〆へ

欝

へ

鷲,

4つ

図31.

トマ トの 根 に お け るKM‑201の 定 着 性

数 値 は 、 トマ ト種 子 に 浸 漬 接 種 し た 細 菌 数 を 示 す 。

図32.

KM‑201(A}お よ びKM‑201/lux(B)の トマ ト萎 凋 病 菌 の 菌 糸 伸 長 に 対 す る 抑 制 効 果.

KM‑201お よ びKM‑201/luxの 抗 菌 活 性 は他 の分 離 細 菌 よ り 強 く、

両 者 の 抗 菌 活 性 は 同 レ ベ ル で あ る と 判 定 さ れ た 。

51

以 上 の 結 果 か ら 、KM‑201は 根 面 棲 息 性 細 菌 と し て 防 除 シ ス テ ム に 適 用 で き る と 考 え ら れ る 。 ま た 、KM‑201の 諸 特 性 をSmibertとKriegの 方 法9°)に 従 っ て 調 査 し た と こ ろ 、Serratiamarecscensで あ る と 同 定 さ れ た 。

2.根 面 棲 息 性 細 菌 の 遺 伝 子 標 識

本 実 験 に お い て 、biparentalmating法 に よ っ てpUCD623を も つ 供 与 体 細 菌(E.coliHB101株)か ら 受 容 体 細 菌(KM201、 約109の 細 菌 を 使 用)へ 伝 達 し た 結 果 、 約200の テ ト ラ サ イ ク リ ン 抵 抗 性 接 合 体 が 得 ら れ 、 こ れ ら の う ち 5つ の 接 合 体 は 発 光 能 を 有 し て い た 。 発 光 生 接 合 体(KM‑201/lux)の 発 光 能 を 図33に 示 す 。 ま た 、 発 光 能 を 示 すKM‑201/luxの 染 色 体DNA中 に マ ー カ.̲̲̲遺

㍉ 瑚

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図33.

KM‑201〃uxの 発 光 生 産 能.

ト ラ ン ス ポ ゾ ン が 導 入 さ れ たKM‑201をCCp培 地(10μ9/m1の テ トラ サ イ ク リ ン を 含 む)で 培 養 し た 後 、X線 フ ィ ル ム で 露 光 処 理 した(6時 間)。

伝 子 が 挿 入 さ れ て い る か 否 か に つ い て は 、luxオ ペ ロ ン 遺 伝 子 を プ ロ ー ブ と し た サ ザ ン ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン 分 析 に よ っ て 確 認 し た(図34)。 ま た 、 形 質 転 換 さ れ たKM‑201/luxが も と の 細 菌(KM‑201)と 同 様 の 抗 菌 活 性 を 保 持 し て い

る こ と に つ い て も 確 認 し た(図32)。

75kb‑→ レ 顔x.

〈‑19kb

き  ト

雫2345

図34.

KM‑201!'ux染 色 体DNAの サ ザ ン ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン 分 析.

KM‑201(レ ー ン3、5)お よ びKM‑201/lug(レ ー ン2、4)の 染 色 体DNAを 、

・!1ま た はPstlで 分 解 し 、1%ア ガ ー ロ ー ス ゲ ル で 電 気 泳 動 し た 。1・11切 断 でpUCD623か ら 切 り 出 さ れ た1uxオ ペ ロ ン(レ ー ン1)を..標 識 し た 後 、 ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン の プ ロ ー ブ と し て 用 い た 。

KM‑201/1uxの 根 面 棲 息 性 を評 価 す る た め 、KM‑201/1uxの 懸 濁 液 に トマ ト種 子 を浸 漬 処 理 し、15日 間 土 壌 で 生 育 させ た トマ トの 根 部 を 選 択 培 地 上 に 押 し付 け 、 新 た に伸 長 し た 根 表 面 か ら 処 理 菌 が 検 出 で き る か 否 か に つ い て も検 討 し た 。 そ の 結 果 、 伸 長 し た 根 に お い て もKM‑201/luxは 増 殖 し て お り 、 発 光 能 も 確 認 さ れ た(図35)。 以 上 の よ う に 、 遺 伝 子 標 識 したKM‑201/luxは 本 来 の 特 性

53

a

・ ・凶 一ノ 磁

A

B

r'

一 〆

図35.

