45 . . . . . HKC 30 . . . . .
図
4 ‑ 8 .
大 腸 菌 抽 出 液 中 に 発 現 さ せ た キ メ ラHKC
のSDS‑PAGE:
レ ー ン
A
お よ びB
は、IPTG
未 処 理 お よ び 処 理 時 に お け る 、HKC
のcDNA
を 含 む 大 腸 菌 抽 出 液 . レ ー ンC ， D . E
は そ れ ぞ れIPTG
処 理 時 における、CH2
，C I I 3
，C I I 2 3
のcDNA
を 含 む 大 腸 菌 抽 出 液ロ ッ ト か ら 、
I I K C
に 対 す るGlc ‑ 6 ‑ P
の 阻 害 反 応 はATP
に 対 し て 競 合 的 で あ り グ ル コ ー ス に 対 し て 反 競 合 的 で あ る こ と が 確 認 さ れ た . グ ル コ ー ス お よ びATP
に 対 す るKm
値 と 、 グ ル コ ー ス お よ びATP
に 対 す るGlc ‑ 6 ‑ P
のK i
値 を 表4‑
2
に ま と め た . な お 、 大 腸 菌 抽 出 液 中 に 発 現 し た タ ン パ ク 質 を 正 確 に 定 量 す る 事 が で き な い た め 、Vmax
は 求 め て い な い . こ の 表 か ら 明 ら か な よ う に 、HKC
と キ メ ラ ドKC
のATP
に 対 す るKm
値CKm(ATP)
) は ほ ぼ 同 じ 値 で あ り 、 およそ 1 .5 i n l
で あ っ た が 、 グ ル コ ー ス に 対 す るKm
値(Km(Glc))
は 各 タ ン パ ク 質 に よ り 異 な っ て い た . 興 味 深 い こ と に 、HKC
のH2
お よ びH3
の 領 域 を そ れ ぞ れ グ ル コ キ ナ ー ゼ のG2
とG3
領 域 に 置 き 換 え た キ メ ラHKC(CH2
とCH3)
では、KmCGlc)
は増大したが、1 1 2
とH3
の 両 方 をG2
とG3
に 置 き 換 え た キ メ ラC I I 2 3
のKm CGlc)
値 はHKC
の 値 と 変 わ ら な か っ た . ま た 、CH3
の グ ル コ ー ス に 対 す るK i
CKiCGlc))
は、HKC
の そ れ と ほ ぼ 同 じ で あ り 、 そ れ ら の 値 はCH2
お よ びCH23
4 2
の 値 よ り も 、 か な り 小 さ い も の で あ っ た . 一 方 、 キ メ ラ
HKC
のKm(ATP)
値 は ほ と ん ど 違 い が な か っ た に も か か わ ら ず 、ATP
に 対 す るK i
値(Ki(ATP ) )
はHKC
、CH3
、CH2
、CH23
の 順 序 で 大 き く な っ た .4. 3
考 察100kDa
ヘ キ ソ キ ナ ー ゼ ( ア イ ソ ザ イ ム1
‑ ‑ 皿 型 ) の 最 も 顕 著 な 構 造 的 特 徴 は 、 そ れ ぞ れ が50kDa
グ ル コ キ ナ ー ゼ や50kDa
酵 母 へ キ ソ キ ナ ー ゼ に 非 常 に よ く 類 似 し た 構 造 の50kDa
ポ リ ペ プ チ ド の 連 結 構 造 を 有 し て い る こ と で あ る . 酵 母 、 ラ ッ ト 肝 臓 お よ び マ ウ ス 肝 が ん そ れ ぞ れ の ヘ キ ソ キ ナ ー ゼ に 保 持 さ れ て い る ア ミ ノ 酸 配 列 か ら 、 グ ル コ ー ス お よ びATP
の 結 合 推 定 部 位 が 提 唱 さ れ て お り(9‑12)
、 こ れ ら の 部 位 は 、 ヘ キ ソ キ ナ ー ゼ のN ‑
末 端 側 半 分 お よ びC‑
末 端 側 半 分 の 両 者 に 共 通 に 認 め ら れ る( 9 ‑ 1 2 ) .
