図１６１６．各マイクロファイバーマイクロファイバーマイクロファイバーチューブ

(1)

図１６１６．各マイクロファイバーマイクロファイバーチューブマイクロファイバー

41

チューブ（内径３ｍｍ）（内径３ｍｍ）（内径３ｍｍ）の外観と電子顕微鏡像の外観と電子顕微鏡像の外観と電子顕微鏡像

(2)

図１７．移植３カ月後に露出させた各．移植３カ月後に露出させた各．移植３カ月後に露出させた各

42

．移植３カ月後に露出させた各マイクロファイバーマイクロファイバーマイクロファイバーチューブチューブ

(3)

図１８．健常な脛骨神経および各チューブ移植部の近遠間の活動電位．健常な脛骨神経および各チューブ移植部の近遠間の活動電位．健常な脛骨神経および各チューブ移植部の近遠間の活動電位

43

．健常な脛骨神経および各チューブ移植部の近遠間の活動電位

．健常な脛骨神経および各チューブ移植部の近遠間の活動電位．健常な脛骨神経および各チューブ移植部の近遠間の活動電位

．健常な脛骨神経および各チューブ移植部の近遠間の活動電位

(4)

表４４．各チューブを移植して３カ月後の移植部活動電位のピーク時間と強度．各チューブを移植して３カ月後の移植部活動電位のピーク時間と強度．各チューブを移植して３カ月後の移植部活動電位のピーク時間と強度

44

．各チューブを移植して３カ月後の移植部活動電位のピーク時間と強度

．各チューブを移植して３カ月後の移植部活動電位のピーク時間と強度．各チューブを移植して３カ月後の移植部活動電位のピーク時間と強度

．各チューブを移植して３カ月後の移植部活動電位のピーク時間と強度

(5)

図１９１９．新たに設計した人工細胞外マトリクス．新たに設計した人工細胞外マトリクス．新たに設計した人工細胞外マトリクス

45

．新たに設計した人工細胞外マトリクス

．新たに設計した人工細胞外マトリクス骨格構造（骨格構造（VP）のアミノ酸配列のアミノ酸配列のアミノ酸配列

(6)

図２０

から回収したプラスミドの２０．pUC57(VP)

から回収したプラスミドの pUC57(VP)で形質転換したから回収したプラスミドの

[p: 未切断プラスミドで形質転換したから回収したプラスミドのNdeI/XhoI

未切断プラスミド

46

で形質転換したDH５α

NdeI/XhoI消化後のアガロースゲル電気泳動

未切断プラスミド, d: NdeI/XhoI

αコンピテントセル（コロニー消化後のアガロースゲル電気泳動 , d: NdeI/XhoI消化後

コンピテントセル（コロニー消化後のアガロースゲル電気泳動

消化後]

コンピテントセル（コロニー1~5 消化後のアガロースゲル電気泳動

1~5）消化後のアガロースゲル電気泳動

(7)

[太字斜体部分が図太字斜体部分が

図２１．pUC57(VP) 太字斜体部分が (VPGIG)

47

pUC57(VP)

(VPGIG)60をコードした pUC57(VP)の塩基配列

をコードしたの塩基配列

をコードしたDNA配列配列]

(8)

図２２

から回収したプラスミドの２２. pET57

から回収したプラスミドの

ET57(VP)で形質転換した

から回収したプラスミドの

[p: 未切断プラスミドで形質転換した

から回収したプラスミドのNdeI/XhoI 未切断プラスミド

48

で形質転換したRosettaコンピテントセル（コロニー

未切断プラスミド, d: NdeI/XhoI

コンピテントセル（コロニー消化後のアガロースゲル電気泳動 , d: NdeI/XhoI消化後

コンピテントセル（コロニー消化後のアガロースゲル電気泳動

消化後]

コンピテントセル（コロニー1~5 消化後のアガロースゲル電気泳動

1~5）消化後のアガロースゲル電気泳動

(9)

