九州大学学術情報リポジトリ

九州大学学術情報リポジトリ

Kyushu University Institutional Repository

効率的な肺ガン特異的ヒト型モノクローナルIgG抗体 の取得に関する研究

川原, 浩治

九州大学農学研究科食糧化学工学専攻

https://doi.org/10.11501/3075469

出版情報：Kyushu University, 1993, 博士（農学）, 課程博士 バージョン：

権利関係：

第5章 抗体非産 生融合パー ト ナー細胞の 樹立

第1節 緒言

ハイブリ ドー マの抗体産生は、 用いた融合パー ト ナー

細胞の元来の抗体産生に影響されている ことを第3章で 述べた。 マ ウ ス ハイプリ ドー マの場合、 最もよく利用さ れる融合パー ト ナー細胞は、 ミ エ ロ ー マでありリ ン パ球

系の細胞である にもかかわらず、 抗体を構成するL鎖 (ペ ン ス ジ ョ ン ズタ ン パク)しか合成しない。 さらに、

L鎖さえ合成しない融合パー ト ナー細胞が樹立され、 マ ウ ス ハイブリ ドー マが幅広く利用されるひとつの要因に な っ ている6 )。 と こ ろが、 ヒ ト の融合パー ト ナー細胞株 の場合、 ミ エ ロ ー マ由来の融合 パー ト ナ ー細胞株は、

Abramsら48)やOlssonら2)によ っ て報告されてはいるが、

いずれも融合効率が低いため、 実用的に困難を伴 っ てい る。 従 っ て、 リ ン パ芽球様細胞株が、 比較的高い融合効 率を示すためよく用いられる。 しかしながら、 これらは

もともと抗体分子を合成する能力をも っ ているため、 得 られるハイブリ ドー マの抗体産生は、 融合 ノマー ト ナ ー細

胞の影響を受けてしまう。

そ こ で、 著者は抗体合成とは関係の無い ヒ ト T細胞株

を融合パー トナ ー細胞株として樹立する こ とを試みた 。

現在のと こ ろ、 T細胞由来の ヒ ト型ハイブリ ドー マは、

リ ン フ ォ カイ ン やT細胞機能の研究のために、 作製され

ている4 _{9 )、 5 0} )。 しかし、 T細胞とB細胞を融合させて、

抗体産生ハイブリ ドー マを作製したという報告はないo

T細胞由来であれば、 リ ン パ芽球のもつ融合効率の高さ

とハイブリ ドー マの抗体産生に影響を与える要因をもた

ない、 理想的な融合パー トナ ーになりうると考えられる

からである。

- 65 -

第2節 融合 パー ト ナー細胞の樹立

第1項 ヒ ト白血病細胞株M0 1 t 4の培養とク ロ ー ニ ン グ

用いた細胞株は、 ヒ ト白血病由来の T細胞株M0 1 t 4で ある5 1 )。 この細胞を通常1 0完FBS-ERDF培地で継代培養し

たo 著者は、 第3章で融合パー ト ナー細胞株として良好 な融合効率を得るには、 ク ロ ニ ン グ効率の高い細胞を

選択するこ とが重要であるこ とを明らかにしてい る。 そ

こ で、 M 0 1 t 4細胞を限界希釈法に よるク ロ ー ニ ン グを行

い 、 増殖速度が最も速いク ロ ー ンを選択した。 つづいて

ハイブリ ドー マ作製時の選択培地 HATに感受性をもたせ

るため、 6 ー チ オ グ ア ニ ン5 0μ g/mlを含む1 0%FBS-RP

MI1640培地で培養しHGPRT欠損株を選択した。 再びク ロ

ー ニ ン グを行い、 増殖速度の速か っ た6 ク ロ ー ンを選択 した。 それらは、 いずれもク ロ ー ニ ン グ効率6 0%以上を

与え、 倍加時聞は22時間前後であ っ た。

そ こ で、 これらのク ロ ー ンを細胞融合に供して、 それ

ぞれの融合効率を検討す る こ とにしたo

第2項 細胞融合

細胞融合は、 ポリ エ チ レ ン グ リ コ ール(PEG)4000 _(ベ ーリ ンガー) を用いて、 第2章第4節に示した方法に従 っ たo Molt4細胞をク ロ ー ニ ン グして得られた6種の融 合パー ト ナ ー細胞はそれぞれ1x 1 0 7 細胞用意して、 肺ガ

ン患者由来のリ ン パ節リ ン パ球1x 1 0 7 細胞と 融合した。

融合後、 9 6穴培養プレ ー トに 1枚ずつまきこんで、 選択 培地中で培養した。 2週間後、 ハイブリ ドー マの存在す るウ ェ ルの数を計測した。 まきこんだ穴に対するハイブ リドー マの増殖しているウ ェ ルの割合を、 融合効率とし

てTa b 1 e 5 - 1に示した。

用いた6種のク ロ ー ンの融合効率は、 19.8%から3 2 . 3 %の範囲でばらついていた。 これらの中で、 ク ロ ー ン A

4が最も高い融合効率を示したo 検鏡に よる観察では、

A 4株以外の5種のク ロ ー ンが、 1つずつの細胞が分散

し増殖しているのに対して、 A 4株はぶどうの房状のク ラ ン プを形成しなが ら 増殖していた。 したが っ て、 得ら れたハイブリ ドー マも、 このク ラ ンプを形成しやすく、

継代培養の際に懸濁を十分に行わ ないと、 ク ラ ンプの

- 67 -

o、

co

Table 5圃1

Fusion efficiencies of various clones derived from human leukemic cell line， Molt4

No.of No.of Fusion

Clone Seeded wells Hybridomas Efficiencies(%)

A3 96 20 20.8

A4 96 31 32.3

C10 96 29 30.2

D _{3 90 22 24.4}

D6 _{96 19 19.8}

F9 96 21 21.9

中央部に位置する細胞が死滅する可能性もあ った。 しか しながら、 それらのハイブリドー マの増殖速度は非常に

速く、 従来の B細胞由来のハイブリドー マのそれと、 匹

敵する ほ どで あ っ た。

そこで、 _A 4株を再ク ロ ー ニ ン グし、 増殖速度の最も

速か ったク ロ ー ン をA4 H ¹ 2細胞と名付けた。 さらに、 こ

のA4 H ¹ 2細胞とリ ン パ球とを融合して、 選択培地中で増 殖してくる細胞がハイブリドー マであるか否かに ついて

確認するため、 フ ロ ー サイト メ ト リーを用いたDNA含量

分析を行 った52)0 Fig.5-1に示すように、 融合細胞は、

A ⁴ H ¹ 2細胞の細胞周期G 2 (染色体数4 n ) の位置に、

G 1期が認められ、 明らかにDNA含量が2倍に な ってい ることが分か った。 従 って、 著者は、 このA4 H ¹ 2細胞を 新しい融合パート ナ ー細胞として、 以後の研究に用い る