し か し な が ら 、 ヘ キ ソ キ ナ ー ゼ 半 量 体(50kDa)
に 相 当 す る グ ル コ キ ナ ー ゼ がGlc ‑ 6 ‑ P
に よ る 阻 害 反 応 に 対 し て 非 感 受 性 で あ る こ と か ら 、N
末 端 側 お よ びC‑
末 端 側 半 分 は 各 々 で 触 媒 機 能 と 制 御 機 能 を 分 担 し て い る と 従 来 考 え ら れ て お り (1
)、 すなわち、 N‑末 端 半 分 は 生 成 物 に よ る 阻 害 反 応 に 、 C‑
末 端 は 触 媒 反 応 に 必 要 で あ る と 考 え ら れ て い た (1 ) .
さ ら に 、 酵 母 ヘ キ ソ キ ナ ー ゼ の
X
線 解 析 の 結 果 か ら 、 相 当 す るC ‑
末 端 側 半 分 のSer603
、Asp657
、Glu708
、Glu742
が グ ル コ ー ス の 結 合 に 必 要 で あ り 、C‑
末 端 側 半 分 のLys558
はATP
結 合 に 関 与 し て い る と 考 え ら れ て い た( 9 ‑ l 3 ) .
し か し な が ら 、 こ れ ら の 残 基 を
Ala
やGly
に 変 異 さ せ た 場 合 に お い て も 、 酵 素 活 性 は 低 下 す る も の の 、ATP
に 対 す る 親 和 性 は 影 響 を 受 け な か っ た こ と が 報 告 さ れ て い る( 6 . 7 ) .
ま たN
末 端 側 半 分 の 相 当 す る ア ミ ノ 酸 残 基 を 変 異 さ せ て も 、 ヘ キ ソ キ ナ ー ゼ の 触 媒 反 応 お よ びGlc ‑ 6‑P
に よ る 阻 害 反 応 に 変 化 は 認 め ら れ て い な い(7)
.さらに、Lys558
をArg
やlet
に 変 異 さ せ る と 、Vmax
は 減 少 し た が 、Km(ATP)
お よ びKm(Glc)
は ほ と ん ど 変 化 が 認 め ら れ な か っ た こ と が 報 告 さ れ て い る( 6 )
. こ れ ら の 結 果 か ら 、C ‑
末 端 側 半 分 が ヘ キ ソ キ ナ ー ゼ 活 性 の 本 体 で あ り 、 N‑
末 端 側 半 分 は ヘ キ ソ キ ナ ー ゼ 活 性 の 調 節4 3
に 関 与 し て い る か 、 あ る い は ミ ト コ ン ド リ ア 外 膜 と
c ‑
末 端 側 半 分 と の つ な ぎ " と し て 働 い て い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ て い る(7)
.また、Arora
らによ っ て 、 マ ウ ス 肝 が ん ヘ キ ソ キ ナ ー ゼ と そ のC ‑
末 端 側 半 分 の 酵 素 活 性 を 比 較 の結果、lOOkDa
ヘ キ ソ キ ナ ー ゼ と そ のC ‑
末 端 側 半 分50kDa
ポ リ ペ プ チ ド に お け るKm(ATP)
、Km(Glc)
、Ki(ATP)
、Ki(Glc)
が ほ ぼ 同 じ で あ る こ と が 報 告さ れ て い る
(7)
. こ の こ と か ら もC ‑
末 端 側 半 分 が ヘ キ ソ キ ナ ー ゼ の 本 体 で あ る こ と が 示 唆 さ れ て い る .こ れ ら の こ と か ら 、
lOOkDa
ヘ キ ソ キ ナ ー ゼ の 機 能 的 性 質 は 、 そ のC‑
末 端 側 半 分 に つ い て 調 べ る こ と に よ り 充 分 に 評 価 す る こ と が で き る と 考 え ら れ た.そこで、E
型 ヘ キ ソ キ ナ ー ゼ の 機 能 的 性 質 と 構 造 的 特 徴 と の 関 係 を 調 べるため、E
型 ヘ キ ソ キ ナ ー ゼ のC ‑
末 端 側 半 分(HKC)
お よ び 、 そ のH2
とH3
領 域 を ラ ッ ト 肝 臓 グ ル コ キ ナ ー ゼ の 相 当 す る 領 域G2
あ る い はG3
に 置 き 換 え た 組 換 え 体CH2
、CH3
、CH23
を 作 製 し た ( 図4‑2) .