[太字斜体部分が図太字斜体部分が

図２３．pET19b 太字斜体部分が (VPGIG)

49

ET19b(VP)

(VPGIG)60をコードした VP)の塩基配列

をコードしたの塩基配列

をコードしたDNA配列配列]

(10)

図２４２４．pET57ET57(VP)で形質転換した

導後、砕菌したライセートので形質転換した

導後、砕菌したライセートの [赤丸は(VPGIG

50

で形質転換したRosetta 導後、砕菌したライセートの

(VPGIG)60を示す。

Rosettaコンピテントセルを用いて発現誘

導後、砕菌したライセートのSDS-PAGE を示す。]

コンピテントセルを用いて発現誘 PAGE

コンピテントセルを用いて発現誘コンピテントセルを用いて発現誘

(11)

図２５

２５．(A)

(B) ラミニン由来（VPGIG) ラミニン由来

VPGIG)60のアミノ酸配列と生理活性配列を導入できる部位

ラミニン由来IKAVA配列をコードした

51

のアミノ酸配列と生理活性配列を導入できる部位配列をコードした

のアミノ酸配列と生理活性配列を導入できる部位配列をコードしたDNA

のアミノ酸配列と生理活性配列を導入できる部位 DNAの塩基とアミノ酸配列のアミノ酸配列と生理活性配列を導入できる部位

の塩基とアミノ酸配列のアミノ酸配列と生理活性配列を導入できる部位

の塩基とアミノ酸配列

(12)

図２２６．pET19b(VPGIG)pET19b(VPGIG)pET19b(VPGIG)60のNdeI

52

NdeIおよびおよびXhoI制限酵素切断サイトの確認制限酵素切断サイトの確認制限酵素切断サイトの確認制限酵素切断サイトの確認

(13)

図２７２７．IKVAV

（アニーリングの有無を比較）

IKVAVをコードしたインサート

53

をコードしたインサート

をコードしたインサートDNA

DNAの二重鎖形成

の二重鎖形成

(14)

図２８ Rosetta

図２８．pET19b Rosetta^TM(DE3)

ミドの

ET19b(IK-VP)

(DE3)ｐLysSコンピテントセルミドのNdeI/XhoI

[左: 未切断プラスミド VP)で形質転換した

コンピテントセル

未切断プラスミド

54

で形質転換したDH コンピテントセル（コロニー

消化後のアガロースゲル電気泳動未切断プラスミド, d: NdeI/XhoI

DH５αコンピテントセル

（コロニー1~5

消化後のアガロースゲル電気泳動 , d: NdeI/XhoI

コンピテントセル

1~5）から回収したプラス消化後のアガロースゲル電気泳動

, d: NdeI/XhoI消化後]

コンピテントセルおよび

）から回収したプラス消化後のアガロースゲル電気泳動

および

）から回収したプラス

(15)

図２９２９．発現誘導後の発現誘導後のppET19b(IK 株破菌溶液の

55

IK-VP)で形質転換した

株破菌溶液のSDS

で形質転換した SDS-PAGE

で形質転換したRosetta^TM^TM(DE3)ｐLysSLysS

(16)

[吸着後に２０，５０，２５０および５００ｍ図

吸着後に２０，５０，２５０および５００ｍ図３０．生合成した

各精製段階における吸着後に２０，５０，２５０および５００ｍ

生合成したIK

各精製段階における吸着後に２０，５０，２５０および５００ｍ

溶出させた溶離液

56

IK-VPのHis 各精製段階におけるSDS 吸着後に２０，５０，２５０および５００ｍ

溶出させた溶離液

Hisキレートカラムでの SDS-PAGE

吸着後に２０，５０，２５０および５００ｍMのイミダゾールを含む緩衝液で溶出させた溶離液]

キレートカラムでの PAGE

のイミダゾールを含む緩衝液でキレートカラムでの

のイミダゾールを含む緩衝液でのイミダゾールを含む緩衝液で

(17)

