遺伝子工学的手法を用いた植物病原細菌および土壌細菌のモニタリングシステムの確立
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(2) 博 士 学 位 論 文 遺 伝 子 工 学 的 手 法 を用 い た植 物 病 原 細 菌 お よ び 土 壌 細 菌 の モ ニ タ リン グ シ ス テ ム の 確 立. 近畿 大 学. 大 学 院. 農学研 究科 農学専 攻 角. 谷. 晃. 司.
(3) 次. 目. 第1章. 緒. 言. 1. 4. 第2章. 植 物 病 原細 菌 の モ ニ タ リ ン グ法 の 開発 4. 第1節. 緒. 第2節. 実 験材料 と方法. 口 ρ 0 6. 第1項. 供試青枯病 菌. 第2項. 青 枯 病 菌バ クテ リオ ブ ァ ー ジ の 分 離 と バ ク テ リ オ フ ァ ー ジDNAの. 第3項. 精 製. 青 枯 病 菌 バ ク テ リ オ フ ァ ー ジDNAに. 6 よる. トラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン. 8. 1. CaCl,・MgCl、. 2. エ レ ク トロ ポ ー レー シ ョ ン法. 法. 供 試 プ ラス ミ ドとそ の接 合 伝 達. 第4項. 8. 9 9. 1.. Biparentalmating法. 10. 2. Triparentalmating法. 12. 3. 青 枯 病 菌 染色 体DNAの 抽 出. 12. 4. サ ザ ンハ イブ リ ダイゼ ー シ ョン分 析 と コ ロニ ーハ イ ブ リダ イゼ ー シ ョン分 析. 青 枯 病 菌 プ ロモ ー ター の分 離. 第5項. 13 14. 1.. 青 枯 病 菌 の ゲ ノ ミ ック ラ イ ブ ラ リ ーの 作 製. 14. 2.. プ ラ ー クハ イ ブ リダ イゼ ー シ ョン分析. 15. 3.. 塩基 配列 決定. 15. 4. β 一glucuronidase活. 性 の 測 定. 一1一. 15.
(4) 第3節. 結 果 お よび考 察. 第1項. 16. 青 枯 病 菌 バ クテ リオ フ ァ ー ジの 諸 性 質 と. 青 枯 病 菌 識 別へ の 利用. 16. 第2項. 青枯 病 菌 へ の 遺伝 子 導 入 に よる標 識 法 の確 立. 25. 第3項. 青 枯 病 菌 で 機 能す る宿 主 プ ロモ ー ター の 分 離 と ベ ク タ ー系 の 開 発. 第4項. 第3章. 33. 遺 伝 子 標 識 した青 枯 病 細 菌 の植 物 体 内 に お け る挙 動 の解 析. 39. 根 面 棲 息 性 細 菌 へ の 遺 伝 子 標 識 法 の適 用. 44. 第1節. 緒. 面. 44. 第2節. 実験材料 と方法. 45. 根 面棲息性細菌の分 離 と遺伝子標 識. 第1項. 45. 1.. 根 面棲息性細菌 の分離. 45. 2.. 根 面 棲 息 性 細 菌 の抗 菌性 試 験. 46. 3.. 根 面 棲 息 性 細 菌 の根 面 定着 性 試 験. 46. 4.. 根 面 棲 息 性 細 菌 の遺 伝 子標 識 と サ ザ ンハ イ ブ リ ダイゼ ー シ ョン分析46. 5.. キ チ ン分 解 性 放線 菌 の分 離 と生 理 学 的 特 性47. 第2項. 第3節. 根 面 棲 息 性 細 菌 の根 面 定 着 性 の 評 価47. 1. キ チ ン分 解 性 放 線 菌 の分 離47. 2. キ チ ン分 解 性 放 線 菌 の キ チ ナ ー ゼ分 析48. 3. キ チ ン添 加 土 壌 に お け るキ チ ン分 解 性 放 線 菌 の 増 殖 一一4g. 4. 二 元 性微 生 物 防 除法 に よる防 除試 験4g. 結. 果. 50. 一2一.
(5) 根 面 棲 息性 細 菌 の分 離 と遺 伝 子 標 識. 50. 1.. 抗 菌 活 性 を有 す る根 面 棲 息 性 細 菌 の 分 離. 50. 2. 根面棲息性細菌 の遺伝子標識. 52. 3. 遺 伝 子 標 識 した根 面棲 息 性 細 菌 の. 第1項. キ チ ン分 解 産物 の 資化 性. キ チ ン分 解性 放線 菌 の 分 離 とそ の 生理 学 的 特 性 一一一57. 第2項 1.. キ チ ン分 解 性 放 線 菌 の キ チ ナ ー ゼ 生 産57. 2.. キチ ン添加 土 壌 にお け る キ チ ン分 解 性 放 線 菌 の増 殖 一60 二 元 性 微 生 物 防除 法 の確 立61. 第3項 第4節. 第4章. 55. 考. 察. s3. 総 合考察. 68. 引用文 献. 73. 謝. 辞. 85. 要. 約. 86. Summary. 91. 一3一.
(6) 第1章. 緒. 言. 植 物 病 原 菌 の うち 、 土 壌 中 に 生存 す る病 原 体 が 植 物 の 侵 入 す る こ と に よ っ て 起 こ る 疾 病 を土 壌 伝 染 性 病 害 あ る い は 土:壌 病 害 と い う 。 こ の よ う な 病 原 体 が 細 菌 や 菌 類 で あ る 場 合 、 一 般 に 、 こ れ を土 壌 伝 染 性 病 原 菌(あ 病 菌)と. る い は土 壌. 呼 ぶ が 、 そ れ ら は 分 類 学 的 に 特 定 の 微 生 物 で は な く、 ま た そ の 生 存. 感 染 様 式 も多 岐 に わ た る こ とか ら、 効 果 的 な 防 除 法 の 適 用 が 困 難 と さ れ て い る。 本 研 究 で は 、 こ の よ うな土 壌伝 染 性 病 原 菌 の うち 、 多 数 の ナス 科 植 物 に 重 大 な 被 害 を 引 き起 こ す 、 青 枯 病 菌(PseudomonassolanacearumSmith) に 着 目 し た12,13・29,42,51・59・76・81)Q 青 枯 病 菌 は 、 細 菌 性 導 管 病 で あ る 青 枯 病(タ. バ コ の 場 合 は 立 枯 病 と称 す る). を ひ き 起 こ し 、 土 壌 中 で の 生 存 期 間 も 長 く13>、 一 度 発 病 し た 畑 土 壌 中 で は 少 な く と も数 年 間 は 発 病 に 要 す る 細 菌 密 度(104細. 菌/19土. 壌)が. 保持 されて い. る と さ れ て い る。 こ の よ うな青 枯 病 菌 の 土 壌 中 で の 生 存 様 式 に つ い て は 、 土 壌 の 物 理 化 学 性 と も密 接 な 関 わ りの あ る こ と が示 唆 さ れ るが 、 季 節 的 変 動 や 土 壌 深 度 に お け る 病 原 菌 の 消 長 に つ い て は 不 明 な 点 も多 い 。 本 菌 は 、 移 植 や 中 耕 の 際 に 生 じ た根 の 傷 口 の ほ か 、 線 虫 お よ び 土 壌 昆 虫 に よ る 食 痕 な ど か ら侵 入 し 、 タバ コ な ど で は 不 定 根 が 発 生 す る 際 に 生 じ る 自 然 破 壊 溝:か ら も 侵 入 す る と報 告 さ れ て い る13,59'99)。侵 入 の 様 式 は 、 土 壌 湿 度 、 土 壌 水 分 な ど の 物 理 的 要 因 に加 え 、 青 枯 病 菌 の 密 度 や 他 の 土 壌 微 生 物 の 密 度 な ど と も密 接 に 関 連 して い る が 、 宿 主 の 傷 口 か ら ど の 程 度 の 青 枯 病 菌 が 侵 入 す れ ば 発 病 す る か に つ い て は 明 らか に さ れ て い な い 。 発 病 の 頻 度 は 、 土 壌 に生 存 す る宿 主 植 物 の 根 数 に も 関 係 す る よ うで あ っ て 、 非 常 に 複 雑 な 土 壌 生 態 的 要 因 に よ って 支 配 さ れ て い る が 、 一 般 に 、罹 病 植 物 体 根 部 か ら滲 出 した 病 原 菌 が 健 全 植 物 体 へ 伝 搬 さ れ る こ と に よ っ て 、 発 病 が. 1.
(7) 拡 大 す る 。 ま た 、 本 病 発 病 につ い て の 感 受 性 品 種 と抵 抗 性 品 種 の 品 種 問 差 異 も論 じ られ て い る が41・98・1°4)、 そ の 機 構 に つ い て は な お 不 明 な 点 が 多 く残 さ れ て い る 。 こ れ ら の 理 由 と し て 、 本 病 原 菌 の 分 離 ・同 定 に 際 して 通 常 の 細 菌 学 的 手 法 の み な らず 電 子 顕 微 鏡 観 察 を要 す る こ と か ら、 本 菌 の 動 態 に 関 す る 研 究 お よ び 知 見 が 乏 しい こ とが 指 摘 さ れ る 。 本 研 究 で は 、 植 物 病 原 菌 以 外 に 、 土 壌 中 に 生 存 し、 病 原 菌 に 拮 抗 し て い る 微 生 物 に つ い て も取 り上 げ た 。 土 壌 中 で は 、 微 生 物 は お 互 い 相 補 した り拮 抗 し な が ら生 活 し て お り、 特 定 環 境 下 に お い て は 、 競 争 、 抗 菌 、 静 菌 作 用 な ど の 相 互 反 応 の 効 果 を もた らす 。 した が っ て 、 こ れ らの 総 合 的 な 作 用 を 利 用 す る こ と に よ っ て 、土 壌 中 に生 存 す る土 壌病 原 菌 の 密 度 を 低 下 さ せ 、 そ れ ら に よ る 被 害 を抑 制 す る こ と が で き る 。 と く に 、 拮 抗 微 生 物 の 利 用 は 、 生 物 防 除 (バ イ オ コ ン ト ロ ー ル)4,2°,49,1°9>と し て 古 くか ら 用 い ら れ 、 わ が 国 で は 、 TrlchodermaIignorumに. よ る タバ コ 白 絹 病 の 防 除 が 試 み ら れ て い る 。 こ の よ. う な 拮 抗 微 生 物 の 生 存 様 式 に つ い て は 、 植 物 の 分 泌 す る 有 機 物 を摂 取 し て 植 物 体 の 根 部 周 辺 や根 の 表 面 で棲 息 す る とされ てい るが 、 土 質 、 土 壌 成 分 あ る い はpHな. どの 物 理 的 要 因が 微 生 物 密 度 に 及 ぼす 影響 に つ い て は 、 一 定 の 見 解. が 得 ら れ て い な い の が 現 状 で あ る。一 方 、汚 染 土 壌 中へ の 緑 肥 お よび キ チ ン な ど の 施用 は 、拮 抗 微 生 物 の増 殖 に有 利 な環 境 条 件 へ と改 善 す る こ とが で き る が71)、. どの 程 度 の拮 抗 微 生 物 が増 殖 す れ ば 、 発 病 を抑 制 で き る か に つ い て. は 明 らか に さ れ て い な い 。 以 上 の よ う に 、 土 壌 病 原 菌 の 土 壌 お よび 植 物 体 内 に お け る 動 態 は 複 雑 か つ 多 岐 に わ た る 要 因 に 支 配 さ れ 、 特 に そ れ らの 密 度 は 環 境 の 変 化 に 伴 っ て 変 動 す る 。 し た が っ て 、 そ れ ら微 生 物 の 動 態 を 正 確 に 追 跡 す る こ と は 極 め て 困 難 で あ っ て 、 多 くの 研 究 の 結 果 に つ い て 、 一 定 の 評 価 を す る こ と が で き な い の が 現 状 で あ る。. 2.