ちなみに、H2
とG2
聞の 相 同 性 は5 1
%、H3
とG3
の 相 同 性 は60%
で あ る . 図4 ‑ 9
はI
、E
、E
型 ヘ キ ソ キ ナ ー ゼ のc ‑
末 端 側 半 分 と グ ル コ キ ナ ー ゼ の ア ミ ノ 酸 配 列 を 比 較 し た も の で あ り 、 推 定ATP
結 合 部 位 が 主 にH2
とG2
の 領 域( K p n 1 ‑ Xh 0 1
)に、推定グ ル コ ー ス 結 合 部 位 がH3
とG3
の 領 域( X h o 1 ‑ E c o R 1
) に 含 ま れ て い る こ と が わ かる.H2
領 域 中 のLys558
はG2
中 で はGln
に 置 き 換 わ っ て い る が 、H3
領 域 中 のSer603
、H4
領 域 中 のArg657
、Glu708
、Glu742
は グ ル コ キ ナ ー ゼ の 相 当 す る 領 域 に も 保 存 さ れ て い る . ま た 、2
の 領 域 に は4
つ の ア イ ソ ザ イ ム 聞 に お け る ギ ャ ッ プ 領 域 も 存 在 し て い る .lOOkDaI
型 ヘ キ ソ キ ナ ー ゼ と そ のc ‑
末 端 側 半 分50kDa
が 同 等 の 機 能 的 性 質 を 有 じ て い た(7)
よ う に 、 本 研 究 に お け るHKC
に も 触 媒 活 性 お よ びGlc ‑ s ‑ P
に よ る 制 御 作 用 が 認 め ら れ た . したがって、HKC
のKm
ゃ れ もE
型 へ キ ソ キ ナ ー ゼ の 値 と 一 致 す る こ と が 期 待 さ れ た . しかしながら、HKC
のKm(ATP)
、Km(Glc)
、Ki(Glc)
が 天 然 の100kDaII
型 ヘ キ ソ キ ナ ー ゼ の も の(8)
よ り も わ ず か3
倍 程 度 大 き か っ た だ け で あ る に も か か わ ら ず 、Ki(ATP)
は20
倍 も の 高 い 値 を 示 し た ( 表4‑ 2 ) .
