香港の冬季におけるヒトメタニューモウイルス(hMPV)の流行
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(2) 36. 山田. Table 1. Base sequences for RT-PCR (5'-->3' ) 1. hMPV (a) screening The primer sets for screening ;nucleocapsid(N)gene RT-PCR (amplicon size: 347bp) MPV1 GAGTCTCAGTACACAATAAAAAG MPV2 ATTGTTTTCCTTGCTTCTTT 2nd round PCR(amplicon size: 233bp) MPV3 TCATTGCAACAAGAAATAAC MPV4 ATGTCTAACATCTGTAAATCTTC (b) conformation The primer sets for conformation ;fusion(F)gene RT-PCR (amplicon size: 141bp) mpvF1 AGCTGTTCCATTGGCAGCA mpvF2 ATGCTGTTCRCCYTCAACTTT 2nd round PCR(amplicon size: 98bp) mpvF3 GAGTAGGGATCATCAAGCA mpvF4 GCTTAGCTGRTATACAGTGTT 2. RSV The primer sets for screening ;nucleocapsid(N)gene RT-PCR (amplicon size: 838bp) RSVAB F GTCTTACAGCCGTGATTAGG RSVAB R GGGCTTTCTTTGGTTACTTC 2nd round PCR RSV type A (amplicon size: 334bp) RSVAF GATGTTACGGTGGGGAGTCT-3' RSVAR GTACACTGTAGTTAATCACA-3' RSV type B (amplicon size: 183bp) RSVBF AATGCTAAGATGGGGAGTTC RAVBR GAAATTGAGTTAATGACAGC'. 明 、Lap-Yee. Lam,. John. S.. Tam. 細 胞 変 性 効 果 あ る い は ニ ワ ト リ赤 血 球 の 凝 集 が 観 察 さ れ た 場 合 、 培 養 上 清 を 採 取 し抗 血 清 に よ り 、A型,. B型. の 同 定 を行 った。 ②RSVとhMPVの. 検 出. RSVとhMPVは 索 はPCRに. 、 それ ぞ れの ウイル ス遺伝 子 の検. よ り お こ な っ た 。 ま ず 、 鼻 咽 頭 吸 引 液(NPA). の200μ4をHigh. Pure. Viral. Aの 抽 出 を 行 い 、 こ のRNA抽 Rを 用 い てRSV,. hMPVに. を 用 い てOne-step 得 た 。RSV, cDNAの. PCRを. RT-PC. 行 い産物 を. 物 と し た 。2nd. 、50℃,1分. サ イ ク ル 行 い72℃,10分 物 と し た 。2nd. PCR産. 物 を1.5%ア. PCRは. 、94℃,3 のPCRを40. 後 こ れ を2nd. P. ガ ロ ー ス で電 気. 泳 動 の 後 に エ チ ジ ウ ム ・ブ ロ マ イ ド(EtBr)で 外 線 照 射 し て 増 幅DNAの. 、. のelongation. 、72QC,1分. のelongationの. で. 、50℃,1分. イ ク ル行 い72C,10分. PCR産. 分 に 続 き94℃,1分. nested. に 続 き94℃,1分. のPCRを40サ. の 後 こ れ を1st. CR産. 出 の 次 にOne-step. い ず れ の ウ イ ル ス も50℃,30分. 合 成 、94℃,3分. 72℃,1分. kit(Roche)でRN. それ ぞれ の特 有 の プ ラ イ マ ー. RT-PCR、. hMPVの. RNA. 染色 、 紫. 確認 を お こな った。 その 際 に. 用 い た プ ラ イ マ ー は、 表1の と う り で あ る 。 逆 転 写 の プ ラ イ マ ー も ラ ン ダ ム プ ラ イ マ ー で は な く、RSV,. hMPV. に そ れ ぞ れ の特 有 の プ ラ イ マ ーを 用 い た。 hMPV、 geneを. RSVの. い ず れ に お い て も、 nuc!eocapsid(N). 標 的 にcDNAの. hMPVに. 合 成 、 DNAの. お い て は、 N. にFusiOn. geneが. protein(F)・. 増 幅 を行 っ た。. 検 出 さ れ た場 合 は、 さ ら. 