Helicobacter
pylori感
染 胃 粘 膜 に お け る 胃 ム チ ン 生 合 成 の 変 化
-UDP-ガ
ラ ク トー ス転 移 酵 素 活 性 測 定 に よ る検 討
田
中
彰
一
キ ー ワ ー ド: Helicobacter pylori,胃 粘 膜,ム チ ン 生 合 成,ガ ラ ク トー ス 転 移 酵 素
緒 言
Helicobacter pylori(以 下H. pylori)の 胃 へ の 感 染 は 消 化 性 潰 瘍 を 引 き起 こ す こ と が 明 ら か と な り1),H.pylori の 除 菌 療 法 が 潰 瘍 再 発 の 防 止 に 有 効 で あ る こ と が 示 さ れ て き た2-5).と こ ろ で,H. pyloriの 感 染 に よ っ て 引 き起 こ さ れ る 胃粘 膜 障 害 の 機 序 の 中 で,胃 ム チ ン の 変 化 は 重 要 で あ る と 考 え ら れ て い る6-9).胃 上 皮 細 胞 で 合 成 さ れ, 分 泌 さ れ る 胃 ム チ ン は そ の 粘 稠 性 と ゲ ル 形 成 能 に よ り, 塩 酸 や ペ プ シ ン と い っ た 刺 激 か ら 胃 粘 膜 を 保 護 す る と い う重 要 な 役 割 を 演 じ て い る10,11).最 近,胃 上 皮 細 胞 の 培 養 系 に お い て,H. pyloriの 感 染 が,胃 ム チ ン の 中 のMUC 5ACとMUC 1の 合 成 を 阻 害 す る こ とが 報 告 さ れ た12). ム チ ン は ペ プ チ ドに 糖 鎖 がO-グ リ コ シ ド結 合 す る こ と に よ り合 成 され る.UDP-ガ ラ ク トー ス 転 移 酵 素(以 下UDP -Gal-T)は そ の ペ プ チ ドに 結 合 す る糖 鎖 が 延 長 ・完 成 す る 過 程 に お い て 働 く重 要 な 酵 素 の1つ で あ る13).既 に 我 々 は,内 視 鏡 的 生 検 に よ っ て 得 ら れ た ヒ ト胃 粘 膜 のUDP-Gal-T活 性 を 測 定 す る た め に,PNAレ ク チ ン を 用 い た 測 定 系 を 開 発 し,報 告 し た14).今 回 我 々 は,H. pyloriに よ り 胃 ム チ ン の 生 合 成 が 障 害 さ れ る 機 序 を 明 ら か に す る た め,こ の 測 定 系 を 用 い て,H. pylori感 染 胃 粘 膜 のUDP -Gal-T活 性 を 測 定 し ,検 討 し た. 対 象 と 方 法 1. 対 象 何 ら か の 腹 部 症 状 あ る い は 胃 疾 患 の ス ク リー ニ ン グ 目 的 で 上 部 消 化 管 内 視 鏡 検 査 を う け た37例(女 性17例,男 性20例,年 齢 は26∼82歳,平 均 年 齢54歳)を 対 象 と し た. 疾 患 の 内 訳 は 胃 炎28例,胃 潰 瘍2例,十 二 指 腸 潰 瘍2例, 十 二 指 腸 炎3例,正 常2例 で あ っ た.プ ロ ト ン ポ ン プ 阻 害 剤,H2ブ ロ ッ カ ー,他 の 抗 潰 瘍 剤,ス テ ロ イ ド剤,NSAID を 内 服 し て い る 症 例 は 除 外 し た.内 視 鏡 時,胃 前 庭 部 と 胃 体 上 部 の 大 弩 か ら3個 ず つ 生 検 を 行 っ た.3個 の う ち 1個 はH. pylori培 養 用 に 用 い,残 る2個 はUDP-Gal-T活 性 測 定 用 に 凍 結 保 存 さ れ た.H. pyloriの 培 養 は,7 %馬 血 液,ポ リ ミ キ シ ンB2.5lU/ml,バ ン コ マ イ シ ン 10μg/ml,ト リ メ トプ リム5μg/mlを 加 え た ブ ル セ ラ 寒 天 培 地 に,生 検 組 織 を 直 接 塗 沫 し,微 好 気 条 件(O25%, CO215%, N280%)下 で5-7日 培 養 し た.ま た23例 に お い て は 細 胞 内 ム チ ン 量 の 解 析 の た め に,さ ら に 胃 前 庭 部 よ り1個 生 検 を 行 っ た.研 究 は ヘ ル シ ン キ 宣 言 の ガ イ ド ラ イ ン に 沿 っ て 行 わ れ た.