「叫

-得した モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体は、 種々 のガ ン抗原を認識す る こ とが明らかに な っ た。

Formalin flxed

paraffm embedded tissue

Xylene

M

i

^出ano向02

Ethanol Block江19

(1.50/0 Goa t serum)

Monoclonal a

i

^M(W凶)

2nd antibody

(Biotinylated anti-human IgG orIgM) Avidin-peroxidase conjugted

b7;「出叫

Substrate

(Diar立ninobenzidine t白et廿rahydrochloride;

Dナ「

釦制叩叩d刊向H202 s

Fig.8・4

Immunohistochemical staining of human lung cancer tissue with HB4C5 monoclonal antibodies HB4C5

MAb was sequentially diluted仕lree times from 1 }-lgj ml and reacted with human lung cancer tissue.

(A)，

Negative(-);

(B)，

False positive(+);

(C)，

Weakly positive (+);

(D)，

Positive (++);

(E)，

Strongly positive (+++).

円ぺun《U4lA

Table 8・2

Reactivities of monoclonal antibodies against various human lung cancer tissues

Monoclonal antibody

Tissue IgG IgM

BD9D12 BE2 AAIO AD2 AE6F4 AGIOFl BC8G12

Adenocarcinoma

1 ⁺⁺⁺ +

2 ⁺⁺⁺ + + +++ +

3 ^{++ + +} + ++

4 ⁺⁺ 土 + +

5 +++ + + ++ +

6 ^{+++ + + + + +}

Squamouscarcinoma

1 + +

2 ^{+ + + +}

3 ^{+ +} NT

Large cell carcinoma

1 ⁺

2 ⁺⁺⁺ +

Sma11 cell carcinoma

1 ⁺⁺ +

2

3 ⁺ ₊ NT

NT: not tested

Fig.8・5a

Immunohistochemical staining of lung cancer tissues with BD9D 12 antibody

BD9D 12

antibodyむld control antibody (Human se^n江n

IgG)

were reacted with adenocarcinoma ((A)，(B))， and squamous-carcinoma

((C)，(D)).

(A) and

(C)

were tests. (B) and

(D)

were control experiments，

- 135

-Fig.8・5b

Immunohistochemical st討凶ng of lung cancer tissues with BD9D 12 antibody

BD9D 12 antibody

and

control antibody

(Hurnan

se^n江n IgG) reacted with large cell carcinoma ((A)，(B))，むld small cell C紅白loma ((C)，(D)). (A) and (C) were tests. (B) and (D) were control expeIirnents，

� ζAコ --.:1

Table 8・3

Reactivities of monoclonal antibodies with human lung adenocarcinoma cell lines， A549 and Calu 3， transplanted in nude mice

Monoclonal antibody

Cell line

IgG IgM

BD9D12

BE2

AAIO AD2 AE6F4 AGIOFl BC8G12

A549

+++ + ++ + 土

Calu 3 +++ + + + 土

(A)

(B)

Fig.8・6

Immunohistochemical staining of cancer tissue uオ仕1 AE6F4 antibody

(A):

Cancer tissue was stained with AE6F4 antibody. τñis antibody reacted to cancer cell membranes.

(B): BD9D12

antibody reacted to cytoplasm of cancer cell.

第5節 肺ガ ン を認識する抗体の抗原の検 索

肺ガ ン に反応する抗体の中で、 特に反応性がよく、 特 異性が異なる と思われる BD9D12(IgG)、 AE6F4(IgM)、

AD2(IgM)の3種の抗体が認識する抗原を、 ウ エ スタ ン ブ ロ ッ テ イ ン グ法を用いて検索した80)0 Fig.8一?に、 こ の 方法に ついて フ ロ ー チ ャ ー ト に示した。 ヒ トガ ン組織 (0.8g)もしくはヒ ト肺ガ ン細胞株 (1x108 細胞) を1

m 1のプ ロ テ アーゼ阻害剤(1 m M フ ェ ニル メ チ ル スルホ ニ ル フ ルオ ラ イ ド) と界面活性剤(1 % ノ ニデ ッ トP-40 ) を含むPBSに懸濁した。 つづいて、 2分間、 ₄ ocで細胞 を超音波破砕し、 遠心上清を取得した。 さらに、 こ の上 清を0.22μ mの フ ィ ルターで処理し、 ポリ アクリル ア ミ

ドゲル電気泳動法に供したれ〉。 電気泳動の際、 分子量 マ ー カータ ン パクも 同時に用いた。 つづいて、 電気泳動 で分離したタ ン パクをO. 4μ mのニ ト ロ セル ロ ー ス膜 に転

写した B 2 )。 タ ン パクの転写された膜は、 0.05%Tween 2 0を含むPBS中で洗浄し、 抗体を反応させた。 抗原iこ結

合した抗体を検出するため、 2次抗体として ペルオキ シ ダー ゼ標識抗ヒ トIg G (タ ゴ社〉 もしくは ビ オ チ ン化抗

139

-ヒ ト1 g _M (ベク タ 一社) を反応さ せた。 ビ オ チ ン化抗体

は、 さらに ア ビ ジ ン ー ペルオ キ シダー ゼ標識ビ オ チ ン複

合体と反応させた。 発色は4 - ク ロ ロ ー 1 - ナ フ ト ー ル

(メ ルク社) を用いた。

Fig.8-8に示すように、 BD9D12抗体は、 5 0 K D付近の抗

原を認識していた。 また、 AE6F4、 AD 2両抗体は、 4 0 K D

付近の抗原を認識していた。 しかしながら、 ヒ ト組織抽

出成分の場合、 BD9D12、 AE 6 F 4抗体は、 それぞれ5 0、

4 0KDの抗原を認識してい るが、 AD2抗体は、 5 0 K D付近の

抗原を認識していた。 従 っ て、 ガ ン細胞株とガ ン組織で

異な っ た分子量の抗原を認識しており、 このことは、 細

胞レ ベルでの抗原性の変化が生じてい ることを、 示唆し

ていた。

Cancer cell

Homogenize (Sonication)