ことにしTこ。

第3項 A 4 H ¹ 2細胞由来のハイブリドー マの産生する抗体 ク ラ ス

A ⁴ H ¹ 2細胞と肺ガ ン 患者のリ ン パ節リ ン パ球を融合し、

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Gl S G2jM

将棋 ^�

Parent cell

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S

GZ/M- Hybddoma

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肱位協

のい ω35ロロロ ωυ

Fluorescence intensities

Fig.5・1

Comparison of the DNA contents between A4H12， a parent cell， and hybridoma derived from that cell

Cells were stained by propidium iodide and were measured with flow cytometer.

得られたハイブリ ドー マの培養上清中に存在する抗体ク

ラ ス をELISA法に より検討した。 Table 5-2に融合パー ト

ナー細胞株として、 通常用いてい るHK-128、 HO-323細胞

の場合と比較した結果を示した。 A4 H 1 2細胞を用いた場 合、 I g Mのみを産生するハイプリ ドー マが全体の半分を

しめるもののIgGのみを産生する株も得られた。 また、

1 g GとIgMの両方を産生するハイブリド ー マ が全体の1 0 Z存在していた。 一方、 HK-128細胞を用いた場合 には、

全体の90%以上がIg Gを産生しており、 HO-323細胞を用い

た場合には全体の90%以上がIgMを産生していたo これら

の結果から、 A 4 H 1 2細胞を融合パー ト ナ ー細胞として用 い ることで、 I g M 、 Ig G両方のク ラ ス の抗体を取得可能で

あることが示唆された。 とこ ろで、 I g GとIgMの両方を産

生してい る株に関して、 HK-128細胞由来のハイブリドー

マはIgMが、 HO- 323細胞由来のハイブリ ドー マはIg Gが産

生されなくなるこ とを第3章で述べたo と こ ろが、 A4

H ¹ 2細胞由来のハイブリ ドー マは、 非常 に安定して両方 の抗体が産生され続けた。 このことは、 ハイプリ ドー マ

の抗体産生機構が、 I g MとIg Gで異な っ ていることを示唆 してい た。

1i 円，f

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Table 5・2

Classes of Igs secreted by hybridoIllas derived from A4H12. HK-128 and HO-323 cells

Parent cells

A4H12 HK-128 HO-323

Percent of hybridomas secreting Ig

IgG IgM

15 51

90 。

。 90

IgG+ IgM N one

10 24

10 0

2 8

第3節 肺ガ ン特異的モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体 の取得

新たに樹立した融合パー ト ナ ー細胞株 A4 H ¹ 2と、 肺カ寸 ン患者由来のリ ンパ節リ ンパ球とを融合してハイブリ ド ー マを作製した。 得られたハイブリ ド ー マのうち、 2 F

1 0ク ロ ー ンの産生するモ ノ ク ロ ー ナ ル抗体( ₁ g _M )が 肺ガ、

ン細胞株A5 ₄ 9とよく反応した。 そ こ で、 こ の抗体の種々 の ヒ ト ガ ン細胞株および正 常細胞株に対する反応 性を

E L 1 S A法を用い て検 討した。

Fig.5-2に示すように、 肺ガン、 乳ガ ンによく反応し たが、 胃ガ ンにも若干反応性を示した。 しかし、 大腸ガ ン や正常繊維芽細胞にはほとんど反応しなか っ た。 した が っ て、 さらに こ の抗体が体内に存在してい るガ ン細胞 とも反応を示すか否かを検討するため、 肺腺ガン患者由 来の組織を用い て2 F ₁ 0抗体の免疫組織染色を行 っ た。 染 色法は第8章第4節に示した通り である53)0 Fig.5-3 に組織染色写真を示した。 2 F ₁ 0抗体は組織のガン細胞部

分にのみ結合しており、 正常細胞の集合である結合組織 には反応しなか っ た。 従 っ て、 2 F ₁ 0抗体は、 特異的にガ

ン絢胞と反応してい ると思われた。

円ぺυつl

1.0

ぱ30 ぱ3

0

1.0 PC-9

4

^0.5

司

^0.5

ば30

O�

0.1 0.3 1.0

Antibody conc. (μg/ml)

。

0.1 0.3 1.0

Antibody conc. (μg/ml) 1.0

�MKN・28

〈ば 0司3

0.5

。 。

0.1 0.3 1.0 0.1 0.3 1.0

Antibody conc. (μg/ml) Antibody conc. (μg/ml)

1.0 I

WI-38

1.0 I

司

^0.5

司

^0.5

。 。

0.1 0.3 1.0 0.1 0.3 1.0

Antibody conc. (μg/ml) Antibody conc. (μg/ml)

Fig.5・2

Reactivities of monoclonal antibody 2FIO against various human cancer cell lines and a normal human fibroblast

2F 1 0 (0---0) and h uman serum IgMゆ一・1) adjusted to 1lJ.g/ml IgM concentration were diluted sequentia11y and reacted wi仕1various cell 1ines (Lung cancer， A549， PC-9; Breast cancer， MCF-7; Stomach cancer，品位三N-28; Colon cancer，

COL0201; NOIτnal fibroblast，羽司-38)

(A)

(B)

Fig.5-3

lmmunohistochemical st必ning of human lung adeno carcinoma wi仕1 2FIO monoclonal antibody

(A): Posi位ve stain泊g泊仕le irnmunoperoxidase reaction wi仕1 2FIO monoclonal anむbody. (B): Reacむon of control an位body wi仕1仕le same tissue. Nuclei were stained by hemato勾rlin.