(8) 近 年 、 遺 伝 子 工 学 技術 の発 達 に伴 い 、 多 く の生 物種 に つ い て 遺 伝 子 の組 換 え 実 験 が 行 わ れ 、 植 物 病 理 学 の 分 野 で も、 こ の よ う な 技 術 を利 用 し て 、 病 原 菌 を 含 む 土 壌 微 生 物 の モ ニ タ リ ン グ 法 が 開 発 さ れ て き た28,4°・78,87・89)。 その た め に は 導 入 す る 遺 伝 子 の 選 定 、 遺 伝 子 導 入 法 の 確 立 お よ び検 出 法 の 簡 略 化 が と りあ わ け重 要 と さ れ る が 、 使 用 す る生 物 種 が 異 な れ ば 、 適 用 す る分 子 生 物 学 的 手 法 も異 な り 、 実 際 に 遭 遇 す る 技 術 的 問 題 も必 ず し も 同 一 で は な い 。 以 上 の 背 景 か ら、 本 論 文 で は 青 枯 病 菌 お よ び 拮 抗 微 生 物 の 動 態 を 解 析 す る た め の 基 礎 的 研 究 と して 、 前 者 に つ い て は 分 子 生 物 学 的 手 法 を 用 い て 遺 伝 子 導 入 法 お よび モ ニ タ リ ン グ に有 効 なベ ク タ ー 系 の 開 発 に 焦 点 を 合 わせ 、 遺 伝 子 標 識 さ れ た 菌 が 植 物 体 内 で ど の 様 に 挙 動 し て い る か を 明 らか に し よ う と し た 。 ま た 、 後 者 で は 、 実 際 の微 生 物 防 除 法 の 観 点 か ら、 遺伝 子 標 識 拮 抗 細 菌 の 動 態 に つ い て 明 らか に し よ う と試 み た 。. 3.
(9) 第2章. トマ ト青 枯 病 菌 に お け る モ ニ タ リ ン グ ン グ 法 の 開 発. 第1節. 緒. 言. 植 物 病 原 菌 の 動 態 を解 析 す る ため に は、 土 壌 や 宿 主 植 物 体 内 か らそ れ ら を 正 確 に 検 出 す る こ と が 必 須 の 条 件 とな る 。 こ の よ う な 植 物 病 原 菌 の 分 離 ・同 定 に は 、 従 来 か ら、 分 類 学 上 の 諸性 質 や 薬剤 に対 す る 感 受 性 を 利 用 し た 選 択 培 地 な ど が 利 用 さ れ て き た が 、 前 者 の 方 法 で は 検 出 に 多 大 の 労 力 と時 間 を 要 し 、 ま た 、 後 者 に お い て は 、 病 原 歯 が 同 一 種 で あ る 場 合 に は 、 そ れ ら を相 互 に判 別 で き な い な ど の 欠 点 が あ っ た 。 こ の よ う な 問 題 点 を 解 決 す る た め に は 、 検 出 方 法 の 感 度 を 高 め る と と も に 、 検 出 法 そ の も の も簡 便 化 す る 必 要 が あ っ た 。 こ の よ う な 観 点 か ら 、 本 研 究 で は 、 トマ ト 青 枯 病 菌(Pseud・monas solanacearum)を. 取 り上 げ 、 本 菌 の 効 率 的 な モ ニ タ リ ン グ シ ス テ ム を 確 立 す. る こ と に した 。 本 菌 は 多 く の ナ ス 科 植 物 に萎 凋 を 引 き起 こ す 多 犯 性 の 土 壌 棲 息 性 細 菌 で あ るた め 、適切 なモニ タ リ ングシステムが開発 され れば、 その挙 動解析 が可 能 と な り 、 トマ トや ナ ス な ど の 主 要 作 物 の 青 枯 病 防 除 に 基 礎 的 知 見 を 提 供 す る も の と 期 待 さ れ る 。 そ こ で 、 こ の よ う な研 究 の 第 一 段 階 と して 、 青 枯 病 菌 に 特 異 的 に 作 用 す る化 学 物 質 の 検 索 と青 枯 病 菌 へ の 検 出 マ.___カ ー 遣 伝 子 の 導 入 に よ る 遺 伝 子 標 識 法 の 研 究 を 行 った 。 特 異 的 抗 菌 物 質 に つ い て は 、 既 に 、 イ ン ドー ル68)お よ び そ の 類 縁 化 合 物 ゜2)が青 枯 病 菌 の 増 殖 を特 異 的 に 抑 制 す る こ とが 報 告 さ れ て い る 。 そ こ で 本 章 で は 、 特 に 、 生 物 学 的 要 因 に 焦 点 を合 わ せ 、 本 菌 に 感 染 す るバ ク テ リ オ フ ァ ージの 分 離 と そ の 適 用 性 を検 討 す る こ とに し た 。 バ ク テ リ オ フ ァ ー ジ は そ のDNAが. 宿 主 染 色 体 に組 み 込 ま れ て プ ロ フ ァ ー ジ 化. 4.
(10) す る 溶 原 化(lySOgeniC)タ. イ プ2,11,14,23,35,46,1°6)と 感 染 後 す み や か に 複 製. 殖 し 、 宿 主 細 菌 を 溶 解 す る 溶 菌 化(1ytic)タ. ・増. イ プ2'11,14,35,45,1°6)に 分 類 さ れ る 。. と く に 、 後 者 の バ ク テ リ オ フ ァ ー ジ は 宿 主 細 菌 に 感 染 し て 溶 菌 斑(プ. ラ ー ク). を 形 成 す る の で 容 易 に 識 別 で き る こ と か ら、 微 生 物 遺 伝 学 や 分 子 生 物 学 の 重 要 な 研 究 対 象 と な っ て き た39'44,46,1°6>。 植 物 病 理 学 分 野 に お い て も 多 く の 植 物 病 原 細 菌 を宿 主 とす る バ ク テ リ オ フ ァ ー ジ が 分 離 さ れ て お り 、 イ ネ 白 葉 枯 病 (Xanthomonasoryzae)の 39,75,96,115). バ ク テ リ オ フ ァ ー一ジ は 同 病 の 発 生 予 察 に 利 用 さ れ. 、 ナ シ 火 傷 病 菌(Erwlniaamylovora)の. バ ク テ リ オ フ ァ ー ジ は 生. 物 防 除 法 に 利 用 さ れ て き た32'1°5)。 し か し な が ら 、 青 枯 病 菌 の バ ク テ リ オ フ ァ ー ジ に 関 し て は 、Hendrick43)、Tanakag9)、Okabe77)お. よ び 小 野 ら79)の. 報 告 が あ. る もの の 、 核 酸 レ ベ ル の 研 究 が ほ と ん ど な さ れ て お らず 、 バ ク テ リ オ フ ァ ー ジ を用 い た 青 枯 病 菌 の 識 別 法 を 開発 す るた め に は 、 まず 、 バ ク テ リオ フ ァ ー ジ の 緒 性 質 を 明 ら か に す る こ と が 必 要 で あ る と思 わ れ た 。 近 年 、 遺 伝 子 工 学 技 術 の 発 展 に 伴 い 、 分 子 生 物 学 的 手 法 を用 い て 植 物 病 原 細 菌 の 動 態 を モ ニ タ ー す る 手 法 が 開 発 さ れ28・4° ・78・87・89)、 植 物 と 病 原 菌 の相 互 作 用 に 関 す る研 究 が 試 み ら れ て い る 。 こ れ らの 研 究 に お い て は 、 マ ー カ ー 遺 伝 子 の 導 入 が 必 須 と な る の で 、 導 入 効 率 や 導 入 遺 伝 子 の 発 現 検 出 に優 れ た ベ ク タ ー 系 が 開 発 され て きた 。 な か で も 、 グ ラ ム陰 性 細 菌 にお い て効 率 良 く機 能 す る 複 製 開 始 配 列 の 発 見 は 広 域 宿 主 プ ラ ス ミ ド ベ ク タ.__.の 作 製 を 可 能 と し 16,21・60・74) 、 ま た 、 トラ ンス ポ ゾ ン は 、 マ ー カ ー遺 伝 子 を組 込 む と と もに標 的 細 菌 に お い て 安 定 的 に 継 代 さ れ る こ と か ら 的 確 な 検 出 を 可 能 と し た fi,8,9,84,89,94) 。 一 方 、 マ ー カー 遺 伝 子 と して は、 抗 生 物 質 抵 抗 性 遺 伝 子 が 検 出 マ ー. カ. ー. と. 一glucuronidase生. し て 、. ま た 、. β 一galactosidase生. 産 遺 伝 子53)お. よ びluciferase生. 産 遺 伝. 、. β. 産 遺 伝 子 オ ペ ロ ン. 5・3°,40・47,58・7g,87,gs)な どが レポ ー タ ー マ ー カ ー と し て 利 用 さ れ. 5. 子28). 、 植 物 病 原 細 菌 の.
(11) 挙 動 を 可 視 的 に 検 出 す る こ と に 成 功 して い る 。 こ の よ う な 遺 伝 子 工 学 技 術 を P.s。lanacearumに. 適 用 す る こ とが 本 章 の 主 要 課 題 と な る が 、 青 枯 病 菌 に お. け る 遺 伝 子 導 入 法 の 確 立 に は 、 導 入 遺 伝 子 の 発 現 を保 証 す る シ ス テ ム が 必 要 と な る 。 こ の よ う な 条 件 を満 足 さ せ る た め 、 青 枯 病 菌 に お い て 強 力 に 作 動 す る プ ロ モ ー タ ー の 分 離 と そ の 解 析 を行 う こ と に し た 。. 第2節. 第1項. 実 験 材 料 と方 法. 供試青枯 病菌. 本 実 験 に は 、 青 枯 病 菌(Pseudomonassolanacearum)の 株 、K-101株. 、K-102株. お よ びNE-1株. の5菌. 株 は 日本 た ば こ産 業 横 浜 研 究 セ ン タ ー 田 中. 株 を 用 い た 。U-10株 博 氏 か ら 、NE-1株. 場 岡 山 健 夫 氏 か ら 分 譲 さ れ た 。 ま た 、K-1C1株 お い て 、 トマ. 、U-10株. とK-102株. 、U-166. お よ びU-166 は奈 良 農 業 試 験. は筆 者 ら の研 究 室 に. トお よ び ナ ス の 青 枯 病 罹 病 個 体 か ら そ れ ぞ れ 単 離 さ れ た 分 離 株. で あ る 。. 第2項. 青 枯 病 菌 バ ク テ リ オ フ ァー ジ の 分 離 とバ ク テ リ オ フ ァ ー一ジDNA精. 製. 近 畿 大 学 農 学 部 実 験 圃 場 内 の 青 枯 病 発 病 試 験 圃 場 か ら 採 集 し た 土 壌(1g) に 滅 菌 水 を 加 え 、30分. 間 強 振 し た 後 、 ミ リ ポ ア フ ィ ル タ ー(孔. で 無 菌 濾 過 し た 。 得 ら れ た 濾 液 を100,000×9,4℃. で60分. 径,0.45,um). 間遠 心 分 離 し、沈. 渣 を 滅 菌 水 に 懸 濁 し て 試 料 液 と し た 。 バ ク テ リ オ フ ァ ー ジ の 指 示 菌 に はU-10 株 を 用 い た 。 ま ず 、 本 菌 液 をPCG固 109の. グ ル コ ー ス,お. よ び1,5%の. 形 培 地(109の 寒 天 を11の. 6. ペ プ ト ン,19の 水 に 溶 解)上. カ サ ミ ノ 酸,. 面 に 全 面 塗 沫 し、.