一 一 を標 的 に した プ ラ イ マ ー を. 用 い て 確 認 を行 った。. の詳 細 は、 ま だ不 明 な 点 が 多 い。 この た めRT-PCR法 に よ りhMPVの 遺 伝 子 を検 出 す る こ とに よ り冬 季 にお け るhMPVの 流 行 状 況 を調 べ るた め. 皿.結. に以 下 の 分 析 を行 っ た。 ま た、 同 時 にRT-PCRに. 1.検. 同 時期 のRSVの. 調 査 も行 い 、 hMPVの. よ って. 流 行 との比較検. 討 を お こな った。. H.材. 体 調 査 を お こな った1209の 検 体 につ いて そ の月 別 の検. 体 数 は、 図2に 示 した よ う に4月 に は採 取検 体 も減 少 し て い る。 これ は呼 吸器 症 状 の 患 者 が 減 る ため で あ る。 ま た 、 年 齢 別 の検 体 数 は、 図1に 示 した よ う に20歳 以 下 の. 料 と方 法. 〔 材 料 〕2000年 、2001年 の冬 季(1月. 果. 例 が 大 部 分 を 占 め た。 ∼4月)の. 間に香. 港 新 界 地 区 に あ るプ リ ンス ・オ ブ ・ウ ェー ル ズ 病 院 を 呼. 2.月. 別 の ウイ ル ス の検 出数. 吸器 症 状 で 受診 した 患 者 の うち本 人 ・保 護 者 よ り同意 を. i)月 別 のhMPV陽. 得 て採 取 され た合 計971人 よ りの 鼻 咽 頭 吸 引 液(NPA)の 1209検 体 を 用 い た。. 月 別 の 検 体 数 は 、 図3の. 〔 方法〕. 2001年3月. 性検体数 よ う に2000年3月. に37検 体 、. に26検 体 が 検 出 さ れ た が 、 他 の 月 で は10検 体. 以 下 に留 ま った。. ① イ ン フル エ ンザ ウイ ル ス の検 出. ii)月 別 のRsv陽 図4の. 性検 体数. よ う に2000年3月. に50検 体 、2001年3月. 鼻 咽 頭 吸 引 液(NPA)を0.45,u mの フ ィ ル タ ーで ろ過 し た後 、MDCK細 胞 に接 種 、 培 養 し、 そ の 細 胞 変 性 効 果. 体 、 他 の 月 で は10検 体 以 下 で あ り3月. を指 標 に ウイ ル ス の検 索 を お こ な った。. 出 さ れ た 。 こ れ は、nMpvに. 2代 継 代 し7. 日間培 養 の後 、 ニ ワ ト リ赤 血 球 の凝 集 を行 った。 凝集 が. て よ り 顕 著 で あ る。. 見 られ な い場 合 は、 検 出 陰 性 と判 定 した。. iii)月. に62検. に も っ と も 多 く検. 類 似 す るが、 そ の 傾 向 と し. 別 の イ ンフ ル エ ンザ ウイ ル ス 陽性 検 体 数.
(3) 香 港 の 冬 季 にお ける ヒ トメ タ ニ ュ ーモ ウイ ル ス(hMPV)の. 図5は. 、 イ ン フ ル エ ン ザ ウ イ ル スA型. を 月 別 に 示 し た も の で あ る。2001年 に1月. よ り3月. 、B型. で はA型. に 向 か っ て 増 加 し、4月. 37. 流行. の検 体数 、B型. と も. に 入 る と分 離 数. が 急 激 に減 少 す る。. もの で あ る。 10歳 以 下 で は 、hMPVは. 、 各 年 齢 に ば らっ きが す くな. く1歳. 以 下 が 、8%、2∼5歳. 6%と. 検 出 率 は 、6∼8%の. 1歳 以 下 の 検 出 率 は 、15%で. 3.年. て13%、5∼10歳. 齢 と ウイ ル スの 検 出 数. 図6は 年 齢 別 のhMPVとRSVの. Figl.. Fig3.. Fig5.. Total. Number for. No.. 検 出数 の%を. of. Samples. the. で も8%年. Fig2.. Fig4. period. study. period. で も. あ っ た の が 、2∼5歳. Fig6.. Number for. Percentage. Month. 齢 と と も に 減 少 して い く 傾 向. and. of samples RSV during. for. 、. に おい. が み られ た 。. Tested. of samples positive hMPV during the study. Number of samples positive for Influenza virus during. 示 した. に お い て7%、5∼10歳 範 囲 で あ る 。 一 方RSVは. hMPV. samples. tested. positive the study. and. RSV. period. in. each.
