原発性胆汁 性肝硬 変肝組織 におけ るFas発
現 の免疫組織 化学的検 討
貴
志
文
俊
キ ー ワ ー ド:Fas, apoptosis, liver, primary biliary cirrhosis, immunoelectron microscopy
緒 言
原 発 性 胆 汁 性 肝 硬 変(primary biliary cirrhosis;
PBC)は 中年 女 性 に 好 発 す る慢 性 進 行 性 胆 汁 う っ滞 性 肝 疾 患 で,初 期 肝 病 変 と して は 門 脈 域 の 小 葉 間 胆 管 に分 節 状 に発 生 す る慢 性 非 化 膿 性 破 壊 性 胆 管 炎(CNSDC)が 特 徴 的 で あ る.胆 管 障 害 の 機 序 と して は,抗 ミ トコ ン ド リ ア 抗体(AMA)を は じめ とす る種 々 の 自己 抗 体 の 出 現, シェー グ レ ン症 候 群 の よ うな 自 己免 疫 性 疾 患 を しば しば 合 併 す る こ とな ど よ り,免 疫 学 的 機 序 が 深 く関 与 し て い る もの と考 え ら れて い る.す で にGershwinら1)に よ って, AMAの 主 要 対 応 抗 原 が ミ トコ ン ド リア 内 膜 に 存在 す る 2オ キ ソ酸 脱 水 素 酵 素 複 合 体(特 にPDH-E2)で あ る こ とが 明 らか に され 研 究 の発 展 もみ られ て き て い るが, 組 織 障 害 の機 序 は ま だ 明 らか で は な い.近 年,ア ポ トー シ スが 免 疫 性 疾 患 で の組 織 破 壊 の 一 つ の プ ロセ ス と して 注 目され て い る.PBCに お い て も,以 前 よ りBernuau ら2)が電顕 的 に ア ポ トー シ ス を反 映 す る胞 体 や 核 の 濃縮 像 を示 す 胆 管 上 皮 細 胞 を見 出 し,細 胞 死 の 一 つ と して ア ポ ト-シ スが あ る こ とを示 して い た が,近 年 種 々 の 検 出 法 が 開発 され た こ と もあ り,障 害 胆 管 上 皮 細 胞 で のDNA断 片化 細 胞 の 検 出3)4)の報 告 な ど胆 管 細 胞 障 害 に お け るア ポ トー シ ス の 関 与 が 注 目 さ れ て い る.本 研 究 で は,ア ポ ト シ ス誘 導 シ グナ ル を直 接 細 胞 内へ 伝 達 す る分 子 と して 同定 さ れ たFas5)のPBC症 例 肝 組 織 に お け る発 現 を免 疫 組 織 化 学 的 に 検 討 した の で報 告 す る. 対 象 と 方 法 対 象 は 厚 生 省 「難 治 性 の 肝 炎 」 調 査 研 究 班 の 診 断 基 準 に 基 づ い て 診 断 し た 原 発 性 胆 汁 性 肝 硬 変 患 者10症 例 で あ る.全 例 女 性(38-65歳)で あ り,Scheuer分 類6)に よ る 組 織 学 的 病 期 で は, stage Ⅰ 5例, stage Ⅱ 4例, stage Ⅲ 1例 で あ る.各 症 例 に つ い て 血 液 生 化 学 検 査 お よ び 抗
ミ ト コ ン ド リア 抗 体 を 測 定 し た.尚,い ず れ の 患 者 も 免 疫 抑 制 剤 の 投 与 を 受 け て い な い.ま た,対 象 と し てB型 お よ びC型 慢 性 肝 炎(CH)14例(B型C型 と も7例, minimal CH 3例, mild CH 7例, moderate CH 4 例)の 肝 組 織 も 用 い,比 較 検 討 し た. 腹 腔 鏡 下 肝 生 検 に て 得 ら れ た 肝 組 織 は,2つ に 分 け, 一 方 は10%中 性 ホ ル マ リ ン 固 定 後 ,通 常 光 顕 観 察 用 と し, 残 り の 一 方 は,2％ periodate-lysine-paraformaldehide (PLP)固 定 を 行 い 免 疫 染 色 用 と し てO.C.T. compound に 凍 結 包 埋,保 存 し た.PLP固 定 の 組 織 は,凍 結 切 片 作 成 後,酵 素 抗 体 間 接 法 に て 染 色 を 行 っ た.Isobeら7)の 方 法 も し くはH2O2加methanolに て 組 織 中 の 内 因 性 ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ を 阻 止 し た.1次 抗 体 と し てZB 4 (Fas) 8), Leu 2a(CD 8), Leu 3a (CD 4), Leu 15 (CD 11 b), HLA-DR (HLA-class Ⅱ), HLA-ABC(HLA-class