(12) 30℃. で24時. 間 培 養 し て 細 菌 ロ ー一ン を 作 製 し た 後 、 上 記 の 試 料 液 を 滴 下 し た 。. 2日. 間 静 置 培 養 し た 後 、 溶 菌 斑(プ. ラ ー ク,plaque)を. て 滅'菌 水 に 浸 漬 し 、 そ の 無 菌 濾 液(ま ∼107細. 菌/mlに. 含 む 培 地 を 切 り取 っ. た は そ の 希 釈 液)をPCG軟. 調 整 し た 指 示 菌 を 含 み 寒 天 濃 度 を0 。6%に. 固 形 培 地 上 に 重 層 し た 後 、24∼30時. 寒 天 培 地(105. 調 製)と. 混 合 し、 同. 間 培 養 し て 、 単 一 プ ラ ー ク を分 離 し た 。. こ の よ う な 単 プ ラ ー ク 分 離 操 作 を数 回 く りか え し 、 最 終 的 に 得 られ た プ ラ ー ク か ら 単 離 バ ク テ リ オ フ ァ ー ジ を得 た 。 上 記 で 単 離 し た バ ク テ リ オ フ ァ ー ジ を 大 量 増 殖 さ せ る 場 合 に は 、 対 数 増 殖 期 ま で 前 培 養 し た 指 示 菌 を 新 し く調 製 し たPCG液. 体 培 地 に 移 し 、1細. ジ を 加 え 、 さ ら に24時. 間30℃. 菌 当 た り1∼5粒. で 振 盟 培 養 し た 。 得 ら れ た 培 養 濾 液 か ら溶 菌 残. 渣 を 除 去 す る た め 、10,000×9,4℃ 113)Maniati. s65)の. 子 と な る よ うバ ク テ リ オ フ ァ ー. で15分. 間 の 遠 心 分 離 を 行 い 、Yamamotoら. 方 法 に 従 っ て 上 清 中 の バ ク テ リ オ フ ァ ー ジ 粒 子 を沈 殿 濃 縮. し た 。 す な わ ち 、 上 清 液 に ポ リ エ チ レ ン グ リ コ ー ル6000を10%と ま た 、NaClを1Mと. な る よ う 加 え 、12,COO×g,4℃,15分. な る よ う に 、 間 の遠 心 分 離 で バ. ク テ リ オ フ ァ ー ジ 粒 子 を 沈 降 さ せ た 。 得 られ た バ ク テ リ オ フ ァ ー ジ は 少 量 の SM緩. 衝 液(100mMのNaCIと7mMのMgSO4・7H20を. 含 む50mMTris-HCI,pH7.5). に 懸 濁 し た の ち 、 塩 化 セ シ ウ ム 密 度 平 衡 遠 心 法 に よ っ て さ ら に 精 製 した 。 塩 化 セ シ ウ ム の 密 度 勾 配 は1.30∼1.509/cm3と. し 、Kontron社. ア ン グ ル ロ ー タ ー を 使 用 し て 、221,900×9で16時 55-2Ti型. 間 、 も し く はBeckman社. ア ング ル ロ ー タ・ 一 を 使 用 し て 、85,000×9,40時. 分 画 さ れ た バ ク テ リ オ フ ァ ー ジ 帯(図1)を. 製 の65-90039型 製. 間遠 心 分 離 を した。. 注 射 器 を 用 い て 抜 き取 り 、 上 記. の 緩 衝 液 中 に 透 析 し て 精 製 バ ク テ リオ フ ァ ー ジ と した 。 バ ク テ リ オ フ ァ ー ジ DNAの. 抽 出 は 、Maniatis66)の. オ フ ァ ー ジ 液 にRNaseAとDNaselを に 加 え 、37℃. で30分. 方 法 に従 っ た 。 ま ず 、 上 項 で 得 た 精 製 バ ク テ リ 最 終 濃 度 が そ れ ぞ れ5μg/mlに. な る よ う. 間 反 応 させ て 混在 す る 宿 主 の 核 酸 を 分 解 し た 。 つ ぎ に 、. 7.
(13) 図1. 塩 化 セ シ ウム密 度 平 衡 遠 心 分 離 法 で精 製 さ れ たバ ク テ リオ フ ァー ジ 帯 (矢印 の部 位). EDTAとSDSを. そ れ ぞ れ 最 終 濃 度 が10mMと0.1%に. 加 温 し た 後 、TE緩. 衝 液(1mMのEDTAを. な る よ う 加 え 、65℃. で15分. 含 む10mMのTris-HCI,pH8.0)飽. 間 和. フ ェ ノ ー ル 溶 液 、 フ ェ ノ ー ル ・ク ロ ロ ホ ル ム ・イ ソ ア ミ ル ア ル コ ー ル 混 液 (24:24:1,v/v)な (24:1,v/v)を. ら び に ク ロ ロ ホ ル ム ・イ ソ ア ミ ル ア ル コ ー ル 混 液 用 い て 除 蛋 白 処 理 を行 っ た 。 遠 心 分 離 後 、 上 清 に 等 量 の イ ソ. プ ロ ピ ル ア ル コ ー ル を 加 え 、 沈 殿 し た バ ク テ リ オ フ ァ ー ジDNAを し 、TE緩. 減 圧 下 で 乾 燥. 衝 液 に 溶 解 した 。. 第3項. 青 枯 病 菌 バ ク テ リ オ フ ァ ー ジDNAに. よ る トラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン. 1.CaCl2・MgCl2法 バ. ク テ. リ オ. フ. ァ ー. ジDNAを. 青 枯. 病. は 、MercerとLoutitのCaCl2・MgCl2法69)を. 菌 へ. 直 接. 導. 入. す. る. に 当. た. っ. て. 改 変 して 用 い た 。 す な わ ち 、 一 夜 前. 8.
(14) 培 養 し た 青 枯 病 菌 をPCG培. 地 に移 し 、 さ ら に3時. で 集 菌 した 菌 体 をCM溶 液(種. 々 の 濃 度 に 調 製 したCaCl2とMgCl2の. 濁 し、 コ ン ピ テ ン ト(competent)細 バ ク テ リ オ フ ァ ー ジDNAを 2∼3分. 混 合 液)に. 加 え 、PCG固. 懸. 胞 を調 製 し た 。 この コ ン ピテ ン ト細 胞 液 に 、. 添 加 し、 氷 中 に 約90分. 間 静 置 した 後 、37℃. 間 静 置 した 。 こ の よ う に して 得 ら れ た 細 菌 を 軟 寒 天PCG培. を 含 む)に. 2.エ. 間 振 盟 培 養 した後 、 遠 心 分 離. の温浴 に. 地(指. 示 菌. 形 培 地 上 に 重 層 し て プ ラ ー ク 形 成 の 有 無 を観 察 し た 。. レク トロポ ー レー シ ョン法. バ ク テ リ オ フ ァ ー ジDNAを. 青 枯 病 菌 に 導 入 す るた め の第 二 の 方 法 と してエ レ. ク トロ ポ ー レ ー シ ョ ン 法 を 用 い た 。 エ レ ク トロ ポ ー レ ー シ ョ ン に は 筆 者 ら の 研 究 室 で 考 案 さ れ た 電 極 装 置67)を 使 用 し た 。 ま ず 、 一 夜 前 培 養 した 対 数 増 殖 期 の 青 枯 病 菌 を 遠 心 分 離 で 集 菌 し、 滅 菌 水 に 懸 濁 した 後 、 異 な る濃 度 の バ ク テ リ オ フ ァ ー ジDNAと 隙 に注 入 した。. 混 合 し、 図2に. パ ル ス はFoefer社. パ ル ス 幅 を1∼70msec、. 示 し た 電 極(電. 極 間 距 離:400μm)の. 間. 製 の パ ル ス コ ン トロ ー ラ ー に よ っ て 制 御 し、. 電 場 強 度 を1∼25KV/cmと. 理 細 菌 を指 示 菌 と混 合 し、 前 項 と 同様 にPCG固. した 。 パ ル ス 印 加 後 、DNA処 形培 地 に重 層 して プ ラ ー ク形 成. の 有 無 を観 察 し た 。. 第4項. 供 試 プ ラス ミ ドとその接 合 伝 達. 本 実 験 に は 、 図3に. 示 す2種. 類 の プ ラ ス ミ ドpUCD623とpEND4Kを. こ れ ら の プ ラ ス ミ ド は そ れ ぞ れCalif・rnia大 Washington大 始 点(on)を 伝 子(raπ1P)と. 学 のE.Nester教. 学Davis校C.1.Kado教. 授 よ り 分 譲 さ れ た 。pUCD623は. 使 用 した 。 授 お よび 大 腸 菌 の 複 製 開. 持 ち 、 さ ら に薬 剤 抵 抗 性 マ ー カ ー と し て ア ン ピ シ リ ン 抵 抗 性 遺 ク ロ ラ ム フ ェ ニ コ ー ル 抵 抗 性 遺 伝 子(c皿. 9. 「)を 持 つ 。 ま た 、.
(15) θ圃. SILICON. 図2. エ レ ク トロ ボ ー レ ー シ ョ ン に 使 用 し た 電 極(A)と. そ の 模 式 図(B). こ の ベ ク タ ー は 接 合 伝 達 に 関 与 す る 伝 達 遺 伝 子(tra)を 在 す る ト ラ ン ス ポ ゾ ンTn4431に 伝 子(tet「)が. は 、1uxオ. 、pUCD623に. 存. ペ ロ ン と テ トラ サ イ ク リ ン抵 抗 性 遺. 存 在 す る5'3°'89)。 一 方 、pEND4Kは. き る 複 製 開 始 点(oriV)と. も ち. .. 広 域 グ ラム 陰性 細 菌 で 複 製 で. 接 合 伝 達 の 開 始 点(oriT)61)を. 遺 伝 子 と し て カ ナ マ イ シ ン 抵 抗 性 遺 伝 子(km・)を. 、 また、 マ ー カ ー. も つ6°)。. 1.Biparentalmating法 BiparentalmatingはShawら89)の 体 細 菌(大. 腸 菌HB101株)と. 方 法 を 改 変 受 容 体 細 菌(青. して 行 っ た. 枯 病 菌)をLB液. 。 す な わ ち 、 供 与. 体 培 地(10gの. バ. ク.
(16) 図3. プ ラ ス ミ ドベ ク タ ーpUCD623(A)とpEND4K(B)の. 模 式 図.. 各 遺 伝 子 の 略 語 を 以 下 に 示 す;tot`:テ. ト ラ サ イ ク リ ン 抵 抗 性 遺 伝 子,c皿f:ク. ラ ム フ ェ ニ コ ー ル 抵 抗 性 遺 伝 子,ramp:ア イ シ ン 抵 抗 性 遺 伝 子,」[1R:発 子,IacZ;β. 一galactosidase生. terminalrepeats,onV;グ transfer.制. ン ピ シ リ ン 抵 抗 性 遺 伝 子,始. 光 遺 伝 子(Iuxオ 産 遺 伝 子,on;複. ペ ロ ン),tnp:transposase遺 製. 開 始 点,IR;inverted. ラ ム 陰 性 細 菌 用 複 製 開 始 点,onT;originof. 限 酵 素 サ イ ト を 以 下 に 示 す:B;IslfrE;EcoRI,H;HindIIIr. Ps;Pstl.. 11. ガ:カ. ロ ナ マ 伝.
(17) ト ト リ プ ト ン,59の 解)ま. た はPCG液. イ ・ 一 ス ト エ ク ス ト ラ ク ト お よ び109のNaClを11の. 体 培 地 で そ れ ぞ れ対 数 増 殖 期 まで 振 盟培 養 し、遠 心 分 離 で 得. た 培 養 菌 体 を 滅 菌 水 で2回 細 菌/mlと. 水 に 溶. 遠 心 洗 浄 し た 。 そ れ ぞ れ の 細 菌 密 度 を 最 終 的 に109. な る よ う に 調 製 し 、 供 与 体 細 菌 液(100,ul)と. を 混 合 し た 。 あ ら か じ めMANY固. 形 培 地112)(109の. 受 容 体 細 菌(zoosl) バ ク ト ト リ プ ト ン,69の. イ ー ス ト エ ク ス ト ラ ク ト,10.59のKZHPO4,4.59のKH2PO4,19の(NH4)2SO 4,0.59のNa3C6H507・2HzO,0.0129のMgSO4,0.29の の 寒 天 を1の. 水 に 溶 解)上. ス ク ロ ー ス お よ び1.5%. に 置 い た ミ リ ポ ア フ ィ ル タ ー 膜(孔. に 上 記 の 細 菌 混 合 液 を 滴 下 し 、24時. 間30℃. で 培 養 し た 後 、 フ ィ ル タ ー膜 を 滅. 菌 水 に 浸 漬 し て 、 得 ら れ た 細 菌 懸 濁 液 を10μ9/m1の M9最. テ トラ サ イ ク リ ン を 含 む. 少 培 地65)(10.5gのK2HPO4,4.5gのKH2PO4,1.Ogの(NH4)2SO4,0.5gの. Na3C6H507・H20,0.29のMgSO4・7H20,2.09の 11の. 径,0.45μm). 水 に 溶 解)上. グ ル コ ー ス お よ び1.5%の. に 全 面 に 塗 沫 し た 。 約1週. 間28℃. 寒 天 を. で 培 養 し た後 、 培 地 上. で生 育 した 受 容 体 細 菌 を選抜 した 。. 2.Triparentalmating法 TriparentalmatingはDitta25)ら. の 方 法 を改 変 して行 っ た 。 す な わ ち 、前. 項 の 細 菌 混 合 液(300μ1)にpEND4Kを を 加 え 、 同 様 にMANY固. で1週. 大 腸 菌HB101株(100μ1). 形 培 地 上 の 膜 面 に 滴 下 し 、30℃,24時. フ ィル タ ー 一膜 浸 漬 液 を25μ9/m1の し 、28℃. も つ 第2の. カ ナ マ イ シ ン を 含 むM9最. 間 で 培 養 した 。 小 培 地上 に塗 沫. 間 培 養 した 後 、 良 好 な 生 育 を示 す カ ナ マ イ シ ン 耐 性 受 容 体 細. 菌 を選 抜 した 。. 12.
