81012 FIELD STRENGTH (kv/cm}
0.112 PULSE LENGTH {msec)
108109101011020304050 BACTERIA
/ml
DNA (μ9/ml) 図14.
エ レ ク トロ ポ ー レ ー シ ョ ン 法 に よ るS‑03DNAの 青 枯 病 菌(U‑10株 〉 へ の 遺 伝 子 導 入 効 率.
A;細 菌 液(log/m1)中 に 最 終 濃 度10μg/mlのDNAを 加 え 、 異 な る 強 度 の 電 圧 パ ル ス(1msec) を印 加 した 。B;Aの 条 件 で 調 整 した 試 料 に 、 種 々 の パ ル ス 幅 の 電 圧(12kv/c皿)を 印 加 し た 。C;
種 々 の 濃 度 に 調 整 した 細 菌 液 にDNAを 加 え(最 終 濃 度10μ9/m1)、12kv/cmの 電 圧 パ ル ス(1msec) を 印 加 した 。D;異 な る濃 度 のDNAを 加 え た 細 菌 液(109/ml)に 、12kv/Cmの 電 圧 パ ル ス(1皿sec) を 印 加 した 。 処 理 後 の 細 菌 液 に 指 示 菌(U‑10株)を 加 え て 細 菌 ロ ー ン を 作 製 し 、2日 間 培 養 後 の プ ラ ー ク 数 を 測 定 した 。
(pUCD623)は 自 己 伝 達 に 関 与 したtra遺 伝 子 、 テ トラ サ イ ク リ ン 耐 性 遺 伝 子 (亡eの お よ び 発 光 遺 伝 子(lUx)を 含 む ト ラ ン ス ポ ゾ ン(Tn4431)を も つ の で 、 接 合 伝 達 さ れ た プ ラ ス ミ ドの トラ ン ス ポ ゾ ン が 染 色 体 上 へ 転 移 し た 場 合 に は 、 受 容 体 細 菌 が テ ト ラ サ イ ク リ ン耐 性 を 獲 得 す る 。 した が っ て 、 遺 伝 子 導 入 細 菌 を選 択 培 地 上 で 容 易 に検 出す る こ と が で き る。 供 与 体 と して 大 腸 菌
(HB・101株)、 受 容 体 細 菌 と し て3菌 株(U‑10株 、U‑166株 お よ びK‑101株)
を 用 い 、pUCD623を 伝 達 し た と こ ろ 、 テ トラ サ イ ク リ ン 抵 抗 性 の 受 容 体 細 菌 (tet+)が 高 頻 度 に 分 離 さ れ 、 ま た 、 こ れ らの な か に は 、 多 数 の 発 光 能 を有 す 接 合 体 が 含 ま れ て い た(表7、 図15)。 伝 達 効 率 は 菌 株 に よ っ て 異 な り 、 U‑10株 に お い て 最 も高 く、K‑101株 に お い て 最 も低 か っ た が 、 そ の 機 構 に つ い
て は 明 らか で な い 。
表7.Biparentalmating法 に よ るpUCD623の 受 容 体 細 菌 へ の 接 合 伝 達 効 率
青枯病菌 受容体細菌当た りの接合体数
tet+a) tet+/lUX+b)
U‑10 U‑166 K‑101
8.8><10砧71.7×10'8 1.1×1081.9×10.9 1.3>〈10'75.2×10'10
a)テ トラサ イ ク リ ン抵 抗 性 の接 合 体 数 を表 す
。
b)テ トラサ イ ク リ ン抵 抗 性 お よび発 光 生 産性 の接 合 体 数 を示 す
。
o
購
図15.
発 光 生 産 性 の 受 容 体 細 菌.
Tn4431が 導 入 さ れ た テ トラ サ イ ク リ ン抵 抗 性 の 受 容 体 細 菌 は PCG培 地(10,ug/mlの テ トラ サ イ ク リ ン を含 む)上 で3日 間 培 養 さ れ た 後 、X線 フ ィ ル ム で 露 光 処 理 さ れ た(6時 間)。
29
つ ぎ に 、 本 実 験 で 得 られ た テ トラサ イ ク リ ン抵 抗 性 の 受 容 体 細 菌 に つ い て 、 luxオ ペ ロ ン を プ ロ ー ブ と し て コ ロ ニ ー ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン分 析 し た と こ ろ 、 全 て の 受 容 体 細 菌 が 陽 性 反 応 を示 し た(図16)。 し た が っ て 、 トラ ン ス ポ ゾ ン 挿 入 受 容 体 細 菌 は テ トラ サ イ ク リ ン抵 抗 性 に よ っ て確 実 に 選 抜 で き る こ とが 明 らか と な っ た 。 さ ら に 、 トラ ン ス ポ ゾ ンが こ れ ら の 細 菌 の 染 色 体DNA
導
図16.