SDS-polyacrylamide electrophoresis

Western blotting

(Nitrocellulose membrane)

Blo

r

^ng

乱1onoclonal antibody (1μg/ml)

2nd antibody

(biotinylatedむ1ti-human IgG or IgM)

Avidin-peroxidase co吋ugated biotin complex (ABC)

Substrate

(4-chloro-1-naphtol and H202 solution)

Fig.8・7

Procedure of detection of cancer antigens recognized by monoclonal antibodies

141

-(A)

^{1 2 3 4 5}

J

50K--' 40K--.

1 2 3 4 5

(B)

50K--' 40Kー+

Fig.8・8

Detection of cancer antigens with human lung cancer cell line， A549， and lung cancer tissue recognized by monoclonal antibodies

(A; Antigens from A549 cells were detected by BD9D12，

AE6F4 and AD2 antibodies. (B); Antigens from cancer tissue were detected by the same antibodies.

Lane 1， human serum IgG; lane 2， BD9D12 antibody;

lane 3， human serum IgM; lane 4， AE6F4 antibody;

第6節 考察

ガン特異抗体の ス クリー ニ ン グは、 迅速か っ鋭敏な検 出法として、 従来か ら、 E_{L 1 S} A法が多用されてきた 76)。

このE_{L 1 S} A法で用いる抗原は、 ガン細胞株である。 細胞

株は単一な細胞集団で、 かつ増殖可能であるため、 多く の検体を一度に検定するには大きな利点となる。 しか し ながら、 継代可能なガン細胞株は、 もともと体内に存在 するガン細胞と抗原性や細胞機能の点で、 同じ性質を有 しているとは限らない。 従 っ て、 E L 1 S A法単独では、 的 確な ス クリー ニ ン グになりえなし\ 0 そ こで、 著者はガン の診断 ・ 治療に必要な抗体の性質として、 ガン細胞株へ の反応性以外に、 生きているガン細胞との反応性、 ガン 組織との特異的反応性に注目して、 抗体の ス クリー ニ ン

グを行 っ た。

著者の取得した抗体は、 これまで述べてきた ス クリー

ニ ン グの結果、 肺ガン細胞株、 肺ガン組織に反応し、 さ らに、 乳ガン細胞株にも交文反応していた。 一方、 最近

の知見で、 乳ガン組織にも交叉反応する こ とが明らかに な っ た。 腫蕩免疫の観点から、 ガン抗原は正常細胞には

- 143

-なくガ ン細胞のみに発現される抗原とい う定義の他に 、 正常細胞にもガ ン細胞にも存在し、 ただその発現量が異 な っ ているものや、 正常細胞に発現している分子が修飾 を受けて、 ガ ン細胞に認められる抗原となる等の説があ げられている ï ⁵ )。 このことと、 今回の交叉反応の事実 を考え合わせると、 広い意味でガ ン細胞全般にガ ン共通 抗原が存在しており、 得られた モ ノ ク ロ ーナ ル抗体が、

そうした共通抗原に関わ っ ていることを示唆しているの ではなかろうか。 この点で、 今後の研究の成果が期待さ れる。

第7節 小括

肺ガン細胞株A 5 49'こ反応したモ ノ ク ロ ー ナ ル抗体のよ り詳細な ス ク リー ニ ン グを行 っ た。 ELISA法を用いた種 々 の ヒ ト由来細胞株に対する反応性の検討では、 臓器特 異性なく、 あらゆるガン細胞に反応性を示す抗体や、 肺

ガンのみに強い反応性を示す抗体が検出された。 また、

生細胞状態のガン細胞に対する反応性では、 取得抗体の 内、 AE6F4o抗体のみが陽性であ っ た。 さらに、 ヒ ト肺ガ ン由来の組織に対する反応性では、 ほとんどの抗体が腺 ガンに重点的に反応を示すものの、 扇平上皮ガンや大細 胞ガン、 小細胞ガンに交文反応する抗体も検出された。

一方、 ガン細胞株には反応を示したにもかかわらず、 ガ ン組織には反応し ない抗体も検出 された。 また、 AE 6 F 4 抗体は、 ガン細胞の膜部分に反応しており、 その他の抗 体は、 細胞質部分 と反応した。 これら反応性の異なる抗 体で、 BD9D12 、 AE6F4o 、 AD2抗体に関して、 A 5 4 9細胞と ヒ

ト肺ガン組織を用いて、 抗原の検索を行 っ た。 A 5 4 9細胞 を用いた場合、 BD9D12抗体は、 約5 0 K Dの分子を、 AE6F4、

AD2抗体は、 4 0 K Dの分子を認識していた が、 ガン組織の

145

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