(4) 38. 山田. 明 、Lap-Yee. Lam,. John. S.. Tam. が お こ る こ とが判 明 して い る。 オ ー ス トラ リア、 カナ ダ で の生 後2ケ IV.考. 察. hMPVは. 月 か ら87歳 ま で を対 象 に した血 清 疫 学 的 調. 査 で は、 いず れ も高 いhMPVの 、2001年. オ ラ ンダ で発 見 さ れ た新 しい パ ラ ミ. 本 で の年 齢 別 のhMPV抗. 侵 淫 を しめ して い る。 日. 体 の 調 査 で は、 生 後6ケ. 月か ら. ク ソ ウ イ ル ス の1っ で 、 そ の 後 イ ギ リス 、 ア メ リカ、 オ ー. 1歳 未 満 で 最 も低 く、 加 齢 と と もに 増 加 し10歳 以 上 で は. ス ト ラ リ ア で も 検 出 の 報 告 が な さ れ た3)'9)'5)。 日 本 で の. す べ て 陽性 で あ った とい う海 老 原 らの報 告 が あ る9)。. 最 初 の 報 告 は 、2003年1月. 、 後 藤 ら に よ る6歳. 本 研 究 にお いて は、hMPVは. の イ ンフ. 年 齢 別 で は0歳 か ら10歳. ル エ ン ザ 様 疾 患 児 の 咽 頭 ぬ ぐ い 液 よ り の 検 出 で あ る6)。. ま で の検 体 に検 出 され、 そ れ よ り高 い年 齢 で は検 体数 が. 現 在 は 、 世 界 中 に 広 が っ て い る 普 遍 的 な(ubiquitous) 伝 子. 少 な い こ と も あ るが ほ とん ど検 出 さ れ な か っ た 。RSV で は135検 体(11.2%)に 遺 伝 子 が 検 出 さ れ た が 、1Q 以. の グ. 下 に多 い とい うhMPVと. ウイ ル ス と考 え られ て い る。. 最 近 、hMPVのF遺. 領 域 を 対 象 と し た 系 統 解 析 の 結 果 、hMPVは ル ー プA,Bに プ(Al,. 分 類 さ れ 、 そ れ ぞ れ が2っ. A2,. B1,. 、2つ. のサ ブ グル ー. B2)に 分 類 さ れ る こ と が 報 告 さ れ て い. して い く傾 向 が み られ たRSVは. る 。 し か し、 血 清 型 は1っ と さ れ て い る 。 臨床 症 状 との 関 係 で は、 イ ギ リス の イ ンフ ル エ ンザ 様 疾 患 の1.3%にhMPVが. 、 検 出 され て い る。 一 方 、 オ ラ. ン ダで は、 イ ン フル エ ンザ様 疾 患 、 他 の急 性 呼 吸器 感 染 と さ れ た 例 の3%にhMPVが. 検 出 され て い る。 イ ン フ ル. エ ン ザ 様 疾 患 よ り他 の 急 性 呼 吸 器 感 染 の 方 に 多 くhMPV が 検 出 され る傾 向 が あ る。. hMPVの. 発見が冬季 の呼吸. 器 症 状 で 入 院 中 の 小 児 よ り な さ れ た 経 緯 も あ り、RSV や イ ン フ ル エ ン ザ と 同 じ く冬 季 に 流 行 す る ウ イ ル ス と 考 え ら れ て い る 。Stocktonら7)に い た 調 査 で も 、12月 ∼2月 ア メ リカ の2冬. 類 似 の結 果 が 得 られ た。. 10歳 以 下 で はhMPVは 、 各 年 齢 に ば らっ きが少 な く検 出率 は、6∼8%程 度 で あ る。 一 方 年 齢 と と もに 減 少. よ る 英 国 で のPCRを. 、 完 全 な免 疫 が 成 立 せ. ず に一 生 の うち に何 度 も感 染 す る こ とが 知 られ て、 ま た 感 染 を重 ね るた び に症 状 も軽 くな る と さ れ て い る。 図6の 結 果 は、hMPVは 、RSV以 上 に再 感 染 が 起 こ っ て い る可 能 性 を示 唆 して い る もの と考 え られ た。 ま た、 骨 髄 移 植 を う けた患 者 が、hMPV感 染 に よ り死 亡 した例 も 報 告 され て い る1°)。 した が って 、 主 に小 児 を 中 心 に す す め られ て きたhMPV感 染 も今 後 、 成 人 に お け る感 染 の調 査 も必 要 とな る と考 え られ る。. 