Ⅰ)を 使 用 し 反 応 させ た.1次 抗 体 反 応 後 ,2次 抗 体 と し てHRPO-labeled rabbit anti-mouse IgG (Fab')を 反 応 さ せ た9). H2O2加diaminobenzidine (DAB)に て 反 応,メ チ ル グ リ ー ン に て 核 染 色 を 行 い 脱 水 後 包 埋 し た. 電 顕 用 と し て,光 顕 と 同 様 に2次 抗 体 と の 反 応 後, glutar aldehideに て 後 固 定 を 行 い, H2O2加DABに て 発 色 し た.Osmium酸 と 反 応 後, Epon-araldite樹 脂 包 埋 を 行 っ た.観 察 は,超 薄 切 片 を 作 成 し,無 染 色 に て 電 子 顕 微 鏡(H-700H)を 用 い て 観 察 し た . 光 顕 レ ベ ル で の 胆 管 上 皮 細 胞 な ら び に 肝 細 胞 に お け る Fas, HLA-DR, HLA-ABCの 染 色 評 価 は ,著 者 な らび
(平成14年1月17日 受 理) 指 導:辻 孝 夫教 授(岡 山大 学 大 学 院 医 歯 学 総 合 研 究科 消 化 器 ・肝 臓 ・ 感 染 症 内 科 学 内科 学 第 一) 論 文 請 求 先:姫 路 赤 十 字 病 院 姫 路 市 下 手 野1-12-1 貴 志 文 俊 電 話:0792-94-2251 FAX: 0792-96-4050
に 共 同 研 究 者 の2名 で 鏡 検 し, 2 +; strong,1 +; weak,+/-; very weak or noneの3段 階 で 判 定 し た.
結 果 酵 素 抗 体 間 接 法 に よ る光 顕 レベ ルで の 観 察 で は,Fasは PBC症 例 の 全 例 に お い て小 葉 間 胆 管 胆 管 上 皮 細 胞 な らび に肝 細 胞 に 発 現 が 認 め られ た.Fasは 細 胞 膜 と細 胞 質 に 発 現 し,細 胞 膜 に よ り強 く発 現 して い る こ とが 観 察 され た.胆 管 上 皮 細 胞 で の 発 現 は慢 性 肝 炎 例 と比 較 して,明
らか に 発 現 の 増 強 が 認 め られ た(Fig. 1-A, B, Table
2).一 方,肝 細 胞 で の 発 現 は慢 性 肝 炎 例 に比 して 弱 い 傾
向 に あ っ た(Fig. 1-A, B, Table 2).
Scheuer分 類 で の 病 期 別,あ る い は 肝 生 検 時 のAMA 値 や 肝 機 能 等 の 生 化 学 検 査 と胆 管 上 皮 細 胞 に お け るFas
Table 2 Expression of Fas in primary biliary cirrhosis
PBC: primary biliary cirrhosis. CH: chronic hepatitis.
Fig.
1 Immunohistochemical
staining
of
Fas
(A),
CD 8 (C),
CD 4 (D),
HLA-ABC (E),
and
HLA-DR (F)
in
serial
sections
of
a PBC patient
(Case
3
in
Table
1).
Bile
duct
epithelial
cells
show
strong
expression
of
Fas,
HLA-ABC,
and
HLA-DR.
Both
CD 8
and
CD 4
T cells
accumulate
around
the
bile
duct
and
infiltrate
in
the
intraepithelial
space
of
the
bile
duct
(arrows).
In
chronic
hepatitis
B (B)
,
bile
duct
epithelial
cells
show weak expression
of
Fas(+/-).