E.U 可I

第4節 考察

リ‘ン パ球由来の抗体をハイブリドー マで修飾されずに

得るには、 融合パー トナー細胞自身が抗体を産生しない

ことが重要であると考えられた。 融合効率のすぐれた B

リ ン パ芽球様細胞株でも、 抗体を分泌しない株の報告は

ある2 2 _{)、 3} 2 )。 しかしながら、 ハイブリドー マを作製し

た場合、 リ ン パ球が産生していたと 思われる抗体以外の

抗体分子が分泌されてしまう。 この抗体分子は、 融合 ノマ

ー トナー細胞由来であると思われた。 従 っ て、 リ ン パ球

系の細胞で、 抗体産生しない T細胞株を利用することに

した。 樹立した融合ノマー トナー細胞株A4 H ¹ 2は、 これを

用いて作製されるハイブリドー マの産生抗体ク ラ スが、

従来までの融合ノマー トナー細胞由来の株のそれとは全く

異な っ ており、 I g G産生株もIgM産生株も取得可能であ っ

た。 このことは、 種々 の抗原特異抗体産生ハイブリドー

マの取得に、 A 4 H ¹ 2細胞が有効であることを示唆してい

たo 現在のとこ ろ、 T細胞株を用いたモ ノ ク ロ ーナル抗

体産生に関する報告はなく、 本研究はモ ノ ク ロ ーナル抗

体作製に新たな概念を提案したと考えている。

第5節 小括

ヒ ト型ハイブリ ドー マ作製のための融合パー ト ナー細

胞A⁴ H ¹ 2を ヒ ト T細胞株から新しく樹立した。 この株を

用い て、 細胞融合を行 っ たとこ ろ、 1 g G型およびIgM型の

抗体をそれぞれ産生するハイプリ ドー マが得られ、 それ

らの抗体産生は、 継代培養しでも従来の融合パー ト ナー 細胞由来のハイブリ ドー マより比較的安定していた。 ま

た、 融合効率も従来の株に匹敵するほど高か っ た。 肺ガ

ン患者由来のリ ンパ球と A⁴ H ¹ 2細胞を融合して得られた

\ イプリ ドー マの中から、 肺ガ ン細胞株A 549に反応する

IgM 型のモ ノ ク ロ ー ナ ル抗体産生ク ロ ー ンを取得した。

この抗体は、 肺ガ ン以外iこも乳ガ ン、 胃ガ ンに反応する

が、 大腸ガ ン や正常細胞にはほとんど反応しなか っ た。

さらに、 肺ガ ン組織を用いて反応性を検討したとこ ろ、

ガン細胞部分にのみ結合し、 正常細胞には反応を示さな

い ことが分か っ た。

- 77 -

第6章 ヒ ト リ ンパ球の体外免疫法の確立

第1節 緒言

モ ノ ク ロ ー ナル抗体は、 種々 の疾病の診断 ・ 治療薬と して用い ることが理論的に可能であるため、 幅広く研究 されてきた。 特に マウ ス を用い る場合、 目的の抗原を マ ウ ス の体内に直接投与して免疫するため、 抗原特異的な モ ノ ク ロ ーナル抗体を高効率で取得可能である。 しかし ながら、 この マウ ス モ ノ ク ロ ーナル抗体を人体内に投与 することは、 人体にと っ て異物であるため抗原抗体反応 を引き起こし、 致命的な副作用を生じる原因となる 54)。

一方、 ヒ ト型モ ノ ク ロ ーナル抗体は、 元々 ヒ ト由来であ るため、 こうした副作用は生じない。 従 っ て、 種々の ヒ

ト型抗原特異抗体を効率よく取得可能な方法の確立が、

重要な課題であ っ た。

従来、 種々 の疾病に対する抗原特異的な ヒ ト型モ ノ ク ロ ー ナル抗体を取得する場合、 それぞれの患者由来のリ ン パ球と ヒ ト融合パー トナー細胞とを融合しなければな らなか っ た。 すなわち、 ガン特異抗体を取得するには、

がン患者由来のリ ン パ球を確保する必要が生じていた。

しかしながら、 種々 のガ ン患者からハ イ ブリ ドー マを作

製するのに十分なリ ン パ球数を取得することは困難であ る。 さらに、 ガ ン患者であるからとい っ て必ずしも免疫

感作を受けているとは限らない、 という問題点も存在す る。 一方、 ガ ンのような危険な抗原を健常人の体内に投 与して免 疫することは、 倫理 ・ 道徳上不可能であ る。

これらの問題を解決するひとつの方法として、 ガ ン細 胞に対する体外免疫法がある。 もし、 健常人のリ ン パ球 を体外で目的とするガ ン細胞に対して免疫することが可 能であるなら、 細胞融合に供するリ ン パ球を確保できる ばかりでなく、 免疫感作を受けた リ ン パ球が必ず存在す ることになり、 ガ ン特異的ヒ ト型モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体を 容易に取得可能となる。

そ こで本章では、 種々 の免疫賦括剤を用いて、 健常人 のリ ン パ球を ヒ トガ ン細胞株に対して体外で免疫するこ とを試みた。

nuJU 円，t

第2節 細胞の調製と培養

健常人から末梢血をへパリ ン入り真空採血管に採集し た。 1 5 m 1遠心管にリ ンパ球分離液55) (LSM: オ ルガノ ン

テク ニ カ) 4 m 1をあらかじめ入れておき、 この上に血液 5 _m 1を重層した。 この時、 LSMと血液の境界面を乱さない ょう注意して行 っ た。 つづいて、 400 gで30分間遠心し、

LSM と血し ょ うの境界に位置するリ ンパ球の集団を ピ ペ ッ トで丁寧に回収した。 これを基本合成培地ERDFで懸濁 して、 遠心、 洗浄を3回繰り返した。 通常、 _10m 1の血液 から、 2 - 5 x 1 0 6細胞のリ ン パ球が取得可能であ っ た。 リ

ン パ節リ ンパ球の取得は、 第2章第2節第1 項と同じ方 法で取得した。 これらのリ ンパ球は、 実験に使用するま で、 10%FBS-ERDF培地で培養するか、 もしくは-₈ 0 ocで凍 結して保存した。 凍結した リ ン パ球は、 融解した後、

ERDF培地で3回洗浄して用いた。 抗原となるガ ン細胞株 は、 10完FBS-ERDF培地で継代培養して用 いた。

第3節 体外 免疫法の確立

第1項 リン パ球の前処理

生体内で生じ る免疫反応は、 大きく2 つに分かれる。

ひと つは細胞の食作用、 および細胞殺傷因子等に従 っ て

異物を除去する細胞性免疫であり、 も うひと つは抗原抗

体反応に よる異物を除去する体液性免疫である 5 ₆ )。 本

章の最終目的は特異抗体を取得する ごとに あるため、 <._ ^"?