9
◎
●
、
♂ σ ○
○ ○ 慶 ●
︑
●徽禦
、 亀
● ●
轍 ◎
●
テ トラ サ イ ク リ ン 抵 抗 性 受 容 体 細 菌 の コ ロ ニ ー ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン 分 析.
Ba囲1処 理 でpUCD623か ら 切 り出 したluxオ ペ ロ ン(7.5kb)をHRP標 識 し た 後 、 ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン の プ ロ ー ブ と して 使 用 した 。
中 に 挿 入 さ れ て い る か 否 か をluxオ ペ ロ ン 遺 伝 子 を プ ロ ー ブ と し て サ ザ ン ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン 分 析 を 行 っ た 。 そ の 結 果 、1コ ピ ー の ト ラ ン ス ポ ゾ ン が 挿 入 さ れ て い る こ と が 明 ら か と な っ た(図17)。
以 上 の よ う に 、biparentalmating法 に よ っ て 青 枯 病 菌 の 染 色 体 に 遺 伝 子 を 導 入 す る こ と が 可 能 と な っ た の で 、 つ ぎ に 、 グ ラ ム 陽 性 細 菌 で 複 製 で き る プ ラ ス ミ ド の 導 入 を 試 み る こ と に し た 。 実 験 に 用 い た プ ラ ス ミ ド(pEND4K) は カ ナ マ イ シ ン 抵 抗 性 遺 伝 子(11「)を も つ の で 、 接 合 伝 達 さ れ た プ ラ ス ミ ド
7.5kb
犠 ● 罵 雛
働20kb
1
2 3 45
図17.
Biparentalmating法 で テ トラ サ イ ク リ ン抵 抗 性 を 獲 得 した 青 枯 病 菌 の サ ザ ン ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン 分 析 .
βa囲1の 切 断 でpUCD623か ら 切 り出 した1uxオ ペ ロ ン(レ ー ン1)を 、HRP標 識 し た 後 、 ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン の プ ロ ー ブ と し て 使 用 した 。 テ トラ サ イ ク リ ン 抵 抗 性 細 菌(レ ー ン3,5)な ら び に 感 受 性 細 菌(レ ー ン2,4)か ら抽 出 し た 染色 体DNAを11(レ ー ン2,3)お よ びPstI(レ ー ン4,5)で 切 断 した の ち 、 ア ガ ー ロ ー ス ゲ ル を 用 い 電 気 泳 動 で 分 離 した 。
が受 容 体 細 菌 で 安 定 的 に 複 製 した場 合 に は 、 受容 体 細 菌 が カナ マ イ シ ン抵 抗 性 を 獲 得 す る こ と に な る の で 、 遺 伝 子 導 入 細 菌 を 選 択 培 地 上 で 検 出 で き る 。 し か し な が ら 、 導 入 す るpEND4Kに は 、 自 己 伝 達 に 関 与 し たtra遺 伝 子 が 存 在 し な い ・ そ こ で ・pUCD623を 介 し て 伝 達 さ せ る こ と に し た 。 す な わ ち 、pUCD623
表8.Triparentalmating法 に よ るpEND4Kの 接 合 伝 達 効 率
接 合 体数a 青 枯 病 菌 ヵナマィ シン
抵抗性
テ ト ラサ イ ク リ ン カ ナ マ イ シ ン ー 几'十 抵 抗 性 テ ト ラ サ イ ク リ ン 抵 抗 性
U‑101 .2×10‑'
U‑1663 .2x10'
K‑1011 .5×10'
5.3×10'81.4×10'lo 5.3×1093.5×10‑10 7.0×10'85.7×10'10
a)Triparentalmating法 に よ っ て 得 られ た 薬 剤 抵 抗 性 の 細 菌 数 を 受 容 体 細 菌 当 た り の 割 合 で 表 した 。
31
を もつHB‑101株 とpEND4Kを も つHB‑101株 存 在 下 で 、U・10株 、U‑166株 お よ び K‑101株 のtriparental皿atingを 試 み た 。 そ の 結 果 、 カ ナ マ イ シ ン 抵 抗 性 の 受 容 体 細 菌 が 多 数 分 離 さ れ た(表8)。 カ ナ マ イ シ ン抵 抗 性 を 示 す 青 枯 病 菌
に お い て プ ラ ス ミ ドが 安 定 的 に 複 製 して い る か 否 か を、EcoRI切 断 し たpEND4K を プ ロ ー ブ と して サ ザ ンハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン 分 析 に よ っ て 確 認 した(図 18)。 ま た 、 本 実 験 に お い て は 、 ヘ ル パ ー プ ラ ス ミ ドと してpUCD623を 使 用 し て い る の で 、 受 容 体 細 菌 の 中 に テ トラ サ イ ク リ ン 抵 抗 性 お よ び テ トラ サ イ ク リ ン と カ ナ マ イ シ ン の2種 の 抵 抗 性 を 獲 得 し た細 菌 が 分 離 さ れ た 可 能 性 も あ り、 事 実 そ の よ う な 受 容 菌 が 分 離 さ れ た(表8)。
11.7kb
2.5kb箋
1.8kb
穏
123
図18.
