べ て み た .
I
型 が 分 布 し て い る の は 脳 や 心 筋 で あ り 、 そ れ ら の 組 織 は 極 め て 活 発 に 、 か つ か な り 一定 し た 速 度 で 好 気 的 代 謝 ( 酸 化 的 リ ン 酸 化 ) を 行 な う . そ の5 0
TEAph d
E 士 三 三 三 三 竺 竺 竺 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 亙 ζ ア 一一一 一 一 竺 ‑ ‑ ‑ =
ため、 ミ ト コ ン ド リ ア も 多 く 存 在 す る . 脳 も 心 筋 も グ リ コ ー ゲ ン を ほ と ん ど 貯 蔵 で き な い の で 、 そ の エ ネ ル ギ 一 代 謝 の 基 質 と し て 血 液 中 の グ ル コ ー ス に 絶 え ず 依 存 し て い る . 取 り 込 ん だ グ ル コ ー ス は 解 糖 系 、 ク エ ン 酸 回 路 を 経 て 酸 化 さ れ 、 酸 化 的 リ ン 酸 化 に よ る ATP産 生 の エ ネ ル ギ ー と な る .
H型 は 、 骨 格 筋 お よ び 脂 肪 組 織 に 分 布 し て い る . 骨 格 筋 ( 筋 肉 細 胞 〉 は 休 止 状 態 で は 、 血 液 中 の グ ル コ ー ス を グ リ コ ー ゲ ン と し て 貯 蔵 し て い る . 筋 肉 細 胞 は ATPの み を そ の エ ネ ル ギ ー 基 質 と す る が 、 運 動 時 に は 必 要 な 量 の ATPを 酸 化 的 リ ン 酸 化 に よ っ て 産 生 で き る ほ ど の
o
2 と 呼 吸 基 質 を 血 液 か ら 取 り 込 む こ と が で き な い . そ の た め 、 必 要 に 応 じ て 筋 肉 グ リ コ ー ゲ ン を 再 び グ ル コ ー ス と し て 取 り 出 し 、 嫌 気 的 発 酵 を 行 な う こ と に よ り 、 ATP と 乳 酸 を 産 生 す る の で あ る . ま た 、 脂 肪 組 織 は 、 血 液 中 の グ ル コ ー ス を 解 糖 系 を 経 て 脂 肪 と し て 貯 蔵 し 、 や は り 必 要 時 に は 脂 肪 を 分 解 す る こ と に より 遊 離 脂 肪 酸 を 放 出 し て 、 燃 料 供 給 を 行 な う .
グ ル コ キ ナ ー ゼ は 、 肝 臓 お よ び
β
細 胞 に 分 布 し て い る . 肝 臓 は 、 血 中 イ ン ス リ ン に 応 答 し て 、 血 液 中 の グ ル コ ー ス を 解 糖 系 に よ り 消 費 し 、 ま た グ リ コ ー ゲ ン と し て 貯 蔵 す る こ と に よ り 、 血 糖 値 を コ ン ト ロ ー ル し て い る .β細 胞 は 血 液 中 の グ ル コ ー ス 濃 度 の セ ン サ ー と し て 働 き 、 血 糖 値 の 上 昇 を
感 知 し て イ ン ス リ ン を 分 泌 す る こ と に よ り 、 肝 臓 に 血 糖 取 り 込 み の 指 令 を 送 る . 両 組 織 が う ま く 働 く こ と に よ り 血 糖 値 を 保 っ て い る の で あ る .
5 . 4
エ ネ ル ギ 一 代 謝 系 の 形 式 と ヘ キ ソ キ ナ ー ゼ ア イ ソ ザ イ ムこ れ ら の こ と を ま と め て み る と 、 以 下 の よ う な 非 常 に 興 味 深 い 事 実 が 見 い だ さ れ た .
① ま ず 、 恒 常 的 に エ ネ ル ギ ー を 消 費 し な け れ ば な ら な い 組 織 は 、 血 液 中
の グ ル コ ー ス に 依 存 し 、 酸 化 的 リ ン 酸 化 に よ り ATP供 給 を 行 な っ て い る . こ れ ら の 組 織 に は 共 通 し て
I
型 ヘ キ ソ キ ナ ー ゼ が 発 現 し て お り 、iilson
ら の グ ル ー プ やPedersen
ら の グ ル ー プ の 報 告 に も あ る よ う に 、 こ の ヘ キ ソ キ ナーゼは、 ミ ト コ ン ド リ ア 外 膜 に 結 合 す る こ と に よ り 、 ミ ト コ ン ド リ ア 内 部 で 産 生 さ れ た ATPを 効 率 よ く 消 費 し 、 活 発 な エ ネ ル ギ ー 共 役 系 ( 解 糖 系ー
5 2 ‑
→ ク エ ン 酸 回 路 → 酸 化 的 リ ン 酸 化 〉 に 貢 献 し て い る と 推 察 さ れ る .
