Title
Effect of Selenium on Embryonic Development and Glutathione
Peroxidase in Japanese Quail (Coturnix japonica)( 内容の要旨
(Summary) )
Author(s)
SOPON WILAISON
Report No.(Doctoral
Degree)
博士(農学) 甲第518号
Issue Date
2009-09-09
Type
博士論文
Version
URL
http://hdl.handle.net/20.500.12099/33659
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氏
名(本胤籍)
主 指導 教 員
名 学位
の 種 類 学 位 記 番 号 学位授与年月 日学位授与の要件
研究科及び専攻研究指導を受けた大学
学位
論 文 題 目審
査 委 員会
SOPONWI旭SON (タイ王国)静岡大学
教授
森
誠博士(農学)
農博甲第518号
平成21年9月9日
学位規則第3条第1項該当
連合農学研究科
生物生産科学専攻静岡大学
E飽ctofSeleniumonEmbryonicDevelopment andGlutathionePeroxidaseinJapaneseQuail(α血Ⅷ血力卯血適
(ウズラの胚発生とグルタチオンペルオキシダーゼ
に対するセレンの影響)
主査静岡大学
副査静岡大学
副査岐阜大学
副査 信州大学 男 誠 滋 乙 公 珠 山 谷 野 杉森
大 小 授 授 授 授教
教
教
教
論 文 の内
容 の要
旨 本学位論文はニホンウズラを実験動物として､セレンの効呆を胚発生とグルタチオンペ ルオキシダーゼを指標として調べたものである｡すべての動物にとってセレンは微量の必 須栄養素である｡これまでのセレンの研究は主にセレンの持つ抗酸化作用に焦点が充てら れてきた｡最初にセレンタンパクとして同定され､機能が明らかになったグルタチオンペ ルオキシダーゼは､好気性代謝で産生される活性酸素による酸化ストレスから細胞を保護 する抗酸化辞素である｡酸化ストレスは､脂質､タンパク質､DNA等に損傷を与えること によって細胞機能に異常を引き起こすことが知られており､脈管系や神経系の疾患､癌化 等に関わっている｡哺乳類では7種類以上のグルタチオンペルオキシダーゼが同定されて いるが､そのうち細胞質グルタチオンペルオキシダーゼ(GPXl)が最初に同定され､丑的 にも豊富なセレンタンパクであり､もっとも重要な抗酸化酵素の1つであると考えられて いる｡GPXlは哺乳類で広く研究されているが､鳥類ではまだ研究が進んでいない｡が多くの器官で機能していることを示している｡このようにウズラGPXlの塩基配列を決定 したことによって､これを使って家禽のGP‡1関連の研究のためのモデル動物としてウズラ を使用することが可能となった｡ 第3章では､GPIlの発現に対するセレンの効果を観察するため､セレン欠乏飼料に既知
濃度のセレンを添加して飼育した母′ウズラから有樺卵を集め､母ウズラと紳化した初生椒
の肝牌中のGPXlmRNAをRT-PCRで測定した｡その結果､セレン欠乏飼料の給与では初生雛 のGP‡1mRNAレベルが有意に減少し､母ウズラから卵に移行したセレンが雛のGPXl発現に. 影響することを示した｡この結果は､飼料中のセレンが､抗酸化酵素GPXlを介して発生中 の胚を保護すること､およびGPXlmRNAの測定がセレンの状態と抗酸化状態を評価するた めの指棲となりうることを示している｡また胚発生過程における発現を調べた結果､GPXl は絆化6日目から貯化当日までのすべてのステージで発現しており､GPXlが胚発育全般に 重要な酵素であることが示された｡ 第4章ではGPXl発現のための飼料中セレンの適正水準を決定し､絆化率に対するセレン の効果を測定するために､次の実験では､0.24ppmのセレンを含んだ市販飼料を標準飼料 とし､さまざまな濃度のセレンを添加した飼料でウズラを飼育した｡その結具､0.25ppmセ レンの添加によってGPXlmRNAレベルはプラトーに達した｡卵の卵穀厚やハウユニット等 の卵質も 0.25ppmセレンの添加で改善され､絆化率も上昇した｡この蘇果は､初生雛の 肝臓中のGPXlmRNAの上昇とも一致していた｡これらの結果から母ウズラとその次世代の GPXlmRNA発現を維持するためには､母ウズラの飼料中で0.49ppmのセレンが適正水準で あることが示された｡0.99ppmまたは1.99ppmのセレン濃度は産卵率には影響しなかっ たものの､解化率は減少し､過剰のセレン給与が胚発生に悪影響を及ぼすことも明らかと なった｡ 第5章では胚発生と卵中のセレン濃度の範囲を決定するために､最後の実験では有精卵 にセレンを直接投与した｡