(18) 3.青. 枯 病 菌 染 色 体DNAの. 抽 出. 青 枯 病 菌 の 染 色 体DNAはXuら112)の. 方 法 に従 っ て 抽 出 した 。 す な わ ち 、 一 夜. 振 盟 培 養 し た 青 枯 病 菌 液 を10,000×9,4℃ 体 を1皿9/mlの. リ ゾ チ ー ム を 含 むTE緩. 分 間 保 温 し た 後 、SDSとNaC1を に 加 え て 、65℃. で1時. で10分. 間遠 心 分 離 し、 得 られ た 菌. 衝 液 に 懸 濁 し た 。 細 菌 懸 濁 液 を37℃. そ れ ぞ れ 最 終 濃 度1,5%お. 間 放 置 し た 。 そ の 後 、TE飽. よ び2Mと. 分 離 上 清 に3Mの. 液 な らび に ク ロ ロ. 液 で 除 蛋 白処 理 し、 そ の遠 心. 酢 酸 カ リ ウ ム 緩 衝 液(pH6,2)と100%エ. 出 し た 染 色 体DNAを. な る よ う. 和 フェ ノ ー ル 、 フ ェ ノー ル ・. ク ロ ロ ホ ル ム ・イ ソ ア ミ ル ア ル コ ー ル(24:24:1,v/v)混 ホ ル ム ・イ ソ ア ミ ル ア ル コ ー ル(24:1,v/v)混. で30. タ ノー ル を加 え 、析. 硝 子 棒 で 巻 き 取 っ た 。 得 ら れ たDNAはTE緩. 衝 液 に 溶 解 し、. 塩 化 セ シ ウ ム ー臭 化 エ チ ジ ウ ム 密 度 勾 配 遠 心 法 に よ っ て 精 製 し た 。. 4.サ. ザ ンハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン分 析 と コ ロ ニ ー ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン. 分 析 精 製 し た 染 色 体DNAを ル で1時. 間 電 気 泳 動(1∼2V/cm)し. ス フ ァ ー 装 置(LKB社 社 製,HybondECL)に ブDNA)と 製)を DNA転. 種 々 の 制 限 酵 素 で 切 断 し た の ち 、1%ア た 。 泳 動DNA断. 製,2016VacuGene)で. ガ ー ロ ース ゲ. 片 は 減 圧 吸 引 型DNAト. ニ ト ロ セ ル ロ ー ス 膜(Amersha皿. 移 し 、 標 識 し たlux遺. ハ イ ブ リ ダ イ ズ さ せ た 。DNAはECL遺. 伝 子 オ ペ ロ ン のDNA断. ロ ー. 結 合 さ せ て 標 識 し た11°)。. 移 な ら び に サ ザ ン ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン の 操 作 手 順 を 図4に. コ ロ ニ ー ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン はManiatisら66)の. 理 に よ っ て 染 色 体DNAを. で ハ イ ブ リ ダ イ ゼ.___シ ョ ン を 行 っ た 。. 13. 示 す 。. 方 法 に従 っ た 。 す な わ. 間 培 養 し た 細 菌 コ ロ ニ ー を ニ ト ロ セ ル ロ ー ス 膜(Millipore社. 付 着 さ せ 、0.1%SDS処. 片(プ. 伝 子 検 出 キ ッ ト(Amersham社. 使 用 し 、horseraddishperoxidase(HRP)を. ち 、24時. ラ ン. 製)に. 抽 出 した 後 、 上 記 と 同 様 の 方 法.
(19) 第5項. 1.青. 青 枯 病 菌 プ ロ モ ー タ ーの分 離. 枯 病 菌 の ゲ ノ ミ ック ラ イ ブ ラ リーの 作 製. 精 製 し た 染 色 体DNAを4塩 %し. 基 認 識 の 制 限 酵 素Sau3AIで. ょ 糖 密 度 勾 配 遠 心(122,000×g,4℃,20時. 画 し た 。 得 ら れ た15∼20kbのDNA断. 間)に. 片 を フ ァLジ. 連 結 し 、Hohn48>の. 方 法 に 従 っ てlnvitroパ. グ に は 舳ersham社. 製 のInvltroパ. 組 換 え 体 フ ァ ー ジ は 、10'4∼10'5倍 μ1)と. 混 合 し てNZY固. に は 大 腸 菌LE-392株 ト ン,2%マ 培 養(30℃)し. 片 を 分. ッ ケ ー ジ ン グ した 。 パ ッ ケ ー ジ ン. ッケ ージ ン グキ ッ トを 使 用 し た 。 得 られ た に 希 釈 し 、 そ のlooplを. ミ ン を11の. を 使 用 し 、TB液. よ っ てDNA断. ベ ク タ ー(λEMBL3)34)に. 形 培 地(59のNaCl,29のMgSO4,59の. ス ト ラ ク ト お よ び109のNZア. 部 分 分 解 し 、10∼40. 水 に 溶 解)上. 体 培 地(59のNaCl,109の. ル ト ー ス お よ び10mMのMgSO4・7H20を11の. 宿 主 細 菌 液(100 イ ー ス トエ キ. に重 層 した 。 宿 主 細 菌 バ ク ト トリ プ 水 に 溶 解)で. 一 晩 振 盟. た も の を 用 い た 。 以 上 の よ う に し て 作 成 した 重 層 プ レ ー ト を. 14.
(20) 37℃ で 一 晩 静 置 培 養 し、 形 成 さ れ た プ ラ ー ク を青 枯 病 菌 の ゲ ノ ミ ッ ク ラ イ ブ ラ リ ー と して 保 存 した 。. 2.プ. ラ ー ク ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン分 析. 前 項 で 得 ら れ た 組 み 換 え 体 フ ァ ー ジ を 使 用 し 、 約2000個 さ れ る よ う に 宿 主 細 菌 と混 合 してNZY固. 形 培 地 上 に 重 層 した 。 得 ら れ た プ ラ ー. ク 内 の フ ァ ー ジ を ニ トロ セ ル ロ ース 膜(Millipore社 ジ のDNAを. 抽 出 し た 。DNAの. の プ ラー クが 形 成. 製)に. 吸 着 させ た 後 、 フ ァ ー. 変 性 とハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン は 図4に. 示 した方. 法 に 従 っ た 。 す な わ ち 、 ニ トロ セ ル ロ ー ズ 膜 を 変 性 液 お よ び 中 和 液 に そ れ ぞ れ5分. 間 ず つ 浸 漬 し、80℃. で2時. 遺 伝 子 とハ イ ブ リ ダ イ ズ(12時. 間 ベ ー キ ン グ を し た 後 、HRP標 間,42℃)さ. 識 した1uxC. せた 。 洗 浄後 、分子雑 種形 成 プ. ラ ー ク を 前 項 で 記 述 した 方 法 に 従 っ て 発 光 に よ っ て 検 出 し、X線. フィル ムの. 感 光 部 分 に対 応 す る組 換 え体 フ ァ ー ジ を 選 抜 した 。. 3.塩. 基 配 列 決 定. 塩 基 配 列 の 決 定 はSangerら83)のDideoxy法 ル 処 理 に よ っ てM13フ (ApPliedBiosyste皿s社. ァ ー ジ か ら 抽 出 し た1本 製;ABI)を. 合 液(BoehringerMannhei皿. 塩 基 配 列 はDNAシ. 鎖DNAに. 蛍 光 プ ラ イ マ ー. ア ニ ー リ ン グ さ せ 、deoxy・dideoxy混. 社 製)とT7Sequenase(Toyobo社. し て 蛍 光 標 識 さ れ た 鋳 型DNAの DNAの. に従 っ た 。 す な わ ち 、 フ ェ ノ ー. 製)を. 混 合. 合 成 を 行 っ た 。 こ の よ う に し て得 られ た鋳 型. ー ク エ ン サ ー(ABI社. 製;370Aモ. デ ル)を. 用 い て 自 動. 分 析 し決 定 した 。. 4.β. 一glucuronidase活. β 一glucuronidase(GUS)1舌. 性 の 測 定 性. はJeffersonら. 15. の 方 法 に 従 い 測 定. し た54)。.
(21) す な わ ち 、 凍 結 分 離. ・ 溶 解 法24)で. し 、 そ の 上 清. を 酵 素 液. 破 壊 し たGUS生. で 数 分. 最 終 濃 度 が1.4mMと. 間 反 応 さ せ た 後 、4一. 光 分 光 光 度 計(Shimadzu社. 遠 心. な る よ う に加 え 、. 皿ethylumbelliferone(4-MU)の. 製,RF-5000)で. (nmol4-MU/min/皿9Protein)と. 測 定. 放 出 量 を 蛍 し 、. こ の 値. をGUS活. 性 値. し た 。. 第3節. 第1項. 数 増 殖 期)を. と し て 用 い た 。 酵 素 液 に 、 基 質 で あ る4-methyl. umbelliferylglucuronide(4-MUG>を 37℃. 産 性 細 菌 液(対. 結 果 お よ び考 察. バ ク テ リ オ フ ァ ー ジ の 諸 性 質 と青 枯 病 菌 識 別 へ の 利 用. バ ク テ リ オ フ ァ ー ジ を利 用 して青 枯 病 菌 を 識 別 す る場 合 、 青 枯 病 菌 に対 し て 感 染 性 を 示 し、 系 統 問 で 感 染 力 の 異 な る バ ク テ リ オ フ ァ ー ジ を分 離 す る こ とが 必 須 で あ る 。 今 回 の 実 験 で 、 近 畿 大 学 農 学 部 実 験 圃 場 か ら 分 離 し た バ ク テ リ オ フ ァ ー ジ を 青 枯 病 菌U-10株 ∼20個. に感 染 さ せ た と こ ろ 、1シ. ャ ー レ あ た り5. の プ ラ ー ク が 得 られ た 。 そ れ らを プ ラ ー ク 形 状 に 基 づ い て2種. 類 し た 。 小 型 で 周 縁 輪 郭 が 不 明 瞭 な プ ラ ー ク を 形 成 す る も の をS型 周 縁 部 の 輪 郭 が 明 瞭 な プ ラ ー ク を形 成 す る も の をL型 に 、双 方 の プ ラ ー ク を無 作 為 に 選択 し、数 回 の た 後 、最 終 的 にS型. か ら12系 統(SO1∼S12)、L型. 類 に分 、 大型 で. と し た(図5)。. つ ぎ. 単 プ ラ ー ク 分 離 を 繰 り返 し. か ら8系. 統(LO1∼LO8)の. ファ ー. ジ を 単 離 した 。 こ の よ う に し て 得 られ た 分 離 系 統 に つ い て は 、 ウ イ ル ス 精 製 法 と し て 広 く利 用 さ れ て い る 塩 化 セ シ ウ ム 密 度 平 衡 遠 心 分 離 法70・100)に よ っ て 粒 子 の 浮 遊 密 度 を 測 定 す る と と もに 、 電 子 顕 微 鏡 に よ っ て 粒 子 形 態 を 観 察 し た 。 浮 遊 密 度 に つ い て は 、S型 示 し 、L型. に 属 す る12系 統 の す べ て が1.469/3CII1の. の 分 離 系 統 で は1.509/cm3の. 値 が 得 ら れ た(図6)。. 16. 値 を. また 、 こ れ.