図３１. 円板型ターゲットを用いた電界紡糸装置円板型ターゲットを用いた電界紡糸装置

57

円板型ターゲットを用いた電界紡糸装置円板型ターゲットを用いた電界紡糸装置円板型ターゲットを用いた電界紡糸装置

(18)

図

図３２．円板型ターゲットへ電界紡糸したポリ円板型ターゲットへ電界紡糸したポリ円板型ターゲットへ電界紡糸したポリ [走査型電子顕微鏡による観察

58

円板型ターゲットへ電界紡糸したポリ走査型電子顕微鏡による観察

円板型ターゲットへ電界紡糸したポリL-乳酸ファイバーの形態走査型電子顕微鏡による観察]

乳酸ファイバーの形態 ]

乳酸ファイバーの形態乳酸ファイバーの形態

(19)

図３３３３．ポリL

ドラム型および円板型ターゲットの比較

L-乳酸マイクロファイバーの配向化条件の検討ドラム型および円板型ターゲットの比較

59

乳酸マイクロファイバーの配向化条件の検討ドラム型および円板型ターゲットの比較

乳酸マイクロファイバーの配向化条件の検討

(20)

図３４３４．配向性ポリ．配向性ポリL-

（

-乳酸マイクロファイバーを内層にもつチューブの試作

（A）チューブ作製に用いた装置

（B）試作したチューブ

60

乳酸マイクロファイバーを内層にもつチューブの試作

）チューブ作製に用いた装置

）試作したチューブ

乳酸マイクロファイバーを内層にもつチューブの試作乳酸マイクロファイバーを内層にもつチューブの試作

(21)

図図３５．ＶＰおよびＩＫ−ＶＰのみでなるマイクロファイバーの電解紡糸．ＶＰおよびＩＫ−ＶＰのみでなるマイクロファイバーの電解紡糸．ＶＰおよびＩＫ−ＶＰのみでなるマイクロファイバーの電解紡糸

61

．ＶＰおよびＩＫ−ＶＰのみでなるマイクロファイバーの電解紡糸

．ＶＰおよびＩＫ−ＶＰのみでなるマイクロファイバーの電解紡糸．ＶＰおよびＩＫ−ＶＰのみでなるマイクロファイバーの電解紡糸

．ＶＰおよびＩＫ−ＶＰのみでなるマイクロファイバーの電解紡糸

(22)

図

図３６．ＶＰおよびＩＫ−ＶＰマイクロファイバーのＰＢＳ中３時間浸漬時の形態変化

．ＶＰおよびＩＫ−ＶＰマイクロファイバーのＰＢＳ中３時間浸漬時の形態変化

62

．ＶＰおよびＩＫ−ＶＰマイクロファイバーのＰＢＳ中３時間浸漬時の形態変化

．ＶＰおよびＩＫ−ＶＰマイクロファイバーの

(23)

図３７．ＶＰおよびＩＫ−ＶＰマイクロファイバーの安定性に対する．ＶＰおよびＩＫ−ＶＰマイクロファイバーの安定性に対する．ＶＰおよびＩＫ−ＶＰマイクロファイバーの安定性に対するアニーリングの効果の検証

63

．ＶＰおよびＩＫ−ＶＰマイクロファイバーの安定性に対するアニーリングの効果の検証

．ＶＰおよびＩＫ−ＶＰマイクロファイバーの安定性に対する

(24)

図３８８．ＶＰとポリＬ−乳酸混合マイクロファイバーの作製と．ＶＰとポリＬ−乳酸混合マイクロファイバーの作製と配向化条件の検討

64

．ＶＰとポリＬ−乳酸混合マイクロファイバーの作製と配向化条件の検討

．ＶＰとポリＬ−乳酸混合マイクロファイバーの作製と

(25)

図３９．ＩＫ−ＶＰとポリＬ−乳酸混合マイクロファイバーの作製と．ＩＫ−ＶＰとポリＬ−乳酸混合マイクロファイバーの作製と．ＩＫ−ＶＰとポリＬ−乳酸混合マイクロファイバーの作製と配向化条件の検討