ま た そ れ ぞ れ の 患 者 か ら 研 究 参 加 の 同 意 を 得 た. 2. PNAレ ク チ ン を 用 い たUDP-Gal-T測 定 系 UDP-Gal-T活 性 の 測 定 は 既 報 の 如 く で あ る14).簡 単 に 説 明 す る と,生 検 標 本 を0.3Mの シ ョ糖300μlで ホ モ ジ ナ イ ズ し,10分 間500gで 遠 心 分 離 し た .そ の 上 清 をUDP -Gal-T活 性 測 定 用 検 体 と し て 用 い た .ウ シ 顎 下 腺 ム チ ン か ら シ ア ル 酸 と ガ ラ ク トー ス を は ず し た ム チ ン(ア シ ア ロ ア ガ ラ ク トム チ ン)を ア ク セ プ タ ー と し て 使 用 し た. ELISA用 プ レ ー トの ウ エ ル を ア シ ア ロ ア ガ ラ ク トム チ ン で コ ー ト し,5mmol/Lの2-mercaptoethanol , 5 mmol/LのMnCl2, 4.8mg/mlのTriton-Xを 含 む50 mM/ LのTris-HCI (pH 7.5)にUDP-galactoseと 上 清 を (平成14年1月11日 受 理) 指 導:辻 孝 夫 教 授(岡 山大 学 大 学 院 医 歯 学 総 合 研 究 科 消 化 器 ・肝 臓 ・ 感 染 症 内科 学) 論 文 請 求 先:国 立 岩 国 病 院 内科 山 口県 岩 国市 黒 磯 町2-5-1 田 中 彰 一 電 話:0827-31-7121 FAX: 0827-31-7059 E-mail:[email protected]
168 田 中 彰 一 混 合 し,そ の 混 合 液 を ウ エ ル に 入 れ た.イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン 後,horseradish peroxidase(HRP)で 標 識 さ れ た PNAレ ク チ ン を 各 ウ エ ル に 入 れ た.HRP-PNAレ ク チ ン は 上 清 に 含 ま れ て い るUDP-Gal-Tに よ りUDP-galactoseか ら ア シ ア ロ ア ガ ラ ク トム チ ン(ア ク セ プ タ ー) へgalactoseが 転 移 す る こ と に よ り形 成 さ れ るga1actose β-(1-3)-N-acetylgalactosamineを 認 識 し,結 合 す る.結 合 し たHRPに,基 質 と し て2,2'-azino-bis(3-ethylbenz-thiazoline-6-sulfonic acid)を 加 え て 発 色 し, 波 長415nmの 吸 光 度(OD)を 測 定 し た.検 体 に 含 ま れ
る 蛋 白 量 はBio-Rad protein kit(Bio-Rad Labs., Inc, Hercules, CA, USA)を 用 い て 測 定 し,UDP-Gal-T活 性 はOD/mg proteinで 表 わ し た.検 体 の 酵 素 活 性 は,各 サ ン プ ル のOD/mg proteinと,基 準 と し て 用 い た 体 重 約 200gのSD系 雄 性 ラ ッ トの 胃 体 部 粘 膜 よ り既 報15)の ご と く調 整 し た 標 準 酵 素 検 体 と の 比 と し て 表 わ し た. 3. 胃 上 皮 細 胞 内 ム チ ン の 定 量 化 胃 上 皮 細 胞 内 ム チ ン 量 の 解 析 の た め,細 胞 内periodic acid-Schiff-alcian blue (PAS-AB)陽 性 物 質 量 を 既 報 の 画 像 解 析 の 手 法 で 測 定 し た7,14).す な わ ち,胃 前 庭 部 か ら の 内 視 鏡 的 生 検 標 本 を10%ホ ル マ リ ン 液 で 固 定 し,パ ラ フ ィ ン 包 埋 し,そ の 切 片 をPAS-AB染 色 し た.胃 上 皮 細 胞 内 ム チ ン の 定 量 化 は 画 像 解 析 装 置(Nexus-600)を 用 い て 解 析 領 域 を 設 定 し,そ の 中 の 表 層 粘 液 細 胞 の 面 積 に 対 す るPAS-AB陽 性 物 質 の 面 積 の 比(PAS-AB index)を 計 算 す る こ と に よ り行 っ た.