Triparentalmating法 で カ ナ マ イ シ ン 抵 抗 性 を 獲 得 した 青 枯 病 菌 の サ ザ ン ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン 分 析
EcoRI切 断 し たpEM)4K(レ ー ン1)をHRP標 識 し た 後 、 ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン の プ ロ ー ブ と して 使 用 した 。 テ トラ サ イ ク リ ン に 対 し て 感 受 性 の 細 菌(レ ー ン2)お よ び 抵 抗 性 の 細 菌(レ ー ン3)か ら 同 じ操 作 で 抽 出 した プ ラ ス ミ ドDNAをEcoRIで 切 断 し、 ア ガ ー ロ ー ス ゲ ル で 電 気 泳 動 で 分 離 した 。
本 実 験 に お い て 、 マ ー カ ー 遺 伝 子 が 導 入 さ れ た 青 枯 病 菌 に つ い て は 、 テ ト ラ サ イ ク リ ン な ら び に カ ナ マ イ シ ン抵 抗 性 の 消 失 は観 察 さ れ な か っ た 。 こ の こ と は 導 入 遺 伝 子 が 脱 落 ま た は 欠 失 す る こ と な く後 代 に 安 定 的 に 受 け 継 が れ て い る こ と を示 唆 す る 。 した が っ て 、 こ れ ら 遺 伝 子 標 識 青 枯 病 菌 の 遺 伝 子 発 現 を利 用 して 植 物 体 に お け る病 原 菌 の 挙 動 の 追 跡 が で き る と考 え た 。
第3項 青 枯 病 菌 で 機 能 す る 宿 主 プ ロ モ ー タ ー の 分 離 とベ ク タ ー 系 の 開 発
青 枯 病 菌 の 病 原 性 そ の 他 の 遺 伝 子 形 質 解 析 に 当 た っ て は 、 該 菌 で 効 果 的 に 発 現 す る 宿 主 ベ ク タ ー 系 の 開 発 が 必 要 と な る 。 そ こ で 、 本 項 で は そ の 第 一 段 階 と し て 青 枯 病 菌 内 で 作 動 す る プ ロ モ ー タ ー の 分 離 と そ の 解 析 を 試 み る こ と に した 。 ま ず 、pUCD623が 導 入 さ れ た 青 枯 病 菌(U‑10株)の 発 光 生 産 性 をX線 フ ィ ル ム 法31)で 調 査 し た と こ ろ 、 発 光 生 産 性 の 高 いU‑10/1ux3が 得 ら れ た
(図19)。
o
1 2 3 4
図19.
Tn4431が 導 入 さ れ た 青 枯 病 菌 の 発 光 生 産.
遺 伝 子 標 識 し た 青 枯 病 菌 を 、 テ トラ サ イ ク リ ン(10μ9/ml)を 含 む 選 択 培 地 上 に 植 菌 し た 後 、X線 フ ィ ル ム で6時 間 露 光 して そ の 発 光 能 を 調 べ た 。
こ の 細 菌 の 場 合 、 プ ロ モ ー タ ー レ ス のluxオ ペ ロ ン が 宿 主 染 色 体 プ ロ モ.̲̲̲タ ー 下 流 近 傍 ≡に 挿 入 さ れ た と 考 え ら れ る の で 、 そ の ゲ ノ ミ ッ ク ラ イ ブ ラ リ ー か ら
33
プ ロ モ.̲̲̲タ ー の 分 離 を 試 み た 。 す な わ ち 、luxC遺 伝 子 領 域5'89)を プ ロ ー ブ と し て ゲ ノ ミ ッ ク ラ イ ブ ラ リ ー か ら ス ク リ ー ニ ン グ し た と こ ろ 、 数 個 の 陽 性 ク ロ.̲.̲ン が 得 ら れ た(図20)。
一
∂o
◎ ○
●/
o
◎
購
rr...̲̲̲....r
図20.