またGlc ‑ 6 ‑ P
に よ る 阻 害 反 応 は 、 従 来 の 報 告 (1 )
4 4
と 同 様 に
ATP
と 競 合 的 で あ り グ ル コ ー ス と 反 競 合 的 で あ る こ と が 篠認され た ( 図4‑ 6 、 ‑ 7 )
HKI HKII HKIII G K
HKI HKII HKIII GK
HKI HKII HKIII G K
HKI HKII HKIII G K
HKI HKII HKIII G K
臥
J t a t i v e A TP b i n d i n g s
託e
474
1EETLAm'RL S!CQTLMEVJUI\R工~TEMEMGLR!CETNSKATV!CHLPSFVRS1PDGTEBGDF RQJTLES況IJぷt児LSH回EQL工ÆV京RRMKVE~阻偲α∞3孔LSK阻ET日 AVAFIIK阻
回 回ETL町 QωL凶S国 山QLTA叫AVQA叫A仰 EAM削 1R肌'GむL∞伺E5 55凶 也 円W阻 附TPD閃G阻R悶G∞D町FLA以叫ヰ恥D叫LG密密N町FR肌 札L
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G VEQ1LAEFQLQl也~EDLKKVMSRMQ直畏~EMDRG~THEEASV!C M工LPTYVRSTPEGSEVGDFLS益DLGtNF
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やn l
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∞
RI708 ‑‑̲. .. 742
INMEWGAFGDNGCLDD1RTDFDKVVDEYSLNSGKQRFEKH1SGMYLGE1VRN1L1D F!吹~GF~GQISEPLKTRGlFE VNMEWGAFGDNGCLDDLRTVFDVAVDELSLNPGKQRFEKHI5GMYLGE1VRNIL1DFTKRG~GR1SERLKTRGlFE 1NHEWGAFGDDGSL5M工βTCFDASVDQAS1NPGKQRFEKH1SGHYLGE1VRH1LLHLTSL~GQKTQCLQTRD1FK VNTEWGAFGDSGELDEFLIAYDRHVDES5ANPGQQLYEK1IGGKYHGELVRLVIよぷLVDENLLFHGEA5EQLRTRGAFE
256 2鈎
~FLSQ1ESDRLALLQVRA1LQQ工βLNSTCDDS1LVKTVCGVVSKRAAQLCGAGMAAVVEK1RENRGLDHLNVTVGVDG
TKFLSQ1ESDCLALLQVRA1LRHLGIASTCDDSIIVKEVCTVVARRAAQLCGAGMAAVVDKlRENRGLDNLKVTVGVDG
TKFLSE1ESDSLALRQVRA工 LEDLGLTLTSDDA工~VCQAVSRRAAQLCGAGVAAVVEK1RENRGLQELTVSVGVDG
TRFVSQVESDSGDRKQIHNILSTLGLRPSVTDCDIVRRACESVSTRAAHMCSAGLAGVINRHRESRSEDVHRITVGVDG 917
HK I TLYKLHPHFSRI 胆JQTVKELS~CTVSFLLSEDG5GKGAALITAVGVR工~GDPSI HKII TLYKLHPHFAKVH1JETVRDLA~CDVSFLESEDGSGKGAALITAVACR1REAGQR HK 111 TLYKLHPHFSRLVS~LAPQCTVTFLQSEDGSGKGAALVTRVACRLT~CV G K SVYKLHPSrKERFHASVRRLTPNCE1TFIESEEGSGRGAALV5AVACKKACM工品Q
特5
図
4 ‑ 9 . 1 ~ 1 1 1
型 ラ ッ ト ヘ キ ソ キ ナ ー ゼc ‑
末 端 側 半 分 と ラ ッ ト グ ル コ キ ナ ー ゼ の ア ミ ノ 酸 配 列 の 比 較 : ア ミ ノ 酸 配 列 はThclcn
とWilson ( 14)
か ら 引 用 . 四 角 は 、 そ れ ぞ れATP
お よ び グ ル コ ー ス と の 推 定 結 合 部 位 と ギ ャ ッ プ 領 域 を 、 太 い 破 線 は 制 限 酵 素 認 識 部 位 を 、 星 印 は2お よ び3の 領 域 中 の1‑‑
皿 型 に 共 通 で グ ル コ キ ナ ー ゼ の み こ と な る ア ミ ノ 酸 残 基 を 、 そ れ ぞ れ 表 し て い る .Arora
らによれば、I
型 ヘ キ ソ キ ナ ー ゼ に お い て 、ATP
結 合 に 関 与 し て い る と 考 え ら れ て い るLys558
の 恥t
へ の 変 換 に よ っ て 、ATP
に 対 す る 親 和 性 の 変 化 が 引 き 起 こ さ れ な か っ た こ と が 報 告 さ れ て い る( 6 )
.ま た 、 本 研 究 に お い てH2
領 域 中Lys558
を も 含 む 広 い 範 囲 の 組 換 え も 、ATP
に 対 す る 親 和 性 に 何 等 影 響 を 及 ぼ さ な か っ た . さらに、100kDa
へ キ ソ キ ナ ー ゼ と は 機 能 的 性 質 が 大 き く 異 な る グ ル コ キ ナ ー ゼ に お い て も 、Km(ATP)
に 関 し て は そ れら の 値 と 同 じ で あ る こ と が 知 ら れ て い る
( 8 )
. と こ ろ が 、 本 研 究 に お い て4 5
組 み 換 え を 行 っ た2の 領 域 (ATPと の 推 定 結 合 部 位 を 含 む H2と G2) は 互 い の 相 同 性 が5l% 程 度 で あ り 、 4種 の ア イ ソ ザ イ ム 聞 に お け る こ の 領 域 の 相 向 性 は さ ら に 低 い こ と が 明 ら か で あ る . こ れ ら の こ と か ら 、 ATPと の 結 合 に は こ れ ら ア イ ソ ザ イ ム 聞 に 共 通 に 保 存 さ れ て い る 非 常 に 限 定 さ れ た 部 位 が 重 要 で あ る こ と が 強 く 示 唆 さ れ た .