解 析 領 域 は3∼4 ヶ 所 を 任 意 に 設 定 し,そ の 平 均 値 を 結 果 と し て 用 い た. 4. 統 計 学 的 処 理 H. pylori陽 性 と 陰 性 症 例 に お け るUDP-Gal-Tの 比 較 はt検 定 で 行 っ た.ま た,UDP-Gal-T活 性 と上 皮 細 胞 内 ム チ ン の 量 と の 相 関 は ピ ア ソ ン の 積 率 相 関 係 数 に て 評 価 し た. 結 果 1. 胃 粘 膜UDP-Gal-T活 性 37症 例 の う ち,20例 がH. pylon陽 性,17例 がH. pylori 陰 性 で あ っ た.H. pylori陽 性 例 に お い て,UDP-Gal-T 活 性 は 胃 前 庭 部 で は0.362±0.103,胃 体 上 部 で は0.360± 0.137で あ っ た.H. pylori陰 性 例 に お い て はUDP-Gal-T活 性 は 胃 前 庭 部 で は0.454±0.154,胃 体 上 部 で は 0.435±0.124で あ っ た.胃 前 庭 部 に お け るUDP-Gal-T 活 性 は,H. pylori陽 性 例 でH. pylori陰 性 例 に 比 し有 意 に 低 下 し て い た(p<0.05)(図1).一 方,胃 体 部 で は, UDP-Gal-T活 性 の 低 下 がH. pylori陽 性 粘 膜 に お い て み ら れ る も の の,統 計 学 的 な 有 意 差 は 認 め ら れ な か っ た. 2. 胃 上 皮 細 胞 内 ム チ ン 23例(H. pylori陽 性;11例,H. pylori陰 性;12例) の 胃 前 庭 部 か ら の 生 検 組 織 をPAS-AB染 色 し,胃 上 皮 細 胞 内 ム チ ン を評 価 し た.H. pylori陽 性 症 例 のPAS-AB indexは22.4±9.4%とH. pylori陰 性 症 例 のPAS-AB index=36.9±10,3%に 比 し 有 意 に 低 値 を 示 し た(p< 0.01).ま た 胃 上 皮 細 胞 内 ム チ ン 量 は 胃 粘 膜UDP-Gal-T 活 性 と 相 関 係 数0.592を も っ て 有 意 な 正 の 相 関 を 示 し た (p<0.01)(図2). 考 察 本 研 究 で は,生 体 内 に お け る 胃 ム チ ン 生 合 成 に 及 ぼ す H. pylori感 染 の 影 響 を 解 析 し た.そ し て,細 胞 内 ム チ ン 量 と ム チ ン 生 合 成 に お け る 重 要 な 酵 素 で あ るUDP-Gal-T活 性 が 胃 前 庭 部 のH. pylori感 染 胃 粘 膜 に お い て 減 少 して い る こ とが 明 ら か と な っ た.今 ま で にH. pylori感 染 に よ り 胃 粘 膜 の 表 層 粘 液 細 胞 内 の ム チ ン 量 が 減 少 す る と い う幾 つ か の 報 告 が あ る7,12,16).我々 の 結 果 と 同 様 に, Kawanoら7)は,H. pyloriが 感 染 し た 胃 前 庭 部 粘 膜 で は, PAS-AB染 色 で の 細 胞 内 ム チ ン 量 は 減 少 す る こ と を報 告 して い る.Byrdら12)は,免 疫 組 織 学 的 検 討 とin situ hybridizationに お い て,H. pylori陽 性 患 者 の 胃 前 庭 部 図1 H. pylori感 染 胃 粘 膜 と非 感 染 胃 粘 膜 にお け るUDP-Gal-T活 性 胃粘 膜 内視 鏡 下 生 検 組 織 のUDP-Gal-T活 性 を,PNAレ クチ ン法 に よ り測 定 した.胃 前 庭 部 にお いて は,UDP-GaI-T活 性 は,H . pylori 陰 性 粘 膜 に 比 しH. pylori陽 性 粘 膜 に お い て 有 意 に 低 下 し て い る (p<0.05).一 方,胃 体 部 で は,UDP-Gal-T活 性 に統 計 学 的 な有 意 差 は 認 め ら れ な い.HP; H. pylori.