発 芽2週 間 目 の トマ ト幼 苗(A)と トマ ト根 に 定 着 性 を示 すKM‑201〃uxの 発 光 能(B).

トマ ト種 子 をKM‑201/1αxで コ ー テ ィ ン グ 処 理 し た 後 、 非 滅 菌 土 壌 に播 種 した 。

10'°

108

106

104

102

9:8﹂∈o言旧﹂202顎o﹂3∈≡

Incubationdays) 図36.

トマ ト根 の 伸 長(A)と 根 の 先 端 部 に お け るKM‑201/'uxの 密 度 変 化(B).

KM‑201/1ux処 理 した トマ ト種 子 を 、TM‑3接 種 しな い キ チ ン無 添 加 上 壌(●)TM‑3を あ ら か じ め 30日 間 培 養 した キ チ ン 添 加 土 壌(■)、TM‑3接 種 し な い キ チ ン 添 加 土 壌(▲)お よ びTM‑3を あ らか じめ30日 間 培 養 した キ チ ン無 添 加 土 壌(▼)で そ れ ぞ れ 生 育 さ せ た 。 囮 一201/1ux処 理 の トマ ト種 子 を コ ン ト ロ ー ル(○)と し た 。 根 の 先 端 部(1cm)を ラ ン ダ ム に5本 切 り取 り、 破 砕 後 、 選 択 培 地 上 に 塗 沫 した 。 数 値 は 同 様 の 試 験 を3回 繰 り返 した 平 均 値 を 示 す 。

を 失 う こ と な く、 安 定 的 な 根 面 棲 息 能 を保 持 して い た 。

つ ぎ に 、 形 質 転 換 さ れ たKM‑201/luxの 根 面 棲 息 性 の 安 定 性 お よ び そ の 有 効 性 を 明 ら か に す る た め 、 新 た に 伸 長 した 根 の 先 端 部 分 に お け るKM‑201/luxの 増 殖 に つ い て 調 べ た 。 図36に は トマ ト の 根 の 先 端 部 分 に お け る 増 殖 す る KM‑201/luxの 菌 密 度 変 化 を 示 し た 。KM‑201/luxは 根 の 先 端 部 分 で 常 に 検 出

さ れ る が 、 根 の 伸 長 が 進 む に つ れ て 、 菌 密 度 は 徐 々 に 減 少 す る 傾 向 が 見 ら れ た 。 こ の よ う な 菌 密 度 の 減 少 は 処 理 菌 の 増 殖 度 を 反 映 す る も の で あ っ て 、 根 面 棲 息 性 細 菌 を 利 用 し た 防 除 効 果 を低 下 させ る 原 因 に つ な が る と考 え ら れ る 49,1°8)

。 す な わ ち 、 根 面 棲 息 性 細 菌 を い か に 安 定 的 に 増 殖 さ せ る か が 、 有 効 な 微 生 物 防 除 を 行 う際 の 大 き な 課 題 で あ る と考 え られ る 。S.marecscensは キ チ ン を 分 解 し 、 そ の 産 物 を資 化 して 増 殖 す る こ とが 明 ら か に さ れ て い る の で 72)、 よ り 効 果 的 な 微 生 物 防 除 法 の 確 立 に は 本 菌 と キ チ ン分 解 性 の 微 生 物 を 併

用 が 得 策 と 考 え た37)。

3.遺 伝 子 標 識 した 根 面 棲 息 性 細 菌 の キ チ ン 分 解 産 物 の 資 化 性

根 面 棲 息 性 細 菌 が キ チ ン 分 解 微 生 物 に よ っ て 生 成 さ れ た キ チ ン分 解 産 物 を 資 化 で き る 能 力 が あ れ ば 、 そ の 細 菌 は キ チ ン分 解 産 物 を 炭 素 源 と し て 利 用 し、