用. に 最 も よ く検 出 さ れ て い る 。. 季 に わ た る 調 査 で も、12月 ∼2月. さ れ て い る が 、 特 に 両 年 と も2月. に検 出. に ピ ー ク が あ っ た3)。. し か し、 こ れ ら の 多 く の 調 査 が 、 冬 季 に つ い て の み お こ. V.結. 語. 冬 季 の呼 吸 器 患 者 のNPAの ウイ ル ス遺伝 子 の検 索 に よ りhMPVは 、 RSウ イ ル ス と似 た 季 節 の 流 行 パ タ ー ン. ー. を示 す こ とが 示 唆 さ れ た。 ま た、 各 年 齢 か ら検 出 さ れ て い る こ とよ り、 小 児 期 に お け るhMPVの 再 感 染 の可 能 性. ク が あ る の か な ど は 、 ま だ 明 らか で な い 。 冬 季 に お け る. が 考 え られ た。 本 研 究 は、 亜 熱 帯 の 香 港 で の成 績 で あ る. 本 研 究 で も1209検. が 、 日本 で も同様 の調 査 に よ って 夏 季 もふ くめ たhMPV の 流 行 の実 態 が 明 らか に な る もの と思 わ れ る。. な わ れ て い るた め 、 こ の ウ イ ル ス が 、 周 年 に わ た っ て circulateし. て い る の か 、 冬 季 に(あ. 体 の う ち77検. 伝 子 が 検 出 さ れ た 。2000年 hMPVは. る い は 夏 期 に)ピ. 体(6.3%)にhMPVの. お よ び2001年. 、 調 査 した 冬 季 の う ち3月. 遺. いず れ の年 も. に 一 番 多 く検 出 さ れ. た 。 ま た 、 デ ー タ を 記 して い な い が 夏 期 に お い て も頻 度 は 少 な い も の のhMPVは. 、 検 出 さ れ て い る 。 し か し、 亜. 謝辞. 熱 帯 の香 港 で の 結 果 が 、 日本 に あ て は ま る と は か ぎ らな い の で、 今 後 の 検 討 が 必 要 で あ る。. 本 研 究 は、 香 港 中 文 大 学 の呼 吸器 感 染 研 究 グ ル ー プ の 研 究 の1っ と して な され た。. る た め8)、 臨 床 の 場 に お い て は 、 ま ず 簡 単 に で き る イ ン. 稿 を 終 え る に あ た り、 外 国 研 究 者 招 待 援 助 基 金 に よ り、 プ リ ンス ・オ ブ ・ウ ェ ー ル ズ病 院 にお いて 研 究 機 会 を与. ム ノ ク ロ マ ト法 を 用 い たRSV検. え て くだ さ い ま した香 港 中 文 大 学 に深 謝 い た します 。. hMPVとRSVは. 、 臨 床 症 状 、 流 行 期 間 が 類 似 して い 出 市 販 キ ッ トを 用 い てR. SV検 査 を 行 っ て い る 。 陰 性 の 場 合 、 hMPV感. 染 を疑 っ. て ウイ ル ス 遺 伝 子 検 索 を す す めて い る場 合 が 多 い。 しか し、 実 際 に は 重 複 感 染 し て い る 可 能 性 も あ りRSV陽 を も っ てhMPVの van hMPVの. den. 性. 可 能 性 を 除 外 で きな い 。. Hoogenら. は 、5歳. 以 後 の血 清 検 体 す べ て に. 抗 体 が 検 出 さ れ た と 報 告 して い る 。 発 見 の 経 緯. か ら 当 初 は 、 主 に 小 児 の 疾 患 と 考 え られ た が 、 そ の 直 後 の 調 査 で は 、RSVと. 同 じ く再 感 染 も あ り全 年 齢 で 感 染. 文献 1). Van den Hoogen BG, de Jong JC, Groen J, Kuiken T, de Groot R, Fouchier RA, Osterhaus AD. A newly discovered human pneumovirus isolated from young children with respiratory tract disease: Nat Med. Jun; 7(6) :719-724, 2001.