の体液性免疫機構を利用し なければならない。 体液性免

疫に関与する細胞群は、 免疫反応が進行するため に働く

ヘルパーT細胞 ( h -T細胞) と免疫反応を 抑制するため に働くサプレ ッ サーT細胞( 8 - T細胞) である。 著者は、

体外免疫を効果的に行うため、 8-T細胞を選択的に取り

除きh-T細胞およびB細胞の集団を用いる ことにした。

Borrebaeckらは、 こうした 8-T細胞を中心とする 免疫抑

ー 市1]的に働く細胞がリ ソゾームに富ん でいる ことから、 L -

ロ イシル -L- ロ イシン メチルエステル(LeuLeu-Q Me)で細

胞を処理する ことで、 選択的に除去する ことが 可能であ

る ことを示し た 5 ₇ )、 5 ₈ )。

- 81 -

そ こで、 著者は体外免疫に使用するリ ン パ球を、 この 方法で処理することを試みた。 血清含有ERDF培地中で培 養しているリ ン パ球を、 ERDF培地で2度洗浄し、 1 x 106 細胞Imlの 細胞密度にERDFで懸濁したo つづい て、 終濃 度でO. 25m MになるようにLeuLeu-OMeを添加し て、 4 0分間

3 7 ocで培養したo これらの細胞を遠心して、 洗浄して体

外免疫に用いた。 Fig.6-1に、 この処理で得られる細胞 集団の フ ロ ーサイ ト メ ト リー解析を示した。 フ ィ コ エ リ ス リ ン(^P E )標識抗ヒ トh-T細胞抗体と フ ルオ レ セイ ン イ ソ チ オ シ ア ネー ト(FITC)標識抗ヒ ト s-T細胞 抗体を用い て、 処理前と処理後 のリ ン パ球を染色したとこ ろ、 処理 前はh-T、 s-T細胞の両方が存在しているのに対して、 処 理後はh-T細胞に変化はなく、 s-T細胞がほとんど存在し ていないこと がわか っ た。 したが っ て、 体外免疫に用い るリ ン パ球は、 すべてこの方法で処理したリ ン パ球を用 いfこ。

PE

FITC

(B)

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Fig.6・1

PEfω

Flow cytometric analysis of human lymphocytes treated with LeuLeu-OMe

Human lymphocytes before (A)むld after

(B)

the treatment with IJeuIJell-OMe were stained With PE labeled anti-human helper T cell antibody and FITC labeled anti-human suppressor T cell antibody.

- 83 -

第2項 体外免疫の検出法の開発

一般に免疫感作を受けた細胞の検出には、 羊赤血球

(S R B C) に抗原を結合させて抗原抗体反応と補体反応を用 いた プラーク形成法57)や、 培養上清中に 分泌される特 異抗体を検出する ELISA 法59 ) 6 0 )等がある。 しかしな が

ら、 いずれの方法も、 検出感度が低か ったり、 時間がか かるとい う難点を有していた。 そ ごで、 著者は ごの問題 を解決するため酵素抗体法(E I A )を用いて、 ガン細胞に

結合した特異抗体を直接認識する(Direct detection;

DD)DD-EIAを開発した。 Fig.6-2に、 この方法の原理を示 した。

まず、 抗原となるヒ ト肺ガン細胞株A549を2 4穴培養プ レ ートに まき ごんだ(a)。 翌日、 免疫するリン パ球と免 疫賦括剤を含む5完FBS-ERDF培地を添加して、 4日間培養

した(b )。 この培養期間に抗原感作 されたリン パ球は、

特異抗体を分泌し始める。 分泌抗体は、 感作リン パ球付 近に存在する ガ ン細胞と結合する(c)。 次に、 リン パ球 と培養培地を取り除き、 プレ ートに残 った ガ ン細胞を

ERDF培地で3回おだやかに洗浄し、 o ^. 0 5完グルタールアル

デヒ ド (シグマ社)含有リン酸緩衝生理食塩水(PB S )を添 加し て、 4 oc、 1 5分間細胞 を固定した(d)。 つづい て、 抗 体の非特異的反応を防ぐため、 o . 2完ゼラチ ン (バイオラ ツ ド社) -0 . 5先牛血清アルブミ ン (ベーリンガーマン ハイ ム社)を含むPBSで370C、 2時間ブロ ッ キン グした。 ガン

細胞に結合し ている特異抗体 を検出するため、 ビオチ ン 化抗ヒ トIgGもしくは1 g M (ブロ ッ キン グ液で500倍に希釈 したもの ; ベクタ一社)を添加し て、 3 7 oc、 1時間反応 させた。 さらにアビジ ン ービオチ ン化ペルオキシダーゼ複 合体(ABC) (ベクタ一社)を37 oc、 1時間反応させた( e )。

最後に、 酵素基質液 3，3' -diaminobenzidine tetra- hydrochloride (DAB) (同人化学) 1 0m g を2μ 1の30%H2

o 2を含むO.lM Tris-HC l緩衝液(pH7.2)lOm lに溶解したも の)を添加し て、 3 7 oCで20分間反応させた(f)。

Fig.6-3に示すように、 ガンに対する免疫が リン パ球 に生じると、 特異抗体が産生され、 リン パ球の周囲に存

在するガン細胞と結合し、 陽性クラスターを生じる(A )。

一方、 免疫が生じなか った場合に は、 陽性クラスターは 認められない( B )。 すなわち、 ごの陽性クラスター数を 計測すれば、 体外免疫の効果が判定可能となる。

- 85 -

(a) Preculture

Medium

(c)

IVI

(e)

EIA

Fig.6・2

(b) Coculture

@ @ @ @

(d) Fixation

{勾Detection

Substrate Color

Diagram of principle of direct detection with a EIA (DD-EIA) method

l:}:州I Cancer cell (Antigen)

。 Immunoactivator

や Avidi的

。L問h州e

y Specific antibody

� J

( A) (B )

Fig.6・3

Direct detection of specific antibodies produced by lymphocytes immunized with A549cells

using ^EIA

Antibodies secreted by sensitized lymphocytes bound to human lung cancer cell lK1e，A549，and posiUve clusters composed of several A549 cells s悩fied.お歩毛主A were detected with

DD-EIA

(A). No staining of A549 cells was observed without specific antibodies CB).