の発 現 に は 特 に相 関 は認 め られ な か っ た(Table 1).同 症 例 組 織 切 片 で の 検 討 で も観 察 され た ほ ぼ 全 て の 小 葉 間 胆 管 に 発 現 は 認 め ら れ,CNSDCを 認 め る障 害 胆 管 と 非 障 害 胆 管 で は 同様 にFasの 発 現 増 強 が 観 察 され た. 連 続 切 片 で の検 討 で,10例 中4例 の胆 管 上 皮 細 胞 内 に CD 4陽 性 リンパ 球 の 浸 潤 が 観 察 さ れ た.う ち1例 で は1 っ の小 葉 間 胆 管 の 胆 管 上 皮 細 胞 内 にCD 4陽 性 リンパ 球 の著 明 な浸 潤 が 観 察 さ れ た(Fig. 1-D).そ の様 な 胆 管 上 皮 細 胞 で はHLA-DRの 新 た な発 現(CHで は 殆 ど発 現 を認 め な か っ た)が 観 察 さ れ,Fasの 発 現 も2+と 増 強 が観 察 され た(Fig. 1-A, F).ま た,す べ て の 症 例 で,胆 管上 皮 細 胞 に お け るHLA-ABCの 発 現 が み られ (Fig. 1-E),10例 中3例 の 胆 管上 皮 細 胞 内 にcD 8陽 性CD 11b陰 性 の 細 胞 障 害 性Tリ ン パ 球(CTL)の 浸 潤 が 観 察 さ れ た(Fig. 1-C). 電 顕 レ ベ ル で の 観 察 で は,Fasは 胆 管 上 皮 細 胞 膜 表 面 のbasal及 びlateralに 強 く発 現 が 認 め ら れ, apicalに は 認 め ら れ な か っ た(Fig. 2-A).ま た 胆 管 上 皮 細 胞 細 胞 質 内 小 胞 体 に もFasの 発 現 が 認 め ら れ た(Fig. 2-B). な お,観 察 し た 範 囲 で は ア ポ トー シ ス 小 体 は 見 出 さ れ な か っ た. 考 察 Fasは,ア ポ トー シ ス の シ グ ナ ル を 細 胞 内 に 伝 達 す る 細 胞 膜 蛋 白 で,TNF/NGF受 容 体 フ ァ ミ リ-に 属 す る10). Leithauserら11)は,Fasと 同 一 分 子 で あ るAPO-1の 正
Table 1 Clinical data and immunohistochemical grading of 10 patients with PBC
AMA: antimitochondrial antibody. BECs: bile duct epithelial cells. Histological staging is according to Scheuer's criteria.
Fig. 2 Immunoelectron micrographs showing Fas expression. (A) Bile duct epithelial cells (E) express Fas at the basolateral membrane . L,lumen of the bile duct. ×3,600. (B) Higher magnification shows Fas expression in the endoplasmic reticulum of a bile duct epithelial cell (arrow). ×6,400.
常 人 臓 器 での 発 現 に つ い て 免 疫 組 織 学 的 に検 討 して お り, 肝 臓 で は 肝 細 胞 と胆 管 上 皮 細 胞 の 膜 上 の発 現 を報 告 して い る.我 々12)はす でに 脂 肪 肝 を含 む全 ての 肝 疾 患 にお い て, 肝 細 胞 膜 にFasが 発 現 して お り,慢 性 肝 炎 で は 炎 症 の 強 い症 例 に発 現 の 増 強 が 認 め ら れ る こ と を明 らか に して い る.PBCに つ い て は 黒 木 ら13)が,胆 管 上 皮 細 胞 の 細 胞 質 に 強 く発 現 し,同 一 胆 管 で も個 々 の 細 胞 に て異 な る との 結 果 を報 告 して い る.今 回 の 我 々 の観 察 で は,FasはPBC の 胆 管 上 皮 細 胞,肝 細 胞 の 細 胞 膜 及 び 細 胞 質 に 発 現 し, 細 胞 膜 に よ り強 くFasの 発 現 が 認 め られ た が,同 一 胆 管 の個 々 の 細 胞 で は 発 現 の 強 さ に つ い て は 大 き な違 い を認 め な か っ た.こ の 理 由 と し て,我 々 はIgG分 画 のFas抗 体(clone ZB 48))を 使 用 し,黒 木 らが使 用 したIgM分 画 と異 な る こ とが 一 因 か と考 え られ た. ま た本 研 究 で は,免 疫 電 顕 に よ る超 微 形 態 観 察 で も胆 管 上 皮 細 胞 膜 上 にFasの 発 現 を確 認 した.細 胞 膜 の 局 在
で は,basal及 びlateralに 強 く発 現 が 認 め られ,apical
に は 認 め られ な か っ た.さ らに 細 胞 質 の 小 胞 体 に も そ の 局 在 が 確 認 さ れ た こ と よ り,Fasが 同部 に お い て 産 生 さ れ て い る こ とが 明 らか に な っ た.し か し,電 顕 に よ る観 察 で は胆 管 上 皮 細 胞 に お い て ア ポー トシ ス に特 徴 的 な形 態 は 観 察 され なか っ た.実 際,通 常 電 子 顕 微 鏡 に よるPBC の 障 害 胆 管 上 皮 細 胞 の 観 察 で は,い くつ か の 胆 管 上 皮 細 胞 が ア ポ トー シス の 形 態 を示 して い る こ とが 報 告 され て い るが,頻 度 と し て は まれ で あ り,そ れ は 恐 ら くで き た ア ポ トー シ ス小 体 が 速 や か に 胆 管 内腔 に 脱 落 す る為 と え られ て い る2)14)15). 肝 内 の 小 葉 間 胆 管 が 主 と して 障 害 さ れ るPBCに お レ て,Fasの 発 現 が 慢 性 肝 炎 に 比較 して,胆 管 上 皮 細 胞 に 強 く認 め られ た こ とは,Fasを 介 す るア ポ トー シ スがPBC で の 胆 管 上 皮 細 胞 障 害 に 関 与 して い る可 能 性 が 示 唆 され る.上 野 ら16)はGraft-versus-host diseaseに お け る胆 管 上 皮 細 胞 の ア ポ トー シ ス がFasを 介 した径 路 で生 じる と 報 告 して い るが,免 疫 学 的 異 常 を背 景 と したPBCの 胆 管 障 害 で もFasが 関 与 す る可 能 性 を示 した もの で あ る.