② 一 方 、 細 胞 の 燃 料 " の 貯 蔵 と 放 出 に 関 与 す る 組 織 で は 、 酸 化 的 リ ン 酸 化 よ り も 解 槍 系 が 主 要 な エ ネ ル ギ 一 代 謝 系 で あ り 、 こ れ ら の 組 織 に お い て 発 現 し て い る
E
型 お よ び グ ル コ キ ナ ー ゼ は 、 と も に イ ン ス リ ン や エ ビ ネ フ リ ン に 応 答 す る な ど 共 通 点 が 多 い .一 見 無 秩 序 に 分 布 し て い る か に 思 わ れ た ヘ キ ソ キ ナ ー ゼ ア イ ソ ザ イ ム で
あ る が 、 こ の よ う に 各 組 織 の エ ネ ル ギ 一 代 謝 系 の 性 質 に よ り 役 割 分 担 を し て い る こ と が 明 ら か に な っ た .
5. 5
ヘ キ ソ キ ナ ー ゼ ア イ ソ ザ イ ム の 進 化 と 役 割 分 担こ れ ら の 事 実 に 基 づ い て 考 え る と 、 増 殖 速 度 が 異 常 に 速 い た め に あ た か も 運 動 時 に お け る 筋 肉 細 胞 の よ う に 酸 素 供 給 が 不 充 分 で あ り 、 そ の た め 嫌 気 的 な 解 糖 系 が 主 要 な エ ネ ル ギ ー 産 生 系 で あ る と 思 わ れ る が ん 組 織 に 、
E
型 ヘ キ ソ キ ナ ー ゼ が 極 め て 多 く 発 現 し て い る こ と も 理 屈 に 合 っ て い る と いえる.
以 上 の 考 察 に よ り 、 ヘ キ ソ キ ナ ー ゼ 各 ア イ ソ ザ イ ム の 生 班 的 な 役 割 分 担 が 明 ら か に な っ た . ヘ キ ソ キ ナ ー ゼ ア イ ソ ザ イ ム の 進 化 の 順 序 に つ い て 考 え る 時 、 各 ア イ ソ ザ イ ム の 分 担 さ れ た 役 割 " は 、 た い へ ん 有 用 な 情 報 と な る . す な わ ち 、 進 化 に よ る 新 し い 組 織 の 形 成 に 伴 っ て エ ネ ル ギ 一 代 謝 も 変 化 す る た め 、 そ の 都 度 新 し い エ ネ ル ギ 一 代 謝 系 に 対 応 で き る へ キ ソ キ ナ ー ゼ ア イ ソ ザ イ ム が 形 成 さ れ た と 思 わ れ る . 各 ア イ ソ ザ イ ム の 分 布 組 織 の エ ネ ル ギ 一 代 謝 経 路 の 進 化 と 、 本 研 究 に よ り 、
5 0 k D a
グ ル コ キ ナ ー ゼ(IV
型 〉 の 遺 伝 子 重 複 ・ 融 合 を 経 た H型 ヘ キ ソ キ ナ ー ゼ の 形 成 が 明 ら か に な っ た こ と か ら 、 ヘ キ ソ キ ナ ー ゼ ア イ ソ ザ イ ム は 、W
→ 日 →1
( → 四 ) の 順 序 で 進 化 し た 可 能 性 が 示 唆 さ れ た . 今 後 、 さ ら な る 詳 細 な 研 究 が 行 な わ れ 、 ヘ キ ソ キ ナ ー ゼ の ア イ ソ ザ イ ム 進 化 と 機 能 ・ 構 造 と の 関 係 が 解 明 さ れ る こと を 期 待 す る .
‑ 5 3 ‑
謝 辞 実 験 の 部
本 研 究 を 行 な う に あ た り 、 終 始 、 ご 指 導 、 ご 鞭 鑓 を 賜 り ま し た 、 徳 島 大 学 薬 学 部 寺 田 弘 教 授 に 心 よ り 感 謝 の 意 を 表 し ま す .
さ ら に 、 本 研 究 を 行 な う に あ た り 、 よ き 理 解 者 で あ り 、 ま た 常 に ご 指 導 、 ご 討 論 し て い た だ き ま し た 徳 島 大 学 薬 学 部 篠 原 康 雄 助 教 授 に 深 謝 い た し ま す .
ま た 、 本 研 究 に 対 し 、 深 い ご 理 解 と ご 激 励 を い た だ き ま し た 徳 島 大 学 総 合 科 学 部 武 田 美 雄 教 授 、 杏 林 大 学 医 学 部 ‑ 福 嶋 義 博 教 授 、 富 田 製 薬 市 原 照 由 博 士 に 深 謝 い た し ま す .