青 枯 病 菌 ゲ ノ ミ ッ ク ラ イ ブ ラ リ ー か ら プ ロ モ ー タ ー 領 域 挿 入 ク ロ ー ン の ス ク リ ー ニ ン グ.
pUCD623か ら 分 離 し た1uxC遺 伝 子 を 、HRP標 識 した 後 、 プ ラ ー ク ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン 分 析 の プ ロ ー ブ と し て 使 用 し た 。 矢 印 の ク ロ ー ン を λTc‑2と して 選 抜 した 。
最 終 的 に 選 抜 し た 陽 性 ク ロ ー ン(λTc‑2)の 挿 入 断 片 は 、 制 限 酵 素SphIに よ っ て6kbと9kbの2断 片 に 細 分 化 さ れ る こ と が 明 ら か と な っ た の で 、 得 ら れ た 6kbのSa11/Sphl断 片 を さ ら にBamHI切 断 に よ っ て 細 分 化 し(図21‑A) 、 luxCプ ロ,̲̲̲ブ と ハ イ ブ リ ダ イ ズ さ せ た 。 そ の 結 果 、 βamHI/Sall断 片 の み が luxC遺 伝 子 プ ロ ー ブ に 陽 性 反 応 を 示 し た 。 ま た 、Shawら89)が 指 摘 し て い る よ う に 、Tn4431の5'末 端 に 位 置 す るIR(invertedrepeat)シ ー ク エ ン ス と 1uxC遺 伝 子 と の 間 に は1.11サ イ ト が 存 在 す る か ら 、luxC遺 伝 子 プ ロ ー ブ
.H寡
︑房ご鳴昌︑日のξ︒,偽㎡ご嚇超.亀い罎8国︑国ご=踏ミ︑=霞薫鴫︑臼朴智eみヤ争骸髄鰹富
︒喫で儒)﹂製憲㌣花遡衆采抽梱嘱ヨ鉛
e(皇息①8﹂①==①ρ目︻盈ぢ自・寸.⊃麺駆虚︒℃石e5︒三b︒‑ρ霞‑一姿︒==Φρ目ニヨ昌尋ゆ慮レ駆
網.U心燈毒鰹&・魍e姻緊楚蛆廻の8︒翼⊃旺撃Ψ﹂司ムへーロゐ八口eーへpトの8b弓嶋ーひトー然
1申ロ゜卜裏釦裏即姻(﹂)トト舌喫﹂潔遡卵士短=どこ薫笛刃(国)昏く宕︒喫﹂潔蝦以塚レ(量当
申遜姻の8e卜芝巴姻δ)よ漿宕身＼コ￡b邦嶋(O)士漿=の山﹀看￡.(q自)士蹟三8＼コ宅認
.稗e翼﹂蟄昼汐徽髄鰹奮e騨癒梱(<)虻距く言章剖珠喫﹂冠ヤ転ひトヤく刃トーロト鴇ミ.埠睦e薯照‑餓ー申ロトゆ弓U鴎猷庫雌噸の⊃σ刃黙A11ーロ"eー燃ー申ロト&梱嶽e掴燦想枢︒FN区
9
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35
工の
に 陰 性 反 応 を 示 し たi‑rr/Sphl断 片(1.1kb)内 に は 、IRシ ー ク エ ン ス と ゲ ノ ミ ッ ク プ ロ モ,̲̲̲タ ー が 存 在 す る と 推 定 さ れ た 。 実 際 、 あ ら か じ め 構 築 し た プ ロ モ ー タ ー 検 索 用 ベ ク タ ーpGAT7(図22)の レ ポ ー タ ー 遺 伝 子(GUS)上 流 に111/Sphl断 片 を 挿 入 し た プ ラ ス ミ ド をtriparentalmating法 で 青 枯 病 菌 に 伝 達 し た と こ ろ 、 高 いGUS活 性 が 認 め ら れ た(図21‑B、 図23)。 さ ら に 、 細 分 化 し た1.ff/Pstl断 片(0.44kb)に つ い て も 、 高 いGUS活 性 が 認 め ら れ
た(図21‑C、 図23)。
麟 糞
㌔璽 鰍'曲 ノ辱 冨 蝋
聾 ∬響 謬
嚢 巽 縫建
響 欝 蟻 鯵
図23.