(22) 垂 鰯1 図5. S型. フ ァ ー ジ(A)とL型. フ ァ ー ジ(B)の. バ ク テ リ オ フ ァ ー ジ 液 に 指 示 菌(U-10株)を. 分 離. 混 合 した後 、. 4・ 1. 5 5. 5 4 1 .一.. § OO. り. 109. v 10$一. ξ 1・7己 106. Fraction 図6. 塩 化 セ シ ウ ム 密 度 勾 配 遠 心 分 離 法 に よ るS型(▲)お L型(●)フ. ァ ー ジ の 分 画.. 17. よび. ︾. 0 4 噛. 1010. ∩ ー. 4. 1. 0 5. A. (O∈ o＼9 ωΦ ≡ ω⊆Φ O. PCG寒 天 培 地 上 に 重 層 し 、24時 間 培 養 し た 。.
(23) ら の フ ァ ー ジ を3%酢. 酸 ウ ラ ン で 染 色 し、 透 過 型 電 子 顕 微 鏡 で 観 察 し た と こ. ろ 、 い ず れ の タ イ プ に属 す る フ ァ ー ジ も球 状 多 面 体 の 頭 部 を 有 した が 、 そ の 長 径 に 差 異 が 認 め られ 、S型. で は48±1nm、L型. で は41±1nmで. 、. 慧蔓 、. ず縫. 欝. 騨 ぐ. 覧 .. 磁. あ っ た(図7)。. ㎡. B. A. 図7. 酢 酸 ウ ラ ン 染 色 した 青 枯 病 菌 フ ァ ー ジS-03(A)とL-02(B)の. 電 子 顕 微 鏡 写 真.. ラ イ ン は50nmを 示 す 。. 尾 部 の 構 造 に つ い て は さ ら に 顕 著 な 相 異 が 認 め ら れ た 。 す な わ ち 、S型. フ ァー. ジ に は3本. の 尾 部 が 観 察 さ れ 、 そ の 長 さ は19±1nmで. フ ァ ー. ジ に は2本. の 短 い 尾 部(9±1nm)が. S型. フ ァ ー ジ とL型. 観 察 さ れ た(図7)。. あ っ た が 、L型. 以上 の実 験 に よっ て、. フ ァ ー ジ は 明 らか に 異 な る フ ァ ー ジ で あ る と判 定 さ れ た. の で 、 以 下 の 実験 で は、 これ らの フ ァ ー ジの 核 酸 にお け る相 異 点 につ い て 検 討 し た 。 まず 、 抽 出 した バ ク テ リ オ フ ァ ー ジ の 核 酸 に つ い て 、 ジ フ ェ ニ ル ア ミ ン お よ び オ ル シ ノ ー ル1°7)反 応 を 試 み た と こ ろ 、 い ず れ の フ ァ ー ジ 核 酸 も 前 者 に 陽 性 、 後 者 に 陰 性 を 示 し た こ と か ら 、 こ れ ら の フ ァ ー ジ はDNAフ あ る と 結 論 し た 。 そ こ で 、 こ れ ら のDNAを10種 I,Hind皿,MluI,PstI,PvuII,SalI. 類 の 制 限 酵 素(BamHI ,ScaI,XbaIお. 18. ァー ジ で ,EcoR. よ びXhoI).
(24) で 切 断 し、 各 酵 素 に よ る 切 断 パ タ ー ン を ア ガ ー ロ ー ス 電 気 泳 動 に よ っ て 解 析 した(図8)。. まず 、L型. フ ァ ー ジ を10種 類 の 制 限 酵 素 で 切 断 した 結 果 、 そ. A ll. 憧、. 1蘇. 華 鱒1'韓. 毒. き. 螺. 縛慧. 謎. 無. 鞭恥灘. 導7. 醤 馨. 讐. 緯. 駿鼎胃私. 瓢. 箏. 惣. 華 無. 轟. 商. 塗. 1234567891UU. 輔u鰻. 慰u"uuu"u 鎌軸 灘 概. 曽、謙. 纂論. 図8 S型. 編 齢繍. 1234J6789101 . フ ァ ー ジ(A)お. よ びL型. フ ァ ー ジ(B)DNAの. 制 限 酵 素切 断 断 片 の ア ガ ー ロ ー ス. 電 気 泳 動 分 析. フ ァ ー ジDNA(leg)は. 制 限 酵 素(10units)で. 分 解 さ れ(37℃. ス ゲ ル を 用 い て 電 気 泳 動 で 分 離 さ れ た(2V/cm 2)・E・ Pvull(レ XbaI(レ. ・RI(レ. ー ン3),Hindlll(レ. ー ン7),Sall(レ ー ン11)が. ,1時. ー ン4) ー ン8). ,M]ul(レ. ,Scal(レ. 使 用 さ れ た 。 レ ー ン1は. 間)。. 間)、1%ア. ガ ー ロ ー. 制 限 酵 素 に は.11(レ ー ン5),P、tl(レ. ー ン9),Xhol(レ. λ 伍ndIIIサ. 19. ,2時. ー ン ー ン6),. ー ン10)お. イズ マ ー カ ー を示 す. 。. よ び.
(25) れ そ れ の 制 限 酵 素 切 断 パ タ ー ン が 分 離 系 統 間 で 完 全 に 一 致 し た の で 、L型 8系. 統 は す べ て 同 一 の フ ァ ー ジ で あ る と 判 定 し た 。 ま た 、S型. い て も 同 様 の 実 験 を 行 っ た 結 果 、12系 と 判 定 さ れ た 。 そ こ で 、L型 統)に. フ ァ ー ジ(L-02系. ファ ー ジ に つ. 統 が 同一 フ ァー ジで あ る. 統)とS型. フ ァ ー ジ(S-03系. つ い て 、 そ れ ぞ れ の 制 限 酵 素 処 理 で 得 られ た 断 片 数 と 大 き さ を 検 討 し. た 。 そ の 結 果 、S-03の 0.7kbで. 統 の う ち10系. の. も つDNAの. 大 き さ は35.4±1.Okb、L-42の. あ る こ と が 明 ら か と な っ た(表3丁 表3.S-03DNAの. 制限酵素. 表4)。. 制 限酵 素 切 断 断 片 長. 断片数 n ∠. XhoI. そ れ は47.0±. 全 長(kb). 断 片 長(kb). 35.5. 17.8,7.fi,6.5,2.5,1.0. 35.4. 5. 20.5,15.0. SalI ρ 0. Sall十XhoI. ハδ. KpnI. 4ユ 4. Kpnl+XhoI ScaI. 戻﹂. Scal十XhoI. 15.5,7.6,6.5,2.5,2.3,. 1.035.4. 14.0,12.0,9.0. 35.0. 14.0,12.0,7.9,1.1. 35.0. 16.0,11.0,4.6,3.8. 35.4. 14.1,11.0,4.6,3.8,2.0. 35.5 35.35. 合言 S-03DNA(1μg)を. 種 種 の 制 限 酵 素(10units)で 切 断 し 、1%ア. 電 気 泳 動 で 分 離 し た 。 断 片 長 は λDNAHfηd皿1サ. ガ ロースゲ ル. イ ズ マ ー カ ー を基 準 と し て. 測 定 した 。. 表4.L-02DNAの. 制限酵素 XbaI XbaI十EcoRI MIuI. 断片数 2 3 4 2 3. EcoRI. MIuI十EcoRI. Kpnl十EcoRI PstI Pstl十EcoRI. 3 4 2 3. KpnI. 制 限酵 素 切 断 断 片 長 断 片 長(kb). 42.0. 34.0,8.0 27.0,14.5,. 0.9. 42.4. 15.0,14.5,. 8.0,0.9. 41.6 41.5. 39.0,2.5 34.3,5.5,. 2.5. 42.3. 26.5,14.0,. 1.1. 42.1. 20.0,14.0,. 6.2,1.7. 41.7 43.0. 42.5,0.5 34.0,7.5,. 0.5. 合計 L-02DNA(1f,cg)を. 全 長(kb). 42.0 42.07. 種 種 の 制 限 酵 素(10units)で 切 断 し 、1%ア. ル 電 気 泳 動 で 分 離 し た 。 断 片 長 は λDN鮒fnd皿 して 測 定 した 。. 20. ガtコ ー ス ゲ. サ イズ マ ー カ ー を基 準 と.
(26) ユ. エ. 9Σ. α. ユ. ユ. 工. 山. 工. 工. 工. 輔= 超. る 枯綿. 工. 、 畠 幅窟 ミ. ㎝◎り. 、 薯 蝋︻昌. Ooり 9 エ. ユユ. Oの 図工. ユユ. 、 図 川= 宅 qミ. Σ ユ. 江 Σ ユ. 、 × ご 剣り物. δ の 幅= 閃碕. 、﹃6の. . 国 n 卦 智 e み ヤ争 懸 濫 鰹 憩. 、 ρ× ご o奨. . 区 療蘇 紬 咳 曽 ㌍ (b (O ) 握 隆 NO,一. . 国 嶋国零 避. .同印6◎賊. 、 = 隔同筆 畠. Σ. 工. O×Ω×ど. エ 6ω oの y エ. Σ ×Σ. ユ. ユ. Σ ×Σ. 工. Oの y 工. Oω 図. ×ユ. Σ. 国. ロD. 工. 工. 工. ユ. ユ. ユ. ユ 匹色. ﹂ ユユ. α ﹂ユ. 工. 工. 工. .① 区. . (く ) 渥 瞭 oウO。 ω 駆 ー ド h 杓 ⊃ ホ ヘ レ、梱 燦 ㌍ 恥. 05の m一 σ5のOの. 虫2ユ. 低. 6uの. . (oa) 耀 隆 のO・ め. Oの 9 エ. ユユ. 6の. 05の. (O ) 握 隆 二 . め. 山 山 06の. αユ. 薗 自Ω 而の. Σ ユ Σ氏. 工. 的 m 6の. Σ に Σα α α. 工. Σ ユ Σに αユ. ﹂. ﹂. ユ. ユ. ユ. ﹂ユ ユ. 低ユ に. ∩圧. 工. Ωヱゆ. 工. 低. 工. ユ. 工. O. m. <. O. 2i.
(27) 図9に. は 、S-03系. 統 、S-05系. 素 地 図 を 示 す 。S型. 統 、S-11系. 統 お よ びL-02系. フ ァ ー ジ の う ち 、S-05とS-11系. た 場 合 に 少 数 の 切 断 片 に つ い て 、S-03系. 統 フ ァー ジ の 制 限 酵. 統DNAをHind皿. で 切 断 し. 統 とは 異 な る 切 断 パ タ ー ン が 観 察 さ. れ 、 制 限 酵 素 長 断 片 多 型(RestrictionFragmentLengthPolym・rphism, RFLP)が. 確 認 さ れ た(図10)。. 図10Bに. 示 す よ う に 、 こ れ ら3系. 間 に は 相 同 性 が 確 認 さ れ る の で 、 こ の よ う なRFLPは 置 換 変 異 に よ っ て 生 じ た も の と 考 え 、 図10Aお 様 式 を 推 定 し た 。3系. フ ァ ー ジDNAに. よ び10Bの. 統 の 関 係 を 図11AとBに. 統 のDNA断. 片. 若 干 の塩 基. 結 果 か らRFLPの. 出 現. ま とめ た 。 本 実 験 結 果 か ら 、. 起 源 と な る 系 統 を 特 定 す る こ と は で き な い の で 、S-03系. 統 を 基 本 に して 変 異. の 種 類 や 出 現 部 位 を 推 定 し た 。 ま ず 、S-03系. 統 を比 較 し た場 合 、. 前 者 のa断. 片 とe断. 片(図11A)にDNAの. れ た も の と 考 え ら れ た 。 挿 入DNAの. 挿 入 が 生 じ 、 新 し く2断. 述 のa断. 片 が 形 成 さ. 起 源 に つ い て は 明 らか で な い が 、 縦 裂 増 幅. 断 片 で あ る 可 能 性 が 高 い 。 ま た 、S-05系 の 最 長 断 片(上. 統 とS-05系. 統 とS-11系. 片 よ り 生 じ た 断 片)に. 統 の 比 較 か ら 、S-05系. 新 た なHind皿. S-11系. 統 で は そ の 部 位 で 切 断 さ れ て 、 新 た に2断. 図10に. は 、 上 記 の ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン に 加 え 、S型. 統. 部 位 が 生 じ、. 片 が 生 じた も の と 考 え た 。 フ ァ ー ジ とL型. フ ァ ー一. ジ の ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン に つ い て も 示 し て あ る 。 こ の 実 験 で は 、S-03系 統 とL-OZ系. 統 のNindlll断. (図10Bの. レ ー ン5とCの. 片 を プ ロ ー ブ と して 交 互 に ハ イ ブ リ ダ イ ズ さ せ た が レ ー ン2∼4)、S型. とL型. の フ ァ`.ジ. に は塩 基. 配 列 の 相 同 性 が 認 め ら れ ず 、 両 者 は 塩 基 配 列 に お い て も 全 く異 な る フ ァ ー ジ で あ る こ とが 示 さ れ た 。 本 研 究 に お い て 分 離 し た こ れ らの フ ァ ー ジ が 青 枯 病 菌 の 異 な る 菌 株 に 対 し て どの よ う な 感 染 性 を示 す か を調 べ る た め 、 以 下 の 菌 株 に対 す る プ ラ ー ク 形 成 の 有 無 と そ の 形 状 を 検 討 し た 。 実 験 に は 、K-101株 離 株)1°2)、U-10株(た. とK-102株(近. ば こ 産 業 宇 都 宮 試 験 場 分 離 株)1°1)お. 22. 畿 大 学 分. よ びNE-1株(奈.