(5) 香 港 の 冬 季 にお け る ヒ トメ タニ ュー モ ウ イ ル ス(hMPV)の. 39. 流行. Njenga MK, Lwamba HM, Seal BS. Metapneumoviruses in birds and humans: Virus Res. Feb; 91(2) :163-169, 2003 3) Falsey AR, Erdman D, Anderson LJ,Walsh EE. Human metapneumovirus infections in young and elderly adults: J Infect Dis: Mar 1;187(5) :785-790, 2003 4) Boivin G, Abed Y, Pelletier G, Ruel L,Moisan D,Cote S Virological features and clinical manifestations associated with human metapneumovirus: a new paramyxovirus responsible for acute respir-. 7). atory infections in all age groups. J Infect Dis 186:1330-4,2002 5) Peret TCT, Boivin G,Li Y,Couillard M,Humphery. Jun ; 70 (2) : 281-283,2003 10) Pelletier G, Dery P, Abed Y.Boivin G. Respiratory tract reinfections by the new human Metapneumovirus in an immunocompromised child: Emerg. 2). C,Osterhause ADME, Erdman DD, Anderson LJ. Characterization of human metapneumoviruses isolated from patients in North America.J.Infect. Dis. ; 185:1660-1663, 2002 6)後. 藤 郁 男:病. 原 微 生 物 検 出 情 報,24(3):12-13,2003. Stockton J,Stephenson I,Fleming D,Zambon M. Human metapneumovirus as a cause of communityacquired respiratory illuness: Emerg Infect Dis. Sep;8(9) :897-901, 2002 8) Greensill J,McNamara PS,Dove W,Flanagen B, Smyth RL,Hart CA.Human metapneumovirus in severe respiratory syncytial virus bronchiolitis: Emerg Infect Dis. Mar;9(3) :372-375, 2003 9). Ebihara T, Endo R, Kikuta H, Ishiguro N. Yoshioka M.Ma X,Kobayashi K Seroprevalence of human metapneumovirus in Japan: J Med \Tirol.,. Infect Dis. Sep;8(9) :976-978, 2002.
(6) 40. 山田. 明 、Lap-YeeLam,JohnS.Tam. (Summary) Human metapneumovirus Hong Akira 1) School 2) Prince. Yamada1)'. of Human of. Wales. (hMPV) infections in. Kong 2),. Nursing Hospital. in winter. Lap-Yee. , The. Lam2). University. , Chinese. Background hMPV is one of paramyxoviridae newly discovered by van den Hoogen, Holland and is thought to be responsible for respiratory infections in winter. Since its discovery, this virus has been isolated all over the world, however the characteristics of this virus has not yet been sufficiently clarified. Object This study investigated the characterization of hMPV using samples collected in the winter season by the detection of hMPV gene with RTPCR. Comparative studies between hMPV and other respiratory virus (influenzavirus, RS virus) were also carried out. Materia Is and Methods Between January and April 2000 and again between January and April 2001, 1209 nasopharyngeal aspirates ( NPA ) samples were obtained from patients consulting the Prince of Wales Hospital, Hong Kong. After extracting viral RNA, RT-PCR and nested PCR was carried out using the primer for the nucleocapsid (N) gene. Then, amplicon was visualized by ethidium bromide staining following electrophoresis on agarose gels.. , John. of. University. Resu Its. S. Tame2). Shiga of. Prefecture Hong. Kong. However, few samples. were collected from. patients under 20 years old, from patients under 10 years old, the hMPV genome was equally detected in each age category (6-8%). In the case of RSV, the rate of detection decreased in proportion to age. The hMPV genome were detected in 77 of 1209 (6 —3%) samples in this study. In both 2000 and 2001, the number of hMPV genome-positive samples and the positivity rate were highest in March. Like hMPV, RSV ware also detected most frequently in March. Conclusion These findings show that hMPV is one of the pathogens responsible for respiratory illness in Hong Kong in the winter, along with RSV and infuluenza virus. These data also suggested that re-infection with hMPV occured much more frequently than that with RSV since the hMPV genome was detected equally in all age groups under 10 years old. Key Words human metapneumovirus ( hMPV) , respiratory infection, RS virus, influenza.
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