ま た,PBCで のFas ligandの 発 現 につ い て は,Ahmed
ら17)が,門 脈 域 な ら び に小 葉 内 で のFas ligand陽 性 単核 球 の 存 在 を 明 らか に し て お り,そ の 内76％ の 胆 管 上 皮 細 胞 内 にFas ligand陽 性 単 核 球 が 浸 潤 して い る こ と示 し て い る. 一 方,胆 管 周 囲 及 び 胆 管 上 皮 細 胞 内 に はCD 4あ る い はCD 8陽 性 リンパ 球 が 多数 浸 潤 して い る.ど ち ら が優 位 な の か につ い て は,現 時 点 で も一 定 の 見 解 は な い18)19)が, colucciら20)は 胆 管 周 囲 にCD 4陽 性 細 胞 が 多 数 観 察 さ れ る 例 を 報 告 し て,HLA-class Ⅱ 拘 束 性 細 胞 障 害 の 存 在 を 推 測 し て い る.今 回 の 検 討 で もCD 4陽 性 リ ン パ 球 の 胆 管 上 皮 細 胞 内 へ の 浸 潤 が 目 立 つ 症 例 を 経 験 し,HLA -class Ⅱ のPBC胆 管 上 皮 で の 異 常 発 現 も 認 め た21). Th
1 typeのCD 4陽 性 リ ン パ 球 が,Fas-Fas ligandシ ス テ ム を 介 し て 直 接 的 に 細 胞 障 害 に 関 わ る こ と も 報 告 さ れ て お り22),CD 4陽 性CTLがFas-Fas ligandを 介 し た 胆 管 細 胞 の ア ポ トー シ ス 誘 導(HLA-c1ass Ⅱ 拘 束 性) に 関 与 し て い る こ と も 推 測 さ れ る. 今 後,PBC胆 管 上 皮 細 胞 に お け るFas異 常 発 現 の ト リ ガ ー を 含 め た 機 序 を解 明 す る こ と に よ り,ア ポ トー シ ス のPBCに お け る 役 割 を 明 ら か に し て い く必 要 が あ る と思 わ れ る. 結 論 Fasは,PBC全 症 例 の 細 胆 管 あ る い は 小 葉 間 胆 管 の 埋 管 上 皮 細 胞 に 発 現 が 認 め られ,ウ イ ル ス 性 慢 性 肝 炎 例 と 比 較 して 発 現 の 増 強 が認 め られ た.免 疫 電 子 顕微 鏡 的 観
察 で は,Fasは 胆 管 上 皮 細 胞 のbasal及 びlateralの 細
胞 膜 に 強 く発 現 が 認 め られ,ま た細 胞 質 内小 胞 体 に もFas の 発 現 が 認 め られ た.こ れ ら の所 見 よ り,胆 管 で のFas 発 現 の 増 強 がPBCの 病 態 に 関 連 が あ る こ とが示 唆 され た. 謝 辞 稿 を終 え るに あ た り,ご懇 切 な 指 導 とこ校 閲 を賜 っ た 岡 山大 学大 学 院 医歯 学 総 合研 究 科 消化 器 ・肝 臓 ・感 染 症 内科 学(内 科 学 第一) 辻 孝 夫教 授 に 深 謀 の謝 意 を表 す と ともに,直 接御 指 導 い ただ き まし た 川崎 医 科 大 学 附属 川 崎病 院 山 田剛 太 郎 副院 長 に 深 謝 いた します. 参 考 文 献
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Immunohistochemical Study of Fas in Primary Biliary Cirrhosis Fumitoshi KISHI
Department of Medicine and Medical Science, Okayama University
Graduate School of Medicine and Dentistry
Okayama 700-8558, Japan (Director: Prof. T. Tsuji)
The expression of Fas on the epithelial cells of bile ducts was examined in liver specimens from 10 patients with primary biliary cirrhosis (PBC), and 14 patients with chronic hepatitis by both light and electron microscopy using the indirect peroxidase-labeled antibody method. In all patients with PBC, Fas was observed on the surface of epithelial cells of interlobular bile ducts.
By electron microscopy, electron-dense reaction products of Fas were detected on the basolateral plasma membrane
of the bile duct epithelial cells, as well as on some membranes of the endoplasmic reticulum. Fas was expressed more
strongly on the surface of the epithelial cells of interlobular bile ducts in PBC than of those in chronic hepatitis.
These findings suggest that increased expression of Fas on such bile ducts may play some role in the pathogenesis of