(28) 粥 軸. 螺 講 綜. 執働藩. 榔_翻. 亀. 粥. 蜘騰. 馨. 響. 冒 弼. 廊. 翻. C. 帰. 母. B. 懸轍. A. 難 罐ll議. 、. 弧. 吋ω. 1. 2. 34. 5. 1234512345. 図10. 青 枯 病 菌 バ ク テ リ オ フ ァ ー ジ のHindlll切. 断DNAの. ア ガ ー ロ ー ス 電 気 泳 動(A)と. サザ ンハ イ ブ. リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン 分 析(B,C). S-03系. 統(B)お. よ びL-02系. 統(C)の. フ ァ ー ジDNAを10unitsのHind皿1で. 切 断 し 、 切 断 断 片 をHRP. 標 識 した 後 、 ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン の プ ロ ー ブ と し て 用 い た 。 レ ー ン1:λ レ ー ン4:S-11系. 伍ndm切 統,レ. 断 サ イ ズ マ ー カ ー,レ ー ン5:L-02系. 統 .. ー ン2:s-03系. 統,レ. ー ン3:s-05系. 統,. 霧.
(29) B. f. hlCle. b'g. a. i. d. 1. 2. 1. 3. 図11. S-03系. 統(1)、S-05系. AはHind皿 はS-03系 S-05系. 統(2)お. よ びS-11系. 統(3)のRFLP分. 析.. 切 断 し た フ ァ ー ジDNA断 片 の 電 気 泳 動 パ タ ー ン を示 す 。 ア ル フ ァ ベ ッ ト(a∼i) 統 のHindlll切. 断 に よ っ て 得 ら れ た 断 片 を示 す 。BはHind皿. 切 断 し たS-03系. 統、. 統 お よ びS---系 統 フ ァ ー ジ のDNA断 片 を 直 線 上 に 表 した 。. 表5.青. 枯 病 菌 に対 す るバ クテ リオ フ ァー ジの 感 染 性. バ クテ リ オ フ. トマ ト青 枯 病 菌 ァ ー ジU. -10K-101K-102NE-1. L L L. L L L. βb. Qg. QG. S. Q﹂. ∩b. ρ b. q﹂. β b. L L L. -11. S. S-03 -05. qり. -07. ■ρb. ・04. L. 一 L L. L-02. a)大 型 で 周 縁 部 の 輪 郭 が 明 瞭 な プ ラー ク形 成 を示 す 。 b)小 型 で 周 縁 輪 郭 部 が不 明 瞭 な プ ラー ク形 成 を示 す 。. 良 県 農 業 試 験. 場 分 離 株)1°2)を. 型 プ ラ ー ク 、S-03、S-05お. 用 い た が 、L-02、L-04お. よ びS-11の3系. 24. 統 は い ず れ もS型. よ びL-07系. 統 はL. プ ラー ク を形 成.
(30) し た(表5)。 プ ラ ー ク の 形 状 は細 菌 の種 類 や フ ァ ー ジ接 種 後 の培 養 条 件 に 影 響 され る こ と も あ る が35)、. 一 般 に フ ァー ジ の遺 伝 子 構 成 に よ って 決 め られ る。 本 研 究 の 結. 果 で は 、 少 な く と も上 記 供 用 菌 株 に 関 す る 限 り、 プ ラ ー ク 形 成 は 明 確 に フ ァ ー ジ 遺 伝 子 に よ っ て 制 御 さ れ て い る もの で あ っ て 、L型. お よ びS型. ファージ は. 感 染 様 式 の 異 な る 別 種 の フ ァ ー ジ で あ る と考 え た 。. 第2項. 青 枯 病 菌 へ の遺 伝 子 導 入 に よ る標 識 法 の確 立. 土 壌 中 ま た は 宿 主 植 物 体 内 の 青 枯 病 菌 の挙 動 を 追 跡 す る に 当 た って は 、 青 枯 病 菌 を何 ら か の 方 法 で 標 識 し 、 標 識 菌 を利 用 す る こ と が 有 効 で あ る と考 え ら れ る 。 そ こ で 、 本 項 で は 、2種. 類 の 遺 伝 子 導 入 法 を用 い て マ ー カ ー 遺 伝 子. を 青 枯 病 菌 に 導 入 す る こ と に し た 。 第1の 法69)と. エ レク. 方 法 と し て 、 直 接 法(CaCl2・MgCl2. ト ロ ポ ー レ ー シ ョ ン 法15'27'33,67>)に. よ る 遺 伝 子 導 入 を 試 み た 。. ま た 、 本 実 験 に は 、 導 入 遺 伝 子 と し て バ ク テ リ オ フ ァ ー ジ(S-03系 用 い た 。 す な わ ち 、 導 入 さ れ た バ ク テ リ オ フ ァ ー ジDNAが. 統)DNAを. 細 菌 内 に導 入 さ れ る. と転 写 、 翻 訳 お よ び 複 製 を 開 始 し、 子 孫 フ ァ ー ジ が 放 出 さ れ る の で 、 バ ク テ リ オ フ ァ ー ジDNAの. 導 入 効 率 を細 菌 ロ ー ン上 で プ ラ ー ク 数 を 基 準 と し て 算 出 で. き る 。 ま ず 、CaCl2・MgC12法. で は 、 塩 濃 度 、DNA濃. 効 率 を 調 べ た 結 果 、CaCIZ・MgCl2濃 を108/mlと. 度 お よび菌 数 を変 え て導 入. 度 を0.15M、DNA濃. し た 場 合 に 高 い 導 入 効 率(2.0×102pfu/ml)が. 度 を10μ9/皿1、. 細 菌 数. 得 ら れ た(図12)。. 本 法 に よ る 遺 伝 子 導 入 は 他 の 青 枯 病 菌 系 統 や 継 代 培養 中 に 出 現 す る 非 流 動 性 コ ロ ニ ー 細 菌(図13)を 69>は 直 鎖 型 のDNAの. 用 い た 場 合 に も 、 可 能 で あ っ た(表6)。Mercerら 導入 効 率 を高 め る た め に は. 、Mg2+が. か に し て い る が 、 本 実 験 に お い て 最 適 条 件 下 でL-02系. 25. 必 要 で あ る こ と を明 ら 統 のバ ク テ リ オ フ ァ ー.
(31) 輸. バ究. 鞠羅. の. ノ ギ. 塾のo導. 灘. 薄. 礁. O O◎. ○. も ◎ 轍. o轍. ⑤ ○. 灘. 群. 図13. 青 枯 病 菌 の 流 動 性(A)と. 懸灘. コロ ニ ー. 形 態. 流 動 性(FC)お. ρ. 非流 動 性(B)の. よ び 非 流 動 性(AFC)の. PCG寒 天 培 地(50μg/mlのTTCを 養 した 。. 26. 含 む)上. 青枯 病 菌 を で1週. 間培.
(32) 表6.青. 枯 病 菌 に対 す るバ クテ リオ フ ァ ー ジDNAの 遺 伝 子 導 入 効 率 プ ラ ー ク 形 成 数(×103pfu/ml). バ クテ リオ フ 、.導 アー ン. U-10株. 入法. FCAFC. T. L-02. 0,110.110.080.180.140.09 35.2012.008.9014.5011.3010.90. E. S-03 L-02. b)PCG寒. FCAFC. 0.300.140.150.120.270.08. T E. S-03. a)PCG寒. K-101株. U-166株 b)a)FCa'AFC. 30,0012.009.6t}9.0010.5016.50 天 培 地 上 で 流 動 性 コ ロ ニ ー を形 成 す る 青 枯 病 菌 を 示 す. 。 天 培 地 上 で 非 流 動性 コ ロニ ーを形 成 す る 青枯 病 菌 を示 す. CaCl2・MgCl2法(T)お リ オ フ ァ ー ジDNAを. 。. よ び エ レ ク トロ ポ ー レ ー シ ョ ン 法(E)に. よ っ てバ ク テ. 青 枯 病 菌 に 導 入 した 。 各 操 作 は 最 適 条 件 下 で 行 い 、U-10株. を. 指 示 菌 と して用 い た。. ジDNAを. 導 入 に 用 い た と こ ろ 、 い ず れ の 菌 株 に対 して も遺 伝 子 導 入 が 可 能 で あ っ. た(表6)。. しか し な が ら、 こ れ らの 方 法 で は 、 供 用 試 料 の 調 製 が 困 難 で も. あ り、 ま た 、 安 定 し た 結 果 が 得 られ な い 欠 点 を も っ て い る 。 そ こ で 、 こ れ ら の 点 を 克 服 す る た め 、 比 較 的 試 料 調 製 の 容 易 な エ レ ク ト ロ ポ ー レー シ ョ ン 法 に よる 遺 伝 子 導 入 を 試 み た。対 数増 殖 期 の青 枯 病 菌 を滅 菌水 に 懸 濁 した も の を 試 料 と し て 使 用 し た 。 そ の 結 果 、 細 菌 濃 度 を109細 12KV/c皿. 、 パ ル ス 幅1msec、DNA濃. (3.5×104pfu/ml)が. 度 が10,ug/mlと. 菌/ml、. 電 場 強 度 が. し た と き、 高 い 導 入 効 率. 得 ら る こ と が 明 ら か と な っ た(図14)。. ま た 、L-02系. 統 や 他 の 青 枯 病 菌 系 統 を 用 た 場 合 で も、 同 程 度 の 導 入 効 率 が 得 られ(表6)、 CaC12・MgCl2法. と比 べ て 約100倍. 高 い 導 入 効 率 が 得 られ た こ と か ら、 こ の 方 法. は 青 枯 病 菌 の 遺 伝 子 導 入 に極 め て 有 効 で あ る と考 え ら れ た 。 青 枯 病 菌 に 導 入 した 遺 伝 子 が 安 定 的 に保 持 され る ため に は、 導 入 遺 伝 子 が 菌 体 内 で 複 製 、 ま た は 、 染 色 体 に 導 入 さ せ な け れ ば な ら な い 。 そ こ で 、 第2の 菌 間 の 接 合 現 象111'114)を 利 用 したbiparental皿ating法 mating法. 方 法 として、細. お よ びtriparental. に つ い て 検 討 す る こ と に した 。 こ れ ら の 方 法 に 用 い る プ ラ ス ミ ド. 27.