ワtnRU

第3項 種々 の免疫賦括斉IJの体外免疫に およぼす効果

体外免疫では、 免疫賦括斉IJとして、 o K -4 3 2 61) (2 5 0μ g / _m 1) (中外製薬)、 ムラミルペプチド(MDP ) ₆₂₎ (10μ g/

m 1) (カルビ オケ ム社)、 ヒ トイン ター ロイキ ン 2 (1 L-

2) 63) (100U/ml) (ゼン ザイム社)、 ヒ トイン ター ロイキ

ン 6 ( ^IL- 6 ) 6 4 ) (10U/ml) (ゼン ザイム社)、 ポークウ ィ

ドマイトージ ェ ン(P W M) (1完) (ギブ コ社)、 リポ多 糖(LPS) (25μ g/ml) (デ ィ フ コ社)を用いた。 ごれらは、

あらかじめ最も高い効果を示す濃度を検討し て用いた。

OK-432は、 溶連菌製剤の抗ガン剤で、 細胞性免疫に 主と

して作用すると されている。 MDPは アジ ュ パントペプチ

ドである。 体外免疫は、 これらの免疫賦括剤を含む5%

FBS-ERDF培地で、 4日間の培養で行われた。

A、口、

Tabl'e 6-1に示すように、 OK-432を単独で添加した場 無添加の コント ロールに比較して、 約5倍の活性を 示した。 OK-432と1 L -2を組み合わせて用いた場合、 コン

ト ロールの約15倍に免疫効率を増強した。 1 L - 6はOK-432 と組み合わせて用いても、 免疫効率に影響はなか っ た。

しかしながら、 1 L - 6が存在した場合は、 陽性クラ ス ター

が強く染色された ごとから、 1 L - 6は免疫感作 に直接かか わるのではなく、 感作した活性化リ ン パ球の抗体産生を 増強する働きをも っ てい る ごとが示唆された。 これらの 免疫効率の傾向は、 OK-432の代わり にMDPを用い ても同様

であ ったが、 OK-432よりさらに免疫 が増強された。

Table 6-2に、 1 L -2と1L - 6の免疫効果に つい て検討した

結果を示した。 1L -2は、 OK-432やMDPなしでも体外免疫 効果を示した。 1L - 6は、 1 L -2に比較し てほとんどその効 果をもたなか った。 また、 1 L - 2と1L - 6を組み合わせて用

いた場合、 陽性クラ スターの数は1L -2を単独で使用した 場合と同じ であるが、 その染色 は強く、 抗原感作した活 性化リ ン パ球の抗体産生を増強し てい た。 また、 OK- 432もしく はMDPと1L -2、 1L - 6を組み合わせて用い ると、

より顕著に免疫が増強される ごとがわか った。

一方、 ^Table 6-3に 示す ように、 PWMは、 ほとんど免疫

が生じる こと はなか った。 LPSは、 単独では若干の免疫 が生じ るも の の、 PWMと の 組合

せ

では、 むし ろ効果は減

少した。 さらに、 最も体外免疫効果の高か ったOK-432 やMDPと1L - 2、 1 L - 6の 組合せに、 PWMとLPSを添加した場

メ入口、 逆に体外免疫 の効果を間害する ごとがわか った。

- 89 -

以上の結果から、 免疫賦括剤とし て、 OK-432もしくは MDPと1 ^{L -}2、 1 ^{L -}6を用い る ことが適当であると考えた。

Table 6・1

Effects of OK-432. MDP. IL-2 and IL-6 on IVI

Lm

?

^Additive No. of Positive Clusterb ( mean :t

SEM )

OK-432 _MDP IL-2 IL-6

。

+

1士1

+ +

^5:t1

+ + +

15:t 2

+ + +

_8:t2

+ + + +

_{14:t 2}

+ +

_4:t0

+ + +

_{15:t 3}

+ + +

4:t1

+ + + +

26:t 5

aL.戸nphocytes separated from peripheral blood of a noロnal humむ1 doner were used.

b Data were means :t

SEM

of number of positive cluster from triplicate cultures.

4EムnuJV

Table 6・2

Effects of IL-2 and IL-6 on IVI

Additive No. of Positive Clustera (mean + SEM)

None

IL-6

。 9 + 5

2 + 1 9 + 4 14 + 3 22 + 5 IL-2

IL-2+IL-6

OK-432+IL-2+IL-6 MDP+IL-2+IL-6

aData were means + SEM of number of positive cluster from triplicate cultures.

Table 6・3

Effects of PWM and LPS on IVI

Additive ^a

No. of Positive Cluster PWM

LPS

_ìLOK-432+ MDP+ ^�-2�IL-6 Îi=--i+IL-6 ( mean:t

SEM )

。

+

_{1 :t} 0

+

7:t2

+ +

_{4:t 1}

+

_14:t ³

+

_{22:t 5}

+ + +

_5:tO

+ + +

6 :t 1

a Data were means :t

SEM

of number of positive cluster 企om triplicate cultures.

n《unuu

第4節 免疫感作リン パ球の産生する特異抗体のクラス

体外免疫で、 抗原感作を受けたリン パ球が産生する抗 体クラスをELISA法を用い て検討した。 Fig.6-4に結果を 示した。 OK-432もしくはMDPとIL -2、 I L -6を組み合わせ て用い た場合、 IgMとIgG両方のクラスの特異抗体を産生 する ことが分か った。 そし て、 それぞれのクラスの抗体 を産生するリン パ球は、 OK-432ではIgGがIgMの2倍程 度、 MDPでは 3倍程度多く存在するごとが分か った。

般に、 体内での免疫は、 抗原感作後4日間程度では、 血 中抗体価はIgMがIgGより高く検出される。 こ のごとから 体外免疫のひと つの利点とし て、 免疫反応を体内でのそ れより、 より円滑に生じさせるごとができるごとが示唆 された。

[Additive]

None

門 図

^IgM

IgG

OK-432+

IL-2+IL-6

MDP+

IL-2+IL-6

。 10 20 30

No. of Positive Cluster

Fig.6・4

Classes of speci白c antibodies produced by sensitized lymphocytes

Specific IgM and IgG antibodies were directly detected with anti­

human IgM or anti-human IgG as 2nd antibodies by DD-EIA.

τ'he results were shown as mean+SEM of number of positive cluster by仕iplicated experiments.