対 照 的 にHKCの グ ル コ ー ス に 対 す る 親 和 性 は 、 組 み 換 え に よ っ て 大 き く 影 響 を 受 け た ( 表
4‑
2) . す な わ ち G2に よ る H2の 置 換 (CH2)や 、 推 定 グ ルコ ー ス 結 合 部 位 を 含 むG3と H3の 組 み 換 え に よ り 、 Km(Glc)が 低 下 し た の で ある. こ こ で 興 味 深 い の は 、 H2と H3を 同 時 に 組 換 え る こ と に よ り 、 Km(Glc) がHKCの レ ベ ル に ま で 回 復 し た こ と で あ る ， な ぜ な ら 、 も し グ ル コ ー ス と の 結 合 が 、 組 み 換 え た
2
、3
の 領 域 の1
次 構 造 の み に 依 存 し て い る の で あ れ ば、 CH23の Km(Glc)は CH2や CH3の も の よ り も 大 き く な る こ と が 予 想 さ れ る か ら で あ る . こ れ ら の 結 果 か ら 、 グ ル コ ー ス と の 結 合 は 、 限 ら れ た 領 域 の1
次 構 造 だ け で は な く 、 広 い 範 囲 に お よ ぶ 立 体 的 な 構 造 も 重 要 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た . そのため、 G2‑
G3連 結 ポ リ ペ プ チ ド 鎖 は HKC中 の H2‑
H3部 分 の 立 体 構 造 と よ く 似 て い る こ と が 推 察 さ れ た .ま た HKCと キ メ ラ HKCにおいて、 Ki(ATP
)
の 変 動 幅 が 狭 か っ た こ と か ら も 、 ATP結 合 に は 限 定 さ れ た 領 域 の 構 造 が 重 要 な 役 割 を 果 た し て い る こ と が 示 唆 さ れ た . し か し な が ら 、 Ki(Glc)
に は 組 み 換 え の 影 響 が 顕 著 に 認 め ら れ た . す な わ ち 、 CH3の Ki(Glc)と HKCの 値 に ほ と ん ど 差 は 認 め ら れ な か っ たが、 CH2 と CH23 は著しく高 ~'\Ki(Glc) 値を示した. こ の こ と か ら 、 推 定ATP 結 合 部 位 を 含 む 領 域 (H2と G2) の 置 換 に よ り Glc
‑
6‑
Pに 対 す る 親 和 性 が 顕 著 に 減 少 し 、 推 定 グ ル コ ー ス 結 合 部 位 を 含 む 領 域 (H3と G3) の 置 き 換 え ではGlc
‑
6‑
Pは 変 化 し な い こ と が 明 ら か に な っ た . したがって、 Glc‑6‑Pによ る 阻 害 反 応 は2
の 領 域 の 構 造 に 大 い に 依 存 し て い る と 結 論 づ け る こ と が で きる.と こ ろ で 、 前 述 の よ う にHKCとCH23の Km(Glc)値 が 似 て い た こ と か ら 、 CH23 に お け る 2と 3の 領 域 の 立 体 的 な 構 造 は 、 HKCの 相 当 す る 領 域 の も の に 似 て
46