(33) 一. iO5. C. B. A 一. 噌層. 4. 0. 一. 壬. 印. 壬. 一. 壬. 壬. 壬. 一. 噌-. 3. 壬. 0. 一 ∈ ＼⊃ ﹂ ユ. 壬. 一. ㍗. ioz. 一. 口. D. 一. 壬. モ. 81012 FIELD STRENGTH. 0.112 PULSE LENGTH. (kv/cm}. 一. 一. ._. F門. 108109101011020304050 BACTERIA. DNA. /ml. {msec). (μ9/ml). 図14. エ レ ク トロ ポ ー レ ー シ ョ ン 法 に よ るS-03DNAの A;細. 菌 液(log/m1)中. を印 加 した 。B;Aの. 青 枯 病 菌(U-10株. に 最 終 濃 度10μg/mlのDNAを. 〉 へ の 遺 伝 子 導 入 効 率.. 加 え 、 異 な る 強 度 の 電 圧 パ ル ス(1msec). 条 件 で 調 整 した 試 料 に 、 種 々 の パ ル ス 幅 の 電 圧(12kv/c皿)を. 印 加 し た 。C;. 種 々 の 濃 度 に 調 整 した 細 菌 液 にDNAを 加 え(最 終 濃 度10μ9/m1)、12kv/cmの. 電 圧 パ ル ス(1msec). を 印 加 した 。D;異. 電 圧 パ ル ス(1皿sec). な る濃 度 のDNAを 加 え た 細 菌 液(109/ml)に. を 印 加 した 。 処 理 後 の 細 菌 液 に 指 示 菌(U-10株)を. 、12kv/Cmの. 加 え て 細 菌 ロ ー ン を 作 製 し 、2日. 間培養後 の. プ ラ ー ク 数 を 測 定 した 。. (pUCD623)は (亡eの. 自 己 伝 達 に 関 与 したtra遺. お よ び 発 光 遺 伝 子(lUx)を. 伝 子 、 テ トラ サ イ ク リ ン 耐 性 遺 伝 子. 含 む ト ラ ン ス ポ ゾ ン(Tn4431)を. もつ の. で 、 接 合 伝 達 さ れ た プ ラ ス ミ ドの トラ ン ス ポ ゾ ン が 染 色 体 上 へ 転 移 し た 場 合 に は 、 受 容 体 細 菌 が テ ト ラ サ イ ク リ ン耐 性 を 獲 得 す る 。 した が っ て 、 遺 伝 子. 導 入 細 菌 を選 択 培 地 上 で 容 易 に検 出す る こ と が で き る。 供 与 体 と して 大 腸 菌 (HB・101株)、. 受 容 体 細 菌 と し て3菌. 株(U-10株. 28. 、U-166株. お よ びK-101株).
(34) を 用 い 、pUCD623を (tet+)が. 伝 達 し た と こ ろ 、 テ トラ サ イ ク リ ン 抵 抗 性 の 受 容 体 細 菌. 高 頻 度 に 分 離 さ れ 、 ま た 、 こ れ らの な か に は 、 多 数 の 発 光 能 を有 す. 接 合 体 が 含 ま れ て い た(表7、 U-10株. 図15)。. に お い て 最 も高 く、K-101株. 伝 達 効 率 は 菌 株 に よ って 異 な り、. に お い て 最 も低 か っ た が 、 そ の 機 構 に つ い. て は 明 らか で な い 。 表7.Biparentalmating法. に よ るpUCD623の. 受 容 体細 菌. へ の接 合 伝 達 効 率. 受容体細菌当た りの接合体数. 青枯病菌. tet+/lUX+b). tet+a). U-10. 8.8><10砧71.7×10'8. U-166. 1.1×1081.9×10.9. K-101. 1.3>〈10'75.2×10'10. a)テ トラサ イ ク リ ン抵 抗 性 の接 合 体 数 を表 す. 。 b)テ トラサ イ ク リ ン抵 抗 性 お よび発 光 生 産性 の接 合 体 数 を示 す. o. 購. 図15. 発 光 生 産 性 の 受 容 体 細 菌. Tn4431が. 導 入 さ れ た テ トラ サ イ ク リ ン抵 抗 性 の 受 容 体 細 菌 は. PCG培 地(10,ug/mlの. テ トラ サ イ ク リ ン を含 む)上. 培 養 さ れ た 後 、X線. フ ィ ル ム で 露 光 処 理 さ れ た(6時. 29. で3日 間)。. 間. 。.
(35) つ ぎ に 、 本 実 験 で 得 られ た テ トラサ イ ク リ ン抵 抗 性 の 受 容 体 細 菌 に つ い て 、 luxオ ペ ロ ン を プ ロ ー ブ と し て コ ロ ニ ー ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン分 析 し た と こ ろ 、 全 て の 受 容 体 細 菌 が 陽 性 反 応 を示 し た(図16)。. し た が っ て 、 トラ ン ス. ポ ゾ ン 挿 入 受 容 体 細 菌 は テ トラ サ イ ク リ ン抵 抗 性 に よ っ て確 実 に 選 抜 で き る こ とが 明 らか と な っ た 。 さ ら に 、 トラ ン ス ポ ゾ ンが こ れ ら の 細 菌 の 染 色 体DNA. 、. ◎. ○. ●. ○. ○. 慶. ●. 導. 徽禦. 、. 9. ♂ σ. 、. 轍 ◎. 亀. ● ●. ●. ●. 図16.. テ トラ サ イ ク リ ン 抵 抗 性 受 容 体 細 菌 の コ ロ ニ ー ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン 分 析. Ba囲1処. 理 でpUCD623か. ら 切 り出 したluxオ ペ ロ ン(7.5kb)をHRP標. 識 した後 、ハ. イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン の プ ロ ー ブ と して 使 用 した 。. 中 に 挿 入 さ れ て い る か 否 か をluxオ. ペ ロ ン遺 伝 子 を プ ロ ー ブ と して サ ザ ン ハ イ. ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン 分 析 を 行 っ た 。 そ の 結 果 、1コ. ピ ー の トラ ン ス ポ ゾ ン が. 挿 入 さ れ て い る こ と が 明 ら か と な っ た(図17)。 以 上 の よ う に 、biparentalmating法. に よ って青 枯 病 菌 の 染 色体 に 遺伝 子. を 導 入 す る こ とが 可 能 と な っ た の で 、 つ ぎ に 、 グ ラ ム 陽 性 細 菌 で 複 製 で き る プ ラ ス ミ ド の 導 入 を 試 み る こ と に し た 。 実 験 に 用 い た プ ラ ス ミ ド(pEND4K) は カ ナ マ イ シ ン 抵 抗 性 遺 伝 子(11「)を. もつ の で 、 接 合 伝 達 さ れ た プ ラ ス ミ ド. 30.
(36) 犠● 罵. 7.5kb. 働20kb. 雛. 1. 2. 45. 3. 図17. Biparentalmating法. で テ トラ サ イ ク リ ン抵 抗 性 を 獲 得 した 青 枯 病 菌 の サ ザ ン. ハ イ ブ リダ イゼ ー シ ョ ン分 析 . βa囲1の 切 断 でpUCD623か. ら 切 り出 した1uxオ ペ ロ ン(レ. ー ン1)を. 、HRP標 識 し. た 後 、 ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン の プ ロ ー ブ と し て 使 用 した 。 テ トラ サ イ ク リ ン 抵 抗 性 細 菌(レ. ー ン3,5)な. 染色 体DNAを11(レ. ら び に 感 受 性 細 菌(レ. ー ン2,3)お. よ びPstI(レ. ー ン2,4)か. ー ン4,5)で. ら抽 出 し た 切 断 した の ち 、. ア ガ ー ロ ー ス ゲ ル を 用 い 電 気 泳 動 で 分 離 した 。. が受 容 体 細 菌 で 安 定 的 に 複 製 した場 合 に は 、 受容 体 細 菌 が カナ マ イ シ ン抵 抗 性 を獲 得 す る こ とに な る の で 、 遺 伝 子 導 入 細 菌 を 選択 培 地 上 で 検 出 で き る 。 し か し な が ら 、 導 入 す るpEND4Kに な い ・ そ こ で ・pUCD623を. は 、 自 己 伝 達 に 関 与 し たtra遺. 介 し て 伝 達 さ せ る こ と に し た 。 す な わ ち 、pUCD623. 表8.Triparentalmating法. に よ るpEND4Kの. 接 合伝 達 効率. 接 合 体数a 青枯病菌. 伝子 が 存 在 し. ヵナマィ シン. テ ト ラサ イ ク リ ン. カ ナ マ イ十 シ ン ー 几'. 抵抗性. 抵抗性. テ トラサ イ ク リ ン抵 抗 性. U-101. .2×10-'. 5.3×10'81.4×10'lo. U-1663. .2x10'. 5.3×1093.5×10-10. K-1011. .5×10'. 7.0×10'85.7×10'10. a)Triparentalmating法. に よ っ て 得 られ た 薬 剤 抵 抗 性 の. 細 菌 数 を 受 容 体 細 菌 当 た り の 割 合 で 表 した 。. 31.
(37) を もつHB-101株 K-101株. とpEND4Kを. も つHB-101株. のtriparental皿atingを. 存 在 下 で 、U・10株 、U-166株. お よび. 試 み た 。 そ の結 果 、 カナ マ イ シ ン抵 抗 性 の. 受 容 体 細 菌 が 多 数 分 離 さ れ た(表8)。. カ ナ マ イ シ ン抵 抗 性 を 示 す 青 枯 病 菌. に お い て プ ラ ス ミ ドが 安 定 的 に 複 製 して い る か 否 か を、EcoRI切. 断 し たpEND4K. を プ ロ ー ブ と して サ ザ ンハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン 分 析 に よ っ て 確 認 した(図 18)。. ま た 、 本 実 験 に お い て は 、 ヘ ル パ ー プ ラ ス ミ ドと してpUCD623を. 使用 し. て い る の で 、 受 容 体 細 菌 の 中 に テ トラ サ イ ク リ ン 抵 抗 性 お よ び テ トラ サ イ ク リ ン と カ ナ マ イ シ ン の2種. の 抵 抗 性 を 獲 得 し た細 菌 が 分 離 さ れ た 可 能 性 も あ. り、 事 実 そ の よ う な 受 容 菌 が 分 離 さ れ た(表8)。. 穏. 11.7kb. 2.5kb箋. 1.8kb. 123 図18. Triparentalmating法. で カ ナ マ イ シ ン 抵 抗 性 を 獲 得 した 青 枯 病 菌 の サ ザ ン ハ イ ブ リ. ダ イ ゼ ー シ ョン分 析 EcoRI切. 断 し たpEM)4K(レ. ー ン1)をHRP標. 識 した後 、 ハ イ ブ リダ イ ゼ ー シ ョ ンの プ. ロ ー ブ と して 使 用 した 。 テ トラ サ イ ク リ ン に 対 し て 感 受 性 の 細 菌(レ び 抵 抗 性 の 細 菌(レ. ー ン3)か. ー ン2)お. ら 同 じ操 作 で 抽 出 した プ ラ ス ミ ドDNAをEcoRIで. し、 ア ガ ー ロ ー ス ゲ ル で 電 気 泳 動 で 分 離 した 。. 32. よ 切 断.
(38) 本 実験 にお い て 、 マ ー カ ー遺 伝 子 が導 入 され た青 枯 病 菌 につ い て は、 テ ト ラ サ イ ク リ ン な ら び に カ ナ マ イ シ ン抵 抗 性 の 消 失 は観 察 さ れ な か っ た 。 こ の こ と は 導 入 遺 伝 子 が 脱 落 ま た は 欠 失 す る こ と な く後 代 に 安 定 的 に 受 け 継 が れ て い る こ と を示 唆 す る 。 した が っ て 、 こ れ ら 遺 伝 子 標 識 青 枯 病 菌 の 遺 伝 子 発 現 を利 用 して 植 物 体 に お け る病 原 菌 の 挙 動 の 追 跡 が で き る と考 え た 。. 第3項. 青 枯 病 菌 で 機 能 す る 宿 主 プ ロ モ ー タ ー の 分 離 とベ ク タ ー 系 の 開 発. 青 枯 病 菌 の 病 原 性 そ の他 の遺 伝 子 形 質解析 に当 た っ て は、 該 菌 で 効 果 的 に 発 現 す る 宿 主 ベ ク ター 系 の 開発 が 必 要 とな る 。 そ こで 、 本 項 で は そ の 第 一 段 階 と して 青枯 病 菌 内 で 作 動 す る プ ロ モ ー ター の 分 離 とそ の解 析 を試 み る こ と に した 。 ま ず 、pUCD623が. 導 入 さ れ た 青 枯 病 菌(U-10株)の. 発 光 生 産 性 をX線. フ ィ ル ム 法31)で 調 査 し た と こ ろ 、 発 光 生 産 性 の 高 いU-10/1ux3が. 得 られ た. (図19)。. o 1. 2. 3. 4. 図19. Tn4431が. 導 入 さ れ た 青 枯 病 菌 の 発 光 生 産.. 遺 伝 子 標 識 し た 青 枯 病 菌 を 、 テ トラ サ イ ク リ ン(10μ9/ml)を に 植 菌 し た 後 、X線. フ ィ ル ム で6時. 含 む 選 択培 地 上. 間 露 光 して そ の 発 光 能 を 調 べ た 。. こ の 細 菌 の 場 合 、 プ ロ モ ー タ ー レ ス のluxオ. ペ ロ ン が 宿 主 染 色 体 プ ロ モ.___タ ー. 下 流 近 傍 ≡に 挿 入 さ れ た と 考 え ら れ る の で 、 そ の ゲ ノ ミ ッ ク ラ イ ブ ラ リ ー か ら. 33.