FhJv nHd

第5節 体外免疫に及ぼす リ ン パ球の個体差

著者が開発した 体外免疫法が、 種々 の提供者由来のリ ン パ球 でも可能か否かに ついて、 検討したo ^Table 6-4

lこ示すように、 OK-432もしくは MDPとIL -2、 IL-6を用い

てリ ン パ節リ ン パ球および末梢血リ ン パ球を免疫 したと

ころ、 いずれも免疫の成立が認められたo 全5例のうち 最も体外免疫の効率が高か った場合と低か った場合とで

は、 3倍程度の違いがあ ったo ^また、 リ ン パ節リ ン パ球

を用いた場合、 OK-432でもMDP でも同じ様な刺激効果を

有していた が、 末梢血リ ン パ球を用いた場合、 MDPの方

がOK-432よりも優れた 結果を示した。 以上の結果から、

体外免疫は、 免疫賦括剤として MDPとI L -2、 1 L -6を組み

合わせて使用する ことで、 最も効果的に生じる ことが分

か った。

CD -.J

Table 6・4

Effect of individual differences of lymphocytes on IVI

Origin of No. of Positive Cluster ( meむ1 ^{::t SEM}

)a

L戸nphocytes None _IL-2+IL-6 ^OK-432+ _IL-2+IL-6 ^MDP+

Ly立lph node b ^{l 。 30 ::t 4 26 ::t 3} 2 l::tO 14 ::t 2 24 ::t 2 Peripheral bloodC � ^{1 。 20 ::t 5 52 ::t 5}

2 。 14 ::t 5 26 ::t 9

3 。 9::t4 18 ::t 2

a

Data were meむlS ^{::t SEM} of number of positive cluster from 廿iplicate cultures.

bLymph nodes were obtained from breast cancer patients.

C Peripheral blood was derived from normal doners.

第6節 抗原となるガ ン細胞の違いが体外免疫に及ぼす 影響

こ こ まで、 抗原として、 ヒ ト肺ガ ン細胞株A 5 ⁴ 9を用い

て体外免疫を行 っ てきたが、 種々 のガ ン細胞に対して、

こ の方 法 が適用可能 か否かに ついて検討し た。 T^{a b 1 e}

6 -5に示すように 、 A 5 ⁴ 9細胞と由来の同じ肺腺ガ ン細胞

株PC-9では、 A 5 ⁴ 9の半分程度の免疫が生じた。 また、 由

来の異なる肺ガ ン細胞株で扇平上皮ガ ンQ G - 5 6、 小細胞

ガ ンQG-90'こも体外免疫が生じた。 一方、 胃ガ ン細胞株、

乳ガ ン細胞株では、 免疫が生じる細胞と生じない細胞が

存在して いた。 以上の結果から、 体外免疫法は、 種々 の

ガ ン細胞に対して使用可能である こ とが分か っ たo ただ

し、 使用するガ ン細胞が、 体外免疫に有効であるか否か

に ついて、 DD-EIA法を用いた検討を行 っ て確認すべきで

あると思われる。

Table 6-5

In vitro imrnunization of normal hurnan lymphocytes against various human cancer cell lines

Cell line No.of _a

positive cluster

Lung cancer

Adenocarcinoma

A549 20:t 4

PC-9 10 + 2

Squむnouscarcinoma

QG-56 41 + 15

Small cell carcinoma

QG-90 16士3

Stmach cancer

MKN-28 43土30

MKN-45 。

Breast cancer

MCF-7 11 ^:t 3

HBC5 。

a Data were means土SEM of number of positive cluster fromむiplicate cultures.

- 99 -

第7節 ヘルパー T細胞が体外 免疫に 及ぼす影響

体外免疫が、 どのような機構で作用してい るかを検討 するた め、 免疫前のリ ン パ球と免疫後のリ ン パ球集団に ついて、 フ ロ ーサイト メ トリーを用いたサ ブセ ッ ト解析 をした65 )。 解析のた めに、 異な る蛍光色素を標識した 抗体( F 1 T C標識抗ヒ トサ プレ ッ サー T細胞抗体とPE標識 抗ヒ ト ヘルパー T細胞抗体) を用いた。 Fig.6-5に結果 を示した。 LeuLeu-MeOで処理したリ ン パ球を体外免疫に 用いてい るが、 普通、 免疫直前のリ ン パ球集団のうち、

ヘルパー T (h-T)細胞の比率は、 全体の約20%であ っ た。

しかしながら、 体外免疫後 はh-T細胞の比率が全体の 30%以上にまで上昇していた。 一方で、 h-T細胞の比率 が低いと、 体外免疫の効率も低くなることがわか っ てい るo 従 っ て、 体外免疫の効率は、 h-T細胞の活性化に相

関してい ることが示唆された。

PE (A)

(20.80/0)

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PEI(B)

(33.10/0)

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FITC

Fig.6・5

Flow cytometric analysis of immunized l戸nphocytes in vitro

Humむ11戸nphocytes before (A)ぉ1d

a丘町(B)

irnmunization were stained with PE 1abeled anti-human he1per T cell antibody and F:πC 1abe1ed anti-human suppressor T cell antibody. Populaむon of helper _T cells increased from

200/0

^to

300/0

^over.

- 101 -

第8節 考察

多くの研究者が、 種々 の抗原を用いて マ ウ ス牌臓細胞 の体外免疫法に関する報告をしてきた66)。 しかしなが ら、 ヒ トのリ ン パ球を用いた場合は、 マ ウ スのリ ン パ球 を用いた場合に比較して、 その効率が低く、 有効な体外 免疫法は確立されていない。 この 原因のひと つとして、

体外免疫を鋭敏に、 短時間で検出する ス クリー ニ ン グ法 が確立できなか っ たことであろう。 一般に、 ガ ン細胞 を 抗原として用いたEL _{1 S} A法 では、 検出可能な抗体価が高 すぎたり、 プラー ク形成法では、 操作に時間がかか っ て

しまう。 そこ で、 著者は抗原として用いた ガ ン細胞に結 合した特異抗体を直接検出可能なDD-EIA法を開発した。

この方法は、 試算したところEL _{1 S} A法の1 0 0分のl程度の 特異抗体でも検出可能であ っ た。 さらに操作に要する時 間も、 4時間程度である。 このDD-EIA法が、 今回の体外 免疫法の 確立に大きく貢献した。