65

．ＩＫ−ＶＰとポリＬ−乳酸混合マイクロファイバーの作製と配向化条件の検討

．ＩＫ−ＶＰとポリＬ−乳酸混合マイクロファイバーの作製と

(26)

図４０４０．ＶＰもしくはＩＫ−ＶＰとポリＬ−乳酸との混合マイクロファイバー．ＶＰもしくはＩＫ−ＶＰとポリＬ−乳酸との混合マイクロファイバー．ＶＰもしくはＩＫ−ＶＰとポリＬ−乳酸との混合マイクロファイバーのＰＢＳ中での安定性評価

66

．ＶＰもしくはＩＫ−ＶＰとポリＬ−乳酸との混合マイクロファイバーのＰＢＳ中での安定性評価

．ＶＰもしくはＩＫ−ＶＰとポリＬ−乳酸との混合マイクロファイバー

(27)

図４１

合マイクロファイバーとそのＣｅｌｌ

４１．ポリＬ−乳酸および、ＶＰもしくはＩＫ−ＶＰとポリＬ−乳酸との混合マイクロファイバーとそのＣｅｌｌ

．ポリＬ−乳酸および、ＶＰもしくはＩＫ−ＶＰとポリＬ−乳酸との混合マイクロファイバーとそのＣｅｌｌ

（Ｉｎｖｉｔｒｏ

67

．ポリＬ−乳酸および、ＶＰもしくはＩＫ−ＶＰとポリＬ−乳酸との混合マイクロファイバーとそのＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅ

ｖｉｔｒｏ

．ポリＬ−乳酸および、ＶＰもしくはＩＫ−ＶＰとポリＬ−乳酸との混Ｃｕｌｔｕｒｅ

ｖｉｔｒｏ実験用）

．ポリＬ−乳酸および、ＶＰもしくはＩＫ−ＶＰとポリＬ−乳酸との混ＣｕｌｔｕｒｅＳｌｉｄｅへの固定

．ポリＬ−乳酸および、ＶＰもしくはＩＫ−ＶＰとポリＬ−乳酸との混Ｓｌｉｄｅへの固定

(28)

図４２

合マイクロファイバー上でのラットＤＲＧニューロンの軸索伸長性挙動４２．ポリＬ−乳酸および、ＶＰもしくはＩＫ−ＶＰとポリＬ−乳酸との混

合マイクロファイバー上でのラットＤＲＧニューロンの軸索伸長性挙動

（赤

．ポリＬ−乳酸および、ＶＰもしくはＩＫ−ＶＰとポリＬ−乳酸との混合マイクロファイバー上でのラットＤＲＧニューロンの軸索伸長性挙動

（赤; Ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ、青；ＤＡＰＩ）

Ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ、青；ＤＡＰＩ）

68

(29)

図４３．ポリＬ−乳酸および、ＶＰもしくはＩＫ−ＶＰとポリＬ−乳酸との混合マイクロファイバー上でのラットＤＲＧニューロンの軸索伸長性挙動図４３．ポリＬ−乳酸および、ＶＰもしくはＩＫ−ＶＰとポリＬ−乳酸との混

合マイクロファイバー上でのラットＤＲＧニューロンの軸索伸長性挙動図４３．ポリＬ−乳酸および、ＶＰもしくはＩＫ−ＶＰとポリＬ−乳酸との混

（走査型電子顕微鏡による観察）

図４３．ポリＬ−乳酸および、ＶＰもしくはＩＫ−ＶＰとポリＬ−乳酸との混合マイクロファイバー上でのラットＤＲＧニューロンの軸索伸長性挙動

69

図４３．ポリＬ−乳酸および、ＶＰもしくはＩＫ−ＶＰとポリＬ−乳酸との混合マイクロファイバー上でのラットＤＲＧニューロンの軸索伸長性挙動図４３．ポリＬ−乳酸および、ＶＰもしくはＩＫ−ＶＰとポリＬ−乳酸との混