い る こ と が 推 察 さ れ る . し か し な が ら 、 CH23の Ki(Glc)は HKCの 値 の 10倍 も の 高 い 値 を 示 し て お り 、 こ の こ と か ら ATPと の 結 合 同 様 Glc6 Pの結合も、
非 常 に 狭 い 範 囲 の
1
次 構 造 が 重 要 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た .図
4 ‑ 9
において、2
、3
の領域中、1‑‑‑
皿 型 へ キ ソ キ ナ ー ゼ に は 認 め ら れ ず 、 グ ル コ キ ナ ー ゼ に の み 存 在 す る ア ミ ノ 酸 残 基 を 星 印 で 示 し た . 前 述 の 考 察 か ら 領 域2の 構 造 中 、 星 印 の ア ミ ノ 酸 残 基 に 相 当 す る も の が Glc‑
6‑
Pと の 結 合 に 関 与 し て い る こ と が 推 察 さ れ た . 特 に 、 こ れ ら の ア ミ ノ 酸 残 基 のう ち 、 ア イ ソ ザ イ ム 聞 の ギ ャ ッ プ 領 域 に 相 当 す る グ ル コ キ ナ ー ゼ の
2
つ の ア ミ ノ 酸 残 基 ( ト リ プ ト フ ァ ン と セ リ ン 〉 が 重 要 で あ る と 思 わ れ る . この ギ ャ ッ プ 領 域 は 、 第4
番 目 のβ構 造 中 に 含 ま れ る こ と が 酵 母 ヘ キ ソ キ ナ ー
ゼ のX線 解 析 か ら 明 ら か に さ れ て い る (l3). お そ ら く 、 ア イ ソ ザ イ ム 進 化 に 伴 う ギ ャ ッ プ 領 域 の ア ミ ノ 酸2
残 基 の 欠 失 が 、 構 造 変 化 を 引 き 起 こ し 、 結 果 と し て Glc‑
6‑
Pに 対 す る 感 受 性 の 獲 得 に つ な が っ た の で は な い か と 思 わ れ る .本 研 究 に お い て 、 ヘ キ ソ キ ナ ー ゼ と グ ル コ キ ナ ー ゼ の 機 能 的 性 質 を 決 定 づ け る 構 造 的 特 徴 を 明 ら か に す る う え で 非 常 に 有 用 な 以 下 に 示 す 知 見 を 得
る こ と に 成 功 し た
.
①
ATPと の 結 合 は 、 非 常 に 限 定 さ れ た 部 位 の1
次 構 造 ( お そ ら く 2の領域〉が 重 要 で あ る
② グ ル コ ー ス と の 結 合 に は 、 個 々 の ア ミ ノ 酸 残 基 だ け で は な く 広 い 範 囲 の 立 体 的 な 構 造 が 重 要 な 役 割 を 果 た し て い る
③Glc
‑
6‑
Pに よ る 阻 害 反 応 に は 、 2の 領 域 の 構 造 ( 特 に ギ ャ ッ プ 領 域 〉 が 重 要 で あ るな お 本 研 究 で は 、 領 域 1お よ び 領 域4(Asp657、 Glu708、 Glu742を 含 む ) に つ い て 組 み 換 え を 行 う こ と が で き な か っ た . し か し な が ら 、 こ れ ら の ア
ミ ノ 酸 残 基 も ヘ キ ソ キ ナ ー ゼ の 触 媒 反 応 に 重 要 で あ る と 思 わ れ る こ と か ら 、 今 後 こ れ ら の 領 域 に お け る 組 換 え 体 も 作 製 ・ 解 析 す る 必 要 が あ ろ う .
4 7
参 考 文 献