体外免疫に必要 な免疫賦括剤として、 o K -4 3 2、MDP、

1 L ^-2、IL-6を用いた。 OK-432は抗腫蕩活性をもち、 細胞

性免疫に作用するこ とが知られていたが、 液性免疫にも

効果があることが示唆された。 MDPは ア ジ ュ パン ト ペプ チ ドで、 抗原感作を促進する因子である。 したが っ て、

o K -4 3 2やMDPは、 IL-2やIL-6の存在下で、 免疫効率の上

昇に役立 っ たと思われる。 とこ ろで、 1 L - 2と1 L -6はリ ン パ球活性化因子であり、 それぞれの因子の作用は広く研 究されている。 しかしながら、 体外免疫に組み合わせて 用いた例は少ない。 S^{p 1 a w s k} iらは、 1 L - 6による B リ ン パ 球の分化は、 IL-2 の存在に依存していることを示して

いる6 ⁷ )。 このことから、 抗原感作、 抗体産生を誘導す

る一連の免疫反応を生じさせるには、 リ ン フ ォ カイ ンの 単独投与ではなく、 組み合わせて用いる必要があること を示唆していた。

体外免疫の研究において、 従来は抗原に可溶性タ ン パ ク質6 ⁸ )や微生物等6 ⁹ )が使用されてきた。 これらは、 抗 原性が高く、 免疫効率も良好である。 しかしながら、 ガ

ン細胞のように、 抗原性が低いと考えられている場合で も、 体外免疫が可能であることを明らかにした。 現在の とこ ろ、 ガ ン免疫の機構は、 まだ詳細には解明されてお らず、 本研究が発展することで、 この分野に新たな知見 を与えるものと思われる。

- 10 3 -

第9節 小括

健常人由来の ヒ ト リ ン パ球を、 ヒ ト ガ ン細胞株を抗原 として、 体外免疫する方法を確立した。 ヒ ト リ ン パ球を

ガン細胞株とともに、 種々 の免疫賦括剤を含む培地中で 4 日間培養した。 体外免疫は、 OK-432もしくはMDPと

IL-2 、 IL-6を組み合わせて用いた時、 効果的に生じた。

感作リ ン パ球の産 生する特異抗体ク ラ ス は、 1 g Gと1 g M

の両方を産生していたが、 その存在比はI g GがIgMの2倍

以上であ っ た。 また、 提供者の異なるリ ンパ球を体外免

疫に供したと こ ろ、 その効率の低い場合と高い場合で3

倍程度の差が認められたものの、 いずれも免疫が生じて

いた。 さらに、 種々 の ヒ トガ ン細胞株を抗原として免疫

したとこ ろ、 ほとんどの場合、 免疫が生じるけれども 、

そうでない場合も若干認められた。 また、 こ うした体外

免疫には、 ヘルパー T細胞の活性化が重要な役割を担 っ

ている こ とが示唆された。

第7章 体外免疫リ ン パ球を用いた肺ガ ン特異的モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗体産生ハ イ ブリ ドー マ の取得

第1節 緒言

肺カ。 ン特異的ヒ ト型モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体として、 _{1 9}

8 5年、 HB4C5抗体が我々 の研究室から報告された。 この 抗体は、 現在、 肺ガ ン の診断 ・ 治療に向けて、 R 1イ メー

ジ ン グ8 )や血清診断70 )、 7 1 )への応用研究が続けられて い る。 これら の抗体の特徴は、 いずれ もIgMク ラ ス に属

している こ とである。 これ は、 第2章、 第3章で述べて

きた。 著者 は、 抗体をより幅広く有効に用いるには、 さ

らに種々 の特異性をもち、 様々 なク ラ ス の抗体を豊富に

取得することが重要であると考えた。 そ こ で、 著者の確

立した体外免疫法を用いて、 肺ガ ンに対して抗原感作を

受けた リ ンパ球を融合パート ナー細胞と細胞融合させ、

肺ガ ン特異的ヒ ト型モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体を取得する こ と

にした。 体外免疫は、 確実に抗原感作を行うことが可能

であるため、 効率的にガ ン特異的なモ ノ ク ロ ー ナ ル抗体

を取得できると思われる。 さらに、 第6章第4節のデー

- 105 -

タから、 感作リ ン パ球の産生する抗 体ク ラ ス は、 1 g M"

IgGの両ク ラ スが検出されていた。 こ の こ とは、 体外免

疫した リ ン パ球を用いてハイブリ ドー マを作製すれば、

IgG、 IgM両ク ラ スの肺ガ ン特異的モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体が

取得可能に な る こ とを示唆してい る。

著者は、 健常人末梢血由来のリ ン パ球を ヒ ト肺腺ガ ン

細胞株A^{5 4} 9で体外免疫し、 得られたリ ン パ球を用いてハ

イブリ ド ー マの作製を試み た。

第2節 リ ンパ球の体外免疫

第1 項 リ ンパ球の調製

体外免疫に供するリ ンパ球は、 4人の健常人提供者の 末梢血から分離した。 簡単に述べると、 へパリ ン加真空 採血管(テ ルモ社) に1人につき50 m 1ずつ採血した。 そ れらを、 リ ンパ球分離液(L S M )に重層して、 400 gで3 0分 間遠心した。 LSMと血し ょ うの境界付近lこ層をなして分 離しているリ ンパ球を分取し、 基本合成培地ERDFで3回 洗浄した。 この時点、 で回収された リ ンパ球数は、 1 -3 x

107細胞であり、 生存率は95%以上であ っ た。 これらを、

ERDF培地で1x 106細胞Imlになるよう懸濁した。 さらに 、 分離した リ ンパ球の中から、 免疫抑制的に働くサ プレ ッ サー T (s-T)細胞を除去するため、 L- ロ イ シ ル ーLーロ イ シ ン メ チルエ ス テ ル(LeuLeu-OMe)を終濃度O.25mMになるよ うに懸濁液に添加して、 3 7 ocで40分間保温した。 体外免 疫に供した リ ンパ球は、 全てs-T細胞の存在しないリ ン バ球集団を用いた。

- 107 -

第2 項 体外免疫

第6章で検討した結果として、 最も効率よく体外免疫 を生じる 免疫賦括剤の組合せとして、 ム ラ ミ ルペプチ ド

( _M D P、 10μ g/ml :カ ル ビ オケ ム社) ヒ ト イ ン ター ロ イキ ン2 (IL-2， 100U/ml :ゼン ザイ ム社) 、 ヒ ト イ ン タ