土 壌 中 で 安 定 し て 増 殖 で き る と考 え ら れ る 。 そ こ で 、xM‑ZOO/luxの キ チ ン 分 解 性 あ る い は キ チ ン 資 化 性 に つ い て 検 討 した 。 そ の 結 果 、KM‑201/luxは コ ロ イ ダ ル キ チ ン の み を 炭 素 源 と し て 用 い た 場 合 に は 、 徐 々 に増 殖 し た が 、 精 製 キ チ ン を炭 素 源 と し た 場 合 に は 、 ほ と ん ど増 殖 し な か っ た 。 ま た 、N一 ア セ チ ル グ ル コ サ ミ ン や キ トペ ン ト.̲̲...スを 炭 素 源 と して 用 い た 場 合 に は 、 著 しい 増 殖 が 見 ら れ た(表9)。 こ れ らの 結 果 か ら 、KM‑201/luxは キ チ ン 分 解 能 は も た な い も の の 、 コ ロ イ ダ ル キ チ ン や 精 製 キ チ ン の 分 解 産 物 は 資 化 で き る こ と が 示 唆 さ れ た 。 ま た 、 こ の よ う な 特 性 に つ い て は 、KM‑201/luxと 非 形 質 転 換

55

体(KM・201)の 間 に 差 は 認 め ら れ な か っ た(表9)。

表9.2元 性 微 生 物 防 除 シ ステ ム に用 い た微 生 物 の 諸 特 性 分離菌

S亡reptomycesanロ1a亡US TM‑3

Serratiamarcescens KM‑201KM‑201/luxa

培 地b)

Potatosucroseagar{PSA) Potatodextroseagar{PDA)

CzapekN‑acetylglucosamineagar(CAgA) Czapekchitopentoseagar(CCpA) Czapekcolloidalchitiǹ)agar(CCoA) Czapekchinagar(CCA}

Mgminimaldextroseagar{M9}

ト マ ト 萎 凋 病 菌 に 対 す る 抗 菌 活 性

ト マ ト 根 へ の 定 着 性

テ ト ラ サ イ ク リ ン 抵 抗 性

発 光 生 産 能

十十十十十十± +++++一士十十

十d) 十 十 十 十

一#一 十 十 十 十

a¶DC﹂q

luxオ ペ ロ ン お よ び テ トラ サ イ ク リ ン抵 抗 性 遺 伝 子 が 導 入 さ れ たKM‑201変 異 体 。 培 地 中 に 添 加 した 炭 素 源 濃 度 は10mg/m1と した 。

コ ロ イ ダ ル キ チ ン はHiranoandNagaoら の 方 法 に 従 い 調 整 し た13)。

+ ,良 好 な 生育;±,わ ず か な 生 育;一,生 育 しな い

一 般 に、 拮 抗 微 生 物 の 持 つ 抗 菌 活 性 は 、 併 用 さ れ る 培 地 成 分 に よ っ て し ば し ば 変 動 す る こ とが 報 告 さ れ て い る3)。 そ こ で 、KM‑201/1HXの 抗 菌 活 性 を 胞 子 プ レ ー ト法 に よ っ て 調 べ た 。 す な わ ち 、 をCCpA固 形 培 地 上 に 画 線 し、2日

間 培 養 し プ レ ー トを トマ ト萎 凋 病 菌 の 胞 子 プ レ ー ト上 に 移 し 、 数 日 間 培 養 し た 後 、KM‑201/luxの 抗 菌 活 性 に よ る トマ ト萎 凋 病 菌 の 抑 制 効 果 を 観 察 し た 。 そ の 結 果 画 線 培 養 したKM‑201/luxは 抗 菌 物 質 を生 産 し 、 下 層 の 萎 凋 病 菌 の 生 育 を 顕 著 に 阻 止 す る こ とが 明 らか と な っ た(図37)。 以 上 の 結 果 か ら、 キ チ ン

質 を 分 解 し、chit・pent・seの よ う な キ チ ン 分 解 産 物 を 供 給 す る微 生 物 を 共 存 さ せ れ ば 、 土 壌 中 に お け るKM‑201/1uxの 増 殖 が 促 進 で き る と考 え ら れ た 。

灘譲 、 蕪垂 難 ゼ

＼ 魅 ./

▼一 圏 p

図37.

トマ ト萎 凋 病 菌 の 胞 子 プ レ ー ト法 に よ るKM‑201〃UXの 抗 菌 活 性 試 験.

KM‑201/luxが 増 殖 したCCp培 地 を切 り 出 し 、 トマ ト萎 凋 病 菌 の 胞 子 を 包 埋 した 培 地 上 に 接 着 し た 。