図2 胃前庭部 におけ るUDP-Gal-T活 性 と上皮 細胞内ムチ ン との関係 胃前庭部生検 組織のUDP-Gal-T活 性 と,PAS-AB染 色に よる粘 膜 内胃粘 液量の相関 を検討 した.PAS-AB indexと して表 した上 皮細 胞内ムチ ン量はPNAレ クチン法によ り測定 したUDP-Gal-T活 性 と相関係数0.592で正の相 関を示 して いる(pく0.01). の 表 層 粘 液 細 胞 に お い てMUC5ACの 表 出 が 減 少 す る こ と を 報 告 し た.最 近 のin vitroの 研 究 で は,Byrdら17)は, 培 養 胃 上 皮 細 胞 を 用 い て,H. pyloriがMUC5ACム チ ン 蛋 白 の 合 成 を 減 少 させ る こ と を 報 告 し た.こ の よ う に, H. pylori感 染 胃 粘 膜 の ム チ ン 減 少 の 機 序 の1つ は,ム チ ン の 骨 格 に あ た る ペ プ チ ド鎖 の 合 成 低 下 で あ る.一 方,こ の 研 究 の 我 々 の 結 果 か ら は,UDP-Gal-T活 性 の 阻 害 に よ る ペ プ チ ド鎖 へ の 糖 鎖 延 長(ガ ラ ク トー ス 転 移)の 低 下 が 細 胞 内 ム チ ン の 減 少 の も う1つ の 機 序 で あ る と い え る. UDP-Gal-Tは ム チ ン合 成 の 律 速 酵 素 で あ り,胃 上 皮 細 胞 の ゴ ル ジ 装 置 に お い て,ム チ ン の 糖 鎖 ヘ ガ ラ ク トー ス を 転 移 す る13).こ の 研 究 で 用 い た 我 々 の 新 し いUDP-Gal -T測 定 系 は,ヒ ト 胃粘 膜 か ら 内 視 鏡 的 に 得 ら れ た 生 検 組 織 の 酵 素 活 性 を 解 析 す る こ と を 可 能 に し た.そ し て,H. pylori感 染 胃 粘 膜 で は,こ の 酵 素 の 阻 害 が,ム チ ン 生 合 成 の 低 下 を 引 き 起 こ す 可 能 性 を 示 し た.ム チ ン の 様 々 な 性 格 や 機 能 は ム チ ン の 骨 格 で あ る ペ プ チ ド鎖 に 結 合 す る 豊 富 な 糖 鎖 に 多 く起 因 す る.し た が っ て,H. pylori感 染 のUDP-Gal-T阻 害 に よ る 糖 鎖 の 変 化 は 幾 つ か の 重 大 な 環 境 の 変 化 を 引 き起 こ す も の と考 え ら れ る.第 一 に,糖 鎖 の 存 在 に よ り生 じ る ム チ ン の 粘 稠 性 か つ ゲ ル 形 成 能18)は 塩 酸 や ペ プ シ ン と い っ た 刺 激 物 か ら 胃 粘 膜 を 防 御 す る の に 重 要 で あ る た め10,11),表 層 ム チ ン の 減 少 と こ れ ら ム チ ン の 性 質 の 変 化 は,粘 膜 防 御 と し て の ム チ ン の 機 能 を 障 害 す る.実 際,粘 液 バ リ ア ー の ゲ ル 構 造 の 部 分 的 な 崩 壊 が, H. pylori感 染 胃 粘 膜 に お い て 示 さ れ て い る19)こ の よ う に,胃 粘 膜 防 御 機 構 の 障 害 はH. pylori感 染 に よ っ て 引 き 起 こ さ れ る 粘 膜 障 害 の 重 要 な 機 序 の1つ で あ る. 