ま た 、 本 稿 を ま と め る に あ た り 、 ご 査 読 、 ご 討 論 い た だ き ま し た 徳 島 大 学 薬 学 部 山 内 卓 教 授 、 丹 羽 峰 雄 教 授 に 深 く 感 謝 い た し ま す .
試 薬
制 限 酵 素 お よ び
T a q D N A
ポ リ メ ラ ー ゼ は 、 宝 酒 造 ( 株 ) か ら 購 入 し た .ま た 、 英 文 原 稿 を 作 製 す る 際 に 、 懇 切 丁 寧 に 添 削 し て い た だ き ま し た 市 原
A .
エ リ ザ ベ ス 博 士 に 深 謝 い た し ま す .[ α ̲ 3 2 P J d C T P
お よ び [r ̲ 3 2 P J A T P
はD u P o n l ‑ N e w E n g l a n d N u c l e r
から 入 手 し た .S c h l e i c h e r & S c h u e l l
か ら 購 入 し た ニ ト ロ セ ル ロ ー ス メ ン プ ラ ン( B A 8 5 )
は 、 ゲ ノ ムl i b r a r y
の ス ク リ ー ニ ン グ お よ び サ ザ ン フ ロ ッ ト 解 析 に 用 い た . そ の 他 の 試 薬 は 、 す べ て 市 販 の 特 級 品 を 用 い た .Sau3A 1
に よ り 部 分 消 化 し たD N A
をえ E M Bl.4に 組 み 込 む こ と に よ り 作 成 し た 、W i s t a r
ラ ッ ト の 肝 臓 の ゲ ノ ム ラ イ ブ ラ リ ー の 増 幅 品 は 、 熊 本 大 学 医 学 部 の 滝 口 博 士 よ り 恵 与 し て い た だ い た .ま た 、 研 究 を 通 じ て つ ぎ の 方 々 に お 世 話 に な り ま し た .
河 野 秀 人 氏 、 大 倉 一 人 博 士 、 佐 々 惇 紀 氏 、 市 原 準二 氏 、 大 岩 千 恵 氏 、 安 部 一 豊 氏 、 山 下 和 美 氏
心 よ り 感 謝 い た し ま す .
2
実 験 方 法2 . 1
ス ク リ ー ヱ ン グ プ ロ ー ブ と し て の ラ ッ ト1 1
型 ヘ キ ソ キ ナ ー ゼc D N A
断 片 の 調 製 ( 第2
、3
章)フット
E
型 ヘ キ ソ キ ナ ー ゼ のc D N A
断片( 5 4 7 b p )
を プ ロ ー プ と し て 、 フ ッ ト の ゲ ノ ム ク ロ ー ン の 単 離 と 解 析 に 用 い た . このc D N A
断片は、P C R
法 に よ り 調 製 し た .P C R
法 の 鋳 型 と し て 、H
型 ヘ キ ソ キ ナ ー ゼ 遺 伝 子 が 械 め て 多 く 発 現 し て い る が ん 細 胞 株A H 1 3 0 ( 1 )
の 全R N A
か ら 、 逆 転 写 す る こ と に よ り 得 ら れ たc D N A
を 、 ま た 逆 転 写 反 応 の プ ラ イ マ ー に は オ リ ゴ( d T )
プ ラ イ マ ー お よ び ラ ン ダ ム プ ラ イ マ ー を 用 い た . 全RNA5μg
を2 0 0 p m o l
の プ ラ イ マ ー と7 0
0C
で3 0
分 間 ア ニ ー ル さ せ た . 次 に 、 逆 転 写 酵 素 溶 液1 0 0 u n i t s
、l m M d N T P
， リ ボ ヌ ク レ ア ー ゼ 阻 害 剤( R N A g u a r d
、 フ ァ ル マ シ アL K B )1 6 . 5 u n i t s
、1 0 m M d i t h i o t h r e i t o l
、7 5 m M K C l
、3 m M M g C 12
、5 0 m MT r i s H C l b u f f e r ( p H 8 . 3 )
を ア ニ ー ル さ せ た
R N A
に 加 え 、 こ れ ら 反 応 混 合 液 を3 7
0C
で1
時 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た . さ ら に 、 逆 転 写 酵 素 を 失 活 さ せ る た め に9 8
0Cで1 0
分間加熱し、直 ち に 氷 冷 し た .
P C R
法 に 用 い た 反 応 混 合 液 の 組 成 は 、 鋳 型D N A 0.45μg
、ラットE型 ヘ キ ソ
また、6
年 も の 問 、 終 始 暖 か く 見 守 り 、 励 ま し て 下 さ い ま し た 徳 島 大 学 薬学 部 生 物 薬 品 化 学 教 室 の 皆 さ ま に 深 謝 い た し ま す .
最 後 に 、 深 い 愛 情 と 理 解 を 持 っ て 私 を 応 援 し て く れ た 家 族 に 心 よ り 感 謝 の 意 を 表 し ま す .