その結果は少量のセレンがGPXlmRNA発現に重要であることを 明確に示すとともに､G門1mRNAがプラトーになる以上のセレン濃度は､逆に紳化率の低 下や胚に対する毒性､発生停止を引き起こし､卵中のセレンのLD50は0.87ppmであった｡ セレンの持つこのような正の効果と負の効果は非常に狭い範囲にあり､セレンの添加は特 に繁殖個体では慎重に考えられるべきものと思われた｡ これらの結果を受け第6章ではセレンの効呆を総合的に考察しているが､ウズラのGPXl はセレンによって調節を受けており､体内のセレン状態を反映しており､セレンはGPXl を介して胚の保護機能を示していること､そして繁殖うずらの飼料中セレンの適正水準は 0.49ppmで､このレベルを超えると解化率を低下させることによって悪影響を示すことを 示し､適正水準であれば最適なGPXlmRNA発現､卵質､および絆化率が改善され､過剰に なると発生毒性を示し貯化率が低下することになることを証明した｡審 査 結 果 の
要
旨本学位論文は､動物にとって必須微量元素の一つであるセレンを産卵ウズラに
給与し､その抗酸化作用と毒性について､特に胚発生に対する影響と肝臓1型グ
ルタチオンペルオキシダーゼの誘導に着目して調べたものである｡
公開学位論文発表会は､審査委貞全員を含む関連教員や学生の出席のもと､平
成21年8月6日(木)午後1時より静岡大学農学部A棟110第3小会議室に
おいて実施された｡発表の内容は充実しており､本申請者は質問に対してほぼ的
確に応答した｡終了後引き続き､論文内容を中心に審査委員会を開催した｡
本論文では､まず､自然界におけるセレンの分布､哺乳類におけるセレンの代
鮒様式､セレン含有タンパク､これまでに知られているセレンの欠乏や過剰によ
るヒトの異常症を概説し､次に､哺乳類で6種類の存在が確罷されているグルタ
チオンペルオキシダーゼのなかで､過酸化状態から細胞を守るために活性酸素を
除去する強い作用を持っている1型グルタチオンペルオキシダーゼ(GPXl;細胞
質型)に焦点を当てた理由や､実験動物としてニホンウズラを選択した理由を述
べている｡
続いて､本研究の重要な道具となるGPXlをウズラでクローニングするため,成
熟雌ウズラの肝臓からRMを抽出し,各種哺乳類GPXl辻伝子の塩基配列の保存性
の高い部分から推定したプライマーを用いて逆転写PCR反応をおこなった｡212
塩基対のcDNAから5J-および3,-RACE法によって843塩基対の全長を決定した｡
これには153アミノ酸残基に相当するオープンリーディングフレーム,5'一束端非
翻訳領域7塩基対及び3し末端非翻訳領域377塩基が含まれていた｡通常は停止コ
ドンである士GAがセレノシステインのコドンとして使われていた｡アミノ酸配列
を比較したところ,ウズラGPXlは哺乳類と65"74%の相同性を示した｡得られ
た塩基配列から設計したプライマーでPCR反応をおこない組織特異性を調べた結
果､GPXl劇仏は腎臓,副腎,肝臓,小腸,心臓,胸筋といったすべての臓器で
発現していた｡
さらにセレン欠乏飼料を給与した雌ウズラでは､肝臓のGPXlm即岨が減少するこ
と､およびこのような雌ウズラが産んだ受精卵では鰐化率が低いことを示した｡
これらの変化はセレン欠乏飼料にセレンを添加することによってほぼ回復するこ
とも示した｡通常の市販飼料にセレンを添加してその有効量を産卵に及ぼす影響
や肝臓のGPXlm帥Aの変化から検討した｡その結果､セレンの添加は､卵重､ハウ
ユニット､卵殻重､卵殻厚に影響を及ぼすこと､肝臓GPXlm即仏が有意に上昇する
こと､粁化率に影響すること､貯化したヒナの肝臓GPXlm脚Aに影響すること､等
が明らかになり､0.25ppmのセレンの給与が有効量であることを示すとともに､
それ以上のセレンでは効果がないことを示した｡
最後に受精卵にセレンを直接添加し､僻化率や胚発生の停止を親展した｡
も十分になされていると判断した｡慎重に審議した結果､事査季長全長一致で本
論文が岐阜大学大学院連合農学研究科の博士(農学)の学位論文として充分価値
あるものと私めた｡
学位論文の基礎となる学術独文は以下の通りである｡
1. Sopon Wilaison and Nakoto Nori:rCloning and expression of ce11ular
glptathioneperoxidase(GPXl)inJapanesequail(Cbtumixj4POnica).Journal
of Poultry Science,46:52-58,2009
2.Sopon甘ilaisonandMakotoMori:EffectofSeleniumonHatchabilityand
Cellular Glutathione Peroxidase mRNA Expression during Embryogenesisin