第 二 に,H. pyloriの ム チ ン へ の 糖 鎖 依 存 性 結 合 が 報 告 さ れ20,21),ム チ ン はH. pyloriの 上 皮 へ の 結 合 を 阻 害 す る こ と が 示 さ れ て い る22,23).胃ム チ ン の 変 化 は,H. pylori の 上 皮 へ の 接 着 と増 殖 を 容 易 に し,引 き 続 き 引 き 起 こ さ れ る 炎 症 細 胞 や 免 疫 細 胞 の 誘 導 と い っ た 宿 主 反 応 に 影 響 を 与 え る 可 能 性 が 考 え ら れ る. UDP-Gal-T活 性 低 下 の 機 序 は 不 明 の ま ま で あ る.空 胞 化 毒 素24)や 膜 結 合 蛋 白 や リ ボ 多 糖 類25)と い っ たH. pylori か ら 直 接 分 泌 さ れ る 物 質 が 阻 害 し て い る の か も し れ な い. H. pyloriの ウ レ ア ー ゼ に よ り 生 じ る ア ン モ ニ ア に よ り引 き 起 こ さ れ るpH上 昇 と い っ た 環 境 の 変 化 が,UDP-Gal -T活 性 を低 下 さ せ る 可 能 性 も あ る .ま た,ア ン モ ニ ア の 直 接 作 用 も十 分 考 え ら れ る.ア ン モ ニ ア の 直 接 的 な 影 響 は 胃 前 庭 部 で はUDP-Gal-T活 性 は 有 意 に 減 少 す る が, 胃 体 部 で は 有 意 に 減 少 しな い と い う 結 果 か ら示 唆 さ れ る. な ぜ な ら,ア ン モ ニ ア は 酸 分 泌 領 域 で あ る 胃 体 部 で は 中 和 さ れ る た め,胃 体 部 よ り 胃 前 庭 部 の 方 が,そ の 毒 性 は よ り 強 く発 揮 さ れ る か ら で あ る26).し か し な が ら,培 養 細 胞 を 用 い て 行 っ たin vitro実 験 で は,今 の と こ ろH. pylori 関 連 物 質 にUDP-Gal-T活 性 を 直 接 低 下 させ る 成 分 は 見 い だ せ ず(論 文 投 稿 中),H. pylori感 染 患 者 の 生 体 内 に お け るUDP-Gal-T活 性 の 低 下 は,菌 の 感 染 に よ る 炎 症 反 応 な ど の 二 次 的 な 生 体 反 応 の 結 果 引 き 起 こ さ れ て い る 可 能 性 も 考 え ら れ る.い ず れ に せ よ,今 後UDP-Gal-T活 性 の 阻 害 の 機 序 を 明 らか に して い く必 要 が あ る もの と思 わ れ る. 結 論 H. pylori感 染 は,UDP-Gal-T活 性 の 低 下 に よ り 胃 ム チ ン 生 合 成 を 阻 害 し,胃 粘 膜 防 御 機 構 を 障 害 す る.こ の こ と が,H. pylori感 染 に よ り 引 き 起 こ さ れ る 胃 粘 膜 障 害 の 重 要 な 機 序 の 一 つ と考 え ら れ る. 謝 辞 稿 を終 え るに あ た り,ご懇 切 な 指 導 とご校 閲 を賜 っ た恩 師 岡 山大 学 大学 院 医 歯学 総 合 研 究 科 消 化器 ・肝 臓 ・感 染 症 内科 学 教 室 辻 孝 夫教 授,水 野 元 夫 助教 授,ま た,病 原 細菌 学 教 室 小 熊 恵 二 教 授, 横 田憲 治 講 師,本 研 究 の実 施,検 討 に ご援 助 頂 い た教 室 員 の 方 々 に 深 謝 い た します. 文 献
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