ー ロ イキ ン6 (IL-6， 10U/ml :ゼン ザイ ム社) を用いた。

まず、 ヒ ト肺腺ガ ン細胞株A 5 4 9を1x 1 0 4細胞/mlの密度に

1 0完FBS-ERDF培地で調製し、 5 m 1の培養デ ィ ッ シ ュ にまき こ んで培養した。 翌日、 こ の培養上清を除去した後、

FBSを2 5 0μl添加して、 上記の免疫賦括部jをそれぞれ添 加した。 こ の添加順序は正確に守 っ た。 なぜならば、

1 L - 2やIL -6は、 培養器や ピ ペ ッ ト等に非特異的に結合し

たり、 温度によ っ て 分子の分解が生じる傾向があるため である。 つづい て、 ロ イ シ ン処理をしたリ ン パ球をER

DF培地で懸濁して、 最終的に1x 1 0 6細胞/mlになるように 調製し、 培養ガ ン細胞に添加した。 Fi g. 7 -1にガ ン細胞 とリ ン パ球の共存培養の様子を示した。 抗原で刺激され たリ ン パ球が、 活性化して増殖してい る状態が、 認めら れ る。 体外免疫のための培 養は、 4 日間行 っ た。

(A) (B)

Fig.7・1

Activation promes of human lymphocvtes cocultured with the human lung candr cell

line， A549

(A);

Normal human 1戸nphocytes treated with LeuLeu-OMe

mャ cocultured on出e sheet of lung cancer， A549. Culture medium consisted of 50/0 FBS-ERDF medium contain泊g MDP，IL-2and IL-6.Magnineauon xloo-(B);Control

��eriment was perfoロned by culturing lymphocytes without A549 cells. Magñifìcation x ì'OO.

- 109 -

第3節 細 胞 融合とハイブリ ド ー マ の スク リー ニ ン グ

体外免疫したリ ン パ球は、 ヒ ト融合パー ト ナ ー細胞株

A 4 H 1 2細胞と ポリ エ チ レ ン グ リ コ ー ル(^{P E} G )法に より、 融

合した。 体外免疫した リ ン パ球は、 よく懸濁して回収し

た。 細胞間相互作用に より活性化しているリ ン パ球は、

ガン細胞と強く結合しているため、 ピ ペ ッ テ イ ン グを十 分行い、 取り残しがない よう、 検鏡に より観察した。 細

胞融合法は、 第2章に記した方法と同じである。 融合し

た後、 得られるハイプリ ドー マの培養上清を、 ヒ ト肺ガ

ン細胞株A^{5 4} 9を抗原としたELISA法に より スク リー ニ ン

グした。 なお、 A5 4 9細胞 に反応する抗体が検出された培

養上清は、 その抗体ク ラ スを検討するため、 2次抗体iこ

抗ヒ トIgGと抗 ヒ ト1 g Mを用いたEL 1 S A法を行 っ た。

Table 7-1に、 融合結果を示した。 実験には 4人の提

供者由来のリ ン パ球を用い、 さらに、 その内3人は体外 免疫の コ ン ト ロ ールとして、 免疫していない リ ン パ球も

同時に融合した。 4回の融合で、 いずれも高率でハイブ

リドー マが取得されたo 特に 1例目では、 ¹ 00%の融合効 率であり、 体外免疫に よるリ ン パ球の損傷は認められな

か った。 また、 免疫して得られたハイブリ ドー マの内、

少なくとも1 ク ロ ー ン は、 抗原であるA 5 4 9細胞に反応す

る陽性株であ っ た。 一方、 コ ン ト ロ ールである免疫して

いない リ ン パ球を用いた場合は、 ハイブリ ドー マは得ら

れるものの、 陽性株は全く得られなか っ た。 さらに、 得

られた5株の陽性ハイブリドー マは、 1 g G産生株が2株、

IgM産生株が3株であ っ た。

以上の結果から、 体外免疫法は、 抗原特異的な ヒ ト型

モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体取得に有効である こ とが明らかとな

っ た。

- 111 -

Table 7・1

Human-human hybridomas generated by lymphocytes immunized in vitro

Exp. No.of N0.of No. of C Class of

Seeded wellsa Hybddomas b Positive Clones POSitiveMOAbsd

1. Control e 192 192

IVI 192 192

2. Control 96 96

lVI 96 68

3. Control 192 100

lVI 288 86

4.1VI 192 45

a Number of wells seeded after cell fusion.

b Number of wells containing hybridomas.

。

1 IgG

。

1 IgM

。

2 IgG，IgM

1 IgM

c Number of clones secreting monoclonal antibodies (MoAbs) reactive to A549 cells. Positive clones were defined by following formula.

A405 (MoAbs) - A405 (Control: Human serum IgG or IgM) ^> 0.3 d Class of MoAbs reactive to A549 cells.

e Normal human lymphocytes without IVI were fused with fusion P訂tner cells.

第4節 抗原であるA 549細胞に対する抗体 の反応性

体外免疫後、 細胞融合して得られた陽性ハイブリ ドー

マの反応性を、 抗原であるヒ ト肺ガ ン細胞株A 549を用い

て検討したo まず、 ハイブリ ドー マの培養上清中に存在 する抗体濃度を測定し、 全て1 μ g/mlになるよう調製し

た。 ガ ン細胞株A 5 4 9は9 6穴培養プレ ー トに コ ン フ ルエ ン トに なるまで培養し、 グルタールアルデヒ ドで固定した

もの を用いた。 抗体の非特異的反応を防ぐため、 このプ

レ ー トに ブ ロ ッ キ ン グ液( 0 . 2 %ゼラ チ ン ーO. 5 %牛血清ア

ル フ ミ ンを含む P B S )を添加した。 1 μ g/mlに調製し

た抗体を2分のlずつ段階希釈した ものを 検体とし、 コ

ン ト ロ ールとして、 同濃度に調製したヒ ト血清1 g Gもし

くはIgMを 用いた。 これら検体を反応させた後、 2次抗

体として、 ペルオ 牛 シ ダー ゼ標識抗ヒ ト1 g G もしくは

IgMを反応させ、 基質液( A B T S液)を添加して、 発色さ

せた。

Fig.7-2に これらの結果を示した。 IgG型のモ ノ ク ロ ー

ナル抗体BD 9、 BE 2は、 ともにA 5 4 9細胞に対して抗体濃度

に依存した反応性を示したが、 BD9は BE 2と比較して、 よ

一113 -