GUS遺 伝 子 発 現 に よ る プ ロ モ ー タ ー 活 性 の 評 価.
Ba皿HI/Sphl断 片(C)お よ びBamHI/PstI断 片(D)をpGAT7のGUS遺 伝 子 上 流 連 結 さ れ た プ ラ ス ミ ド は 、 青 枯 病 菌 へ 導 入 さ れ た 。 ま た 、 大 腸 菌(A)お よ び 青 枯 病 菌(B)に 導 入 さ れ たpGAT7は 、 コ ン ト ロ ー ル と し て 用 い ら れ た 。 プ ロ モ ー タ ー 活 性 は 、GUS遺 伝 子 の 発 現 を も と に し 、 細 菌 の 菌 体 破 砕 液 に5‑bromo・4‑chloro‑3‑indolyl‑91ucuronide(X‑91uc)を 混 合 し 、24時 間 後 の 呈 色 に よ っ て 観 察 さ れ た 。
し か し な が ら 、Pstl/Sphl断 片(図21‑D)な ら び にpGAT7(図21‑E)のGUS活
性 はGUSフ リ ー ベ ク タ ー(図21‑F)と 同 様 に 極 め て 低 か っ た 。 こ れ ら の 実 験 か ら 、 プ ロ モ ー タ ー シ ー ク エ ン ス は111/Pstl断 片(BP断 片)中 に 存 在 す る こ と が 明 ら か と な っ た の で 、 こ の 断 片 の 塩 基 配 列 を ジ デ オ キ シ 法 に よ っ て 決 定 し た(図24)。 そ の 結 果 、 ト ラ ン ス ポ ゾ ン のIRシ ー ク エ ン ス26'94)がBP断 片 の 3'末 端 に 検 出 さ れ た こ と か ら 、 ト ラ ン ス ポ ゾ ン は 導 入 菌 染 色 体 上 の プ ロ モ ー タ ー 下 流 に 連 結 さ れ て い る こ と が 実 証 さ れ た 。 本 結 果 か ら は 、BP断 片 中 のRNA ポ リ メ ラ ー ゼ 結 合 部 位 は 明 ら か で な い が 、BP断 片 に 連 結 し た 遺 伝 子 が 転 写 さ れ て い る こ と か ら 、 こ の 分 離 断 片 は 青 枯 病 菌 の 発 現 ベ ク タ ー と し て 利 用 で き る と 考 え 、 各 種 の ベ ク タ ー を 構 築 し た 。 最 終 的 に 、pUC19か ら 分 離 し た ポ リ リ ン カ ー(5'‑BamHI‑Smal‑Kpnl‑Sacl‑EcoRI‑3')をBP断 片 のBamlllサ イ ト に 連 結 し て 、i.11、Saclお よ びKpnlな ど の 単 一 サ イ ト を 利 用 で き る 青 枯 病 菌 の 発 現 ベ ク タ ー(pAT7PP)を 構 築 す る こ と に 成 功 し た 。 さ ら に 、 今 回 分 離 し た プ ロ モ ー タ ー の 大 腸 菌 に お け る 機 能 を 確 か め る た め 、pAT7PPを 大 腸 菌
37
ユむ む む CTGCAGCAGGATGCCGGCCCCTTCGTCGCGCAGCGGTTTCAGGATGTGCG
PstI アむ ロ
GATTCGCGTTGGGAAAGAACGGAACAAAGATCGACACGCGGCCATCGAGG
ユユむ ユの ユ ユ む ユらむ
CCCGCCGTGGAGATCGCCGATTTCACTCGCCGGATGTTCCTGACCAGTTG
ユフむ ユ ユ む
TCTTCGCTGTAAATGAAGACCGGCGTGCCGGTCTGCGAGCAGATGCTCGG
ユ む む
CAAATCCGCCCGGGCGATCCAGTGTTCCGCCAGGCGAGGTTGATCGTGAA
SmaI む む ヨ
GTCCGGCAGGGACCGTGATGGGCGTGTGCGACGGCATGGTGATGCTCCTT
ヨリ ヨ ヨ ムむ ヨらむ
TGGGTGGTTGATTTCTGCCTGCGCTACGGGTCATGACATTACGTCAGAGG
ヨ ヨ む
CAGCAGCGGGCGGCTTGACTCACATCAGGGGGAACCGCAGAATTCGGAAA
EcoRI
む る む
AAATCGTACGCTAACCTAACGGTGTTCTCGTGCGGGATCC
BamHI 図24.