(39) プ ロ モ.___タ ー の 分 離 を 試 み た 。 す な わ ち 、luxC遺 して ゲ ノ ミ ッ ク ラ イ ブ ラ リ ー か ロ._._ン が 得. 伝 子 領 域5'89)を. プ ロ ー ブ と. らス ク リ ー ニ ン グ した と こ ろ 、 数 個 の 陽 性 ク. ら れ た(図20)。. 一 ◎○. ●/ o 購. ∂o. ◎. rr......___....r. 図20. 青 枯 病 菌 ゲ ノ ミ ック ラ イ ブ ラ リー か らプロ モ ー ター領 域 挿 入 クロ ー ン の ス ク リ ー ニ ン グ. pUCD623か. ら 分 離 し た1uxC遺 伝 子 を 、HRP標. 識 した 後 、 プ ラ ー ク ハ. イ ブ リダ イゼ ー シ ョン分析 の プ ロー ブ と して使 用 した。 矢 印 の ク ロ ー ン を λTc-2と. して 選 抜 した 。. 最 終 的 に 選 抜 し た 陽 性 ク ロ ー ン(λTc-2)の. 挿 入 断 片 は 、 制 限 酵 素SphIに. よっ. て6kbと9kbの2断. 片 に細 分 化 さ れ る こ とが 明 らか と な っ た の で 、 得 ら れ た. 6kbのSa11/Sphl断. 片 を さ ら にBamHI切. luxCプ luxC遺. ロ,___ブ と ハ イ ブ リ ダ イ ズ さ せ た 。 そ の 結 果 、 βamHI/Sall断 伝 子 プ ロ ー ブ に 陽 性 反 応 を 示 し た 。 ま た 、Shawら89)が. よ う に 、Tn4431の5'末 1uxC遺. 断 に よ っ て 細 分 化 し(図21-A). 端 に 位 置 す るIR(invertedrepeat)シ. 伝 子 と の 間 に は1.11サ. イ ト が 存 在 す る か ら 、luxC遺. 34. 、. 片 の み が 指 摘 して い る ー ク エ ンス と 伝 子 プ ロー ブ.
(40) 、 房. ご 鳴昌. 、 日の ξ 。,偽. ㎡. ご 嚇超. . 亀 い罎 8 国. 鴫、 臼. . H寡 朴 智 e み ヤ争 骸 髄 鰹 富. -一 姿 。= = Φρ目 ニ ヨ 昌 尋 ゆ 慮 レ 駆. 。喫 で 儒 ) ﹂ 製 憲 ㌣ 花 遡 衆 采 抽 梱 嘱 ヨ 鉛. 、 国 ご =踏 ミ 、 = 霞薫. ①8 ﹂①= = ①ρ目 ︻盈 ぢ 自・寸 .⊃ 麺 駆 虚 。℃石 e 5。三 b。-ρ霞. .U心 燈 毒 鰹& ・ 魍 e 姻 緊 楚 蛆廻 の8 。翼 ⊃ 旺 撃 Ψ ﹂ 司 ムへー ロ ゐ 八 口 e ー へ pトの8 b 弓 嶋 ー ひ ト ー 然. e ( 皇 息 網. 1申 ロ゜ 卜 裏 釦 裏 即 姻 (﹂ ) トト舌 喫 ﹂ 潔 遡 卵 士短 = ど こ 薫 笛刃 (国 ) 昏 く宕 。喫 ﹂ 潔 蝦 以 塚 レ (量 当 申 遜 姻 の8 e 卜芝 巴 姻 δ ) よ 漿 宕 身 ＼コ ￡ b 邦 嶋 (O ) 士 漿 = の山﹀ 看 ￡ . (q自 ) 士 蹟 三 8 ＼コ宅 認. の. 卜↑くoユ. .稗 e 翼 ﹂ 蟄 昼 汐 徽 髄 鰹 奮 e 騨 癒 梱 (< ) 虻 距 く言 章 剖 珠 喫 ﹂ 冠 ヤ 転 ひ ト ヤ く 刃ト ー ロ ト 鴇 ミ . 埠 睦 e薯 照 餓 ー 申 ロ ト ゆ 弓 U 鴎 猷 庫 雌 噸 の ⊃ σ 刃 黙 A 11 ー ロ "e ー 燃 ー 申 ロト & 梱 嶽 e 掴 燦 想 枢 。FN区. り r寸. O. OOoっd. O oっ N. O. O F◎り. NN. 工. 9. 35.
(41) に 陰 性 反 応 を 示 し たi-rr/Sphl断. 片(1.1kb)内. に は 、IRシ. ー ク エ ン ス と ゲ. ノ ミ ッ ク プ ロ モ,___タ ー が 存 在 す る と 推 定 さ れ た 。 実 際 、 あ ら か じ め 構 築 し た プ ロ モ ー タ ー 検 索 用 ベ ク タ ーpGAT7(図22)の に111/Sphl断. 片 を 挿 入 し た プ ラ ス ミ ド をtriparentalmating法. 菌 に 伝 達 し た と こ ろ 、 高 いGUS活 細 分 化 し た1.ff/Pstl断 た(図21-C、. レ ポ ー タ ー 遺 伝 子(GUS)上. 性 が 認 め ら れ た(図21-B、. 片(0.44kb)に. で 青 枯 病 図23)。. つ い て も 、 高 いGUS活. 図23)。. 36. 流. さ らに 、. 性 が 認 め ら れ.
(42) ㌔璽. 麟. 鰍'曲. ノ辱. 冨 蝋. 糞. 聾 ∬響. 謬. 嚢. 巽 縫建. 響. 欝. 蟻. 鯵. 図23. GUS遺. 伝 子 発 現 に よ る プ ロ モ ー タ ー 活 性 の 評 価.. Ba皿HI/Sphl断. 片(C)お. よ びBamHI/PstI断. 片(D)をpGAT7のGUS遺. ラ ス ミ ド は 、 青 枯 病 菌 へ 導 入 さ れ た 。 ま た 、 大 腸 菌(A)お れ たpGAT7は. 伝 子 上流 連 結 され た プ よ び 青 枯 病 菌(B)に. 、 コ ン ト ロ ー ル と し て 用 い ら れ た 。 プ ロ モ ー タ ー 活 性 は 、GUS遺. 導 入 さ. 伝 子 の 発 現 を. も と に し 、 細 菌 の 菌 体 破 砕 液 に5-bromo・4-chloro-3-indolyl-91ucuronide(X-91uc)を し 、24時. 間後 の呈 色 に よっ て観 察 さ れ た。. し か し な が ら 、Pstl/Sphl断 性 はGUSフ. 混 合. 片(図21-D)な. リ ー ベ ク タ ー(図21-F)と. ら び にpGAT7(図21-E)のGUS活. 同様 に極 め て 低 か っ た 。 こ れ らの 実 験 か. ら 、 プ ロ モ ー タ ー シ ー ク エ ン ス は111/Pstl断. 片(BP断. 片)中. に存在 す る こ. とが 明 ら か と な っ た の で 、 こ の 断 片 の 塩 基 配 列 を ジ デ オ キ シ 法 に よ っ て 決 定 し た(図24)。 3'末. そ の 結 果 、 ト ラ ン ス ポ ゾ ン のIRシ. ー ク エ ン ス26'94)がBP断. 片 の. 端 に 検 出 さ れ た こ とか ら 、 ト ラ ン ス ポ ゾ ン は 導 入 菌 染 色 体 上 の プ ロ モ ー. タ ー 下 流 に 連 結 さ れ て い る こ と が 実 証 さ れ た 。 本 結 果 か ら は 、BP断 ポ リ メ ラ ー ゼ 結 合 部 位 は 明 ら か で な い が 、BP断. 片 中 のRNA. 片 に連 結 した 遺 伝 子 が 転 写 さ. れ て い る こ とか ら 、 こ の 分 離 断 片 は 青 枯 病 菌 の 発 現 ベ ク タ ー と して 利 用 で き る と 考 え 、 各 種 の ベ ク タ ー を 構 築 し た 。 最 終 的 に 、pUC19か ン カ ー(5'-BamHI-Smal-Kpnl-Sacl-EcoRI-3')をBP断 ト に 連 結 し て 、i.11、Saclお 病 菌 の 発 現 ベ ク タ ー(pAT7PP)を. ら分 離 し た ポ リ リ 片 のBamlllサ. よ びKpnlな. イ. ど の 単 一 サ イ トを 利 用 で き る 青 枯. 構 築 す る こ とに成 功 し た。 さ ら に、 今 回 分. 離 し た プ ロ モ ー タ ー の 大 腸 菌 に お け る 機 能 を 確 か め る た め 、pAT7PPを. 37. 大 腸 菌.
(43) ユ む. . . む. む. ロ. . . ユ む. ユ らむ. ユ む. . む. . . ヨ . ヨ リ ヨ ヨ TGGGTGGTTGATTTCTGCCTGCGCTACGGGTCATGACATTACGTCAGAGG. ムむ. ヨ ら む. ヨ ヨ CAGCAGCGGGCGGCTTGACTCACATCAGGGGGAACCGCAGAATTCGGAAA. む. . む AAATCGTACGCTAACCTAACGGTGTTCTCGTGCGGGATCC. むEcoRI. CTGCAGCAGGATGCCGGCCCCTTCGTCGCGCAGCGGTTTCAGGATGTGCG PstI. . ア む. GATTCGCGTTGGGAAAGAACGGAACAAAGATCGACACGCGGCCATCGAGG ユユ む. ユの. ユ . CCCGCCGTGGAGATCGCCGATTTCACTCGCCGGATGTTCCTGACCAGTTG . ユ フむ. ユ . TCTTCGCTGTAAATGAAGACCGGCGTGCCGGTCTGCGAGCAGATGCTCGG ユ . む. . CAAATCCGCCCGGGCGATCCAGTGTTCCGCCAGGCGAGGTTGATCGTGAA SmaI む む GTCCGGCAGGGACCGTGATGGGCGTGTGCGACGGCATGGTGATGCTCCTT. る BamHI. 図24. プ ロ モ ー タ ー 活 性 を 示 すBamHl/Sphl断. 片 の 塩 基 配 列.. 制 限 酵 素 サ イ ト を 直 線 で 、 ま たTn4431のIRシ. に導 入 す る こ と に した 。 しか し、GUS遺 もの で あ る か ら53)、BP断. ー ク エ ン ス を 点 線 で 示 した 。. 伝 子 は も と も と大 腸 菌 か ら分 離 さ れ た. 片 に 連 結 す る マ ー カ ー 遺 伝 子(GUS)をluxオ. に 置 き換 え る 必 要 が あ る 。 しか し、pAT7PPの. ・lfサ. ペ ロ ン は 大 腸 菌 で 発 現 し な か っ た 。 あ ら か じめlacプ 連 結 し たluxオ. ペ ロ ン. イ ト内 に 導 入 し たluxオ ロ モ ー タ ー の22・63)下流 に. ペ ロ ン は大 腸 菌 で発 現 す る こ とが確 認 され て い るの で 、 今 回 分. 離 し た プ ロ モ ー タ ー は 少 な く と も大 腸 菌 を含 む グ ラ ム 陰 性 細 菌 に は 利 用 で き ない が 、 青 枯 病 菌 で は 機 能 的 に 作 動 す る こ と が示 唆 さ れ た 。 す な わ ち 、 本 実 験 で 構 築 し たpAT7PPは. 青 枯 病 菌 の発 現 ベ ク タ ー と して極 め て有 効 に利 用 で き. る こ とが示 唆 され た 。. 38.
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