プ ロ モ ー タ ー 活 性 を 示 すBamHl/Sphl断 片 の 塩 基 配 列.
制 限 酵 素 サ イ ト を 直 線 で 、 ま たTn4431のIRシ ー ク エ ン ス を 点 線 で 示 した 。
に導 入 す る こ と に した 。 しか し、GUS遺 伝 子 は も と も と大 腸 菌 か ら分 離 さ れ た もの で あ る か ら53)、BP断 片 に 連 結 す る マ ー カ ー 遺 伝 子(GUS)をluxオ ペ ロ ン に 置 き換 え る 必 要 が あ る 。 しか し、pAT7PPの ・lfサ イ ト内 に 導 入 し たluxオ ペ ロ ン は 大 腸 菌 で 発 現 し な か っ た 。 あ ら か じめlacプ ロ モ ー タ ー の22・63)下流 に
連 結 し たluxオ ペ ロ ン は 大 腸 菌 で 発 現 す る こ と が 確 認 さ れ て い る の で 、 今 回 分 離 し た プ ロ モ ー タ ー は 少 な く と も大 腸 菌 を含 む グ ラ ム 陰 性 細 菌 に は 利 用 で き な い が 、 青 枯 病 菌 で は 機 能 的 に 作 動 す る こ と が 示 唆 さ れ た 。 す な わ ち 、 本 実 験 で 構 築 し たpAT7PPは 青 枯 病 菌 の 発 現 ベ ク タ ー と し て 極 め て 有 効 に 利 用 で き
る こ と が 示 唆 さ れ た 。
第4項 遺 伝 子 標 識 した青 枯 病 菌 の植 物 体 内 に お け る挙 動 の 解 析
青 枯 病 菌 を 遺 伝 子 標 識 す る に あ た っ て は 、 トラ ンス ポ ゾ ン の 染 色 体 へ の 導 入 に よ っ て 病 原 性 に 関 与 し た 遺 伝 子 が 破 壊 さ れ る 可 能 性 が あ る た め 、 植 物 体 内 で の 挙 動 を 解 析 す る場 合 に は 、 病 原 性 が 欠 失 し て い な い こ と を あ ら か じ め 確 認 し て お か な け れ ば な らな い 。 そ こ で 、 発 光 能 を有 す る5つ の 青 枯 病 菌 に つ い て は 、 約1カ 月 間 生 育 させ た トマ ト(品 種 ポ ン テ ロ ー ザ)の 上 位 葉 を 用 い て 感 染 性 を 検 定 し た 。 い ず れ の 菌 の 場 合 に も、 接 種 葉 は接 種 後3日 目 か ら 部 分 的 に 萎 凋 し始 め 、 そ の 後 完 全 萎 凋 す る に 至 っ た(図25)。 こ れ らの 病 徴
藩 嚇 警 暴
,犠 毒 ∵轟
L
HNLYPWCW 隔繭 駕
図25.
遺 伝 子 標 識 した 青 枯 病 菌 の 感 染 性 検 定.
切 断 トマ ト上 位 葉 を 、 細 菌 液(104細 菌/mlに 調 整)に 浸 漬 し た 後 、30℃ 、 全 日照 条 件 下 で 培 養 し た 。 接 種 葉 の 病 徴 は 、 黄 化(LY)、 部 分 萎 凋(PW)、 完 全 萎 凋(CW) に 区 別 し た 。 ま た 、 対 照(HN)に は 、 非 接 種 トマ ト葉 を用 い た 。
発 現 経 過 は 、 野 生 株 と 同 じで あ っ た こ とか ら 、 標 識 菌 は 野 生 株 と 同 じ 病 原 性 を 有 し 、 植 物 体 内 で も 同 様 の 増 殖 ・移 行 を 示 す も の と 考 え ら れ る 。 そ こ で 、 青 枯 病 菌 の 植 物 体 内 に お け る増 殖 度 を 明 らか に す る た め 、 最 も発 光 力 の 強 い
39