新技術説明会　様式例

(1)

バイオプロピレン生産を目指した

プロパノール発酵技術の開発

大阪府立大学大学院生命環境科学研究科

応用生命科学専攻

(2)

背景

糖

バイオマス

エタノール

ブタノール

燃焼

エネルギー使用

CO

₂

バイオプロセス

エタノール等のバイオ燃料

⇒ 燃焼により、すぐにCO

₂

が排出される

化石資源依存型社会から資源循環型社会へ

バイオ燃料

2

(3)

背景

ポリ乳酸等のバイオポリマー

⇒ 長期間のCO

₂

固定が可能となる

化石資源依存型社会から資源循環型社会へ

ポリ乳酸

CO

₂

固定

糖

バイオマス

乳酸

リサイクル

リユース

燃焼

エネルギー使用

CO

₂

バイオプロセス

ケミカルプロセス

バイオポリマー

3

(4)

バイオプロパノール発酵生産の目的

プロピレン

ポリプロピレン

CO

₂

固定

糖

バイオマス

プロパノール

リサイクル

リユース

燃焼

エネルギー使用

CO

₂

バイオプロセス

ケミカルプロセス

化石資源依存型社会から資源循環型社会へ

すでにポリマーとして普及しているポリプロピレンの生産

⇒

バイオマスからのプロパノール生産プロセスの開発

化石資源

約 5 kg-CO

₂

/kg

ナフサ分解法

約 2 kg-CO

₂

/kg

バイオプロピレン

年間生産量

50Mt-PP

4

(5)

既存の組換えE. coliを用いたプロパノール生産系

Acetoacetyl-CoA Acetoacetate Acetone Isopropanol Acetate Acetyl-CoA CO₂ Pyruvate 2 x Acetyl-CoA 2 x CO₂

Hanai, T. et al., Appl. Environ. Microbiol., 73:7814-8 (2007) Jojima, T. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 77:1219-24 (2008) Shen, CR. et al., Metab. Eng., 10:312-20 (2008)

Atsumi, S. et al., Appl. Environ. Microbiol., 74:7802-8 (2008)

Max 1.0 mol/mol glucose

ABE発酵菌の

イソプロパノール

生合成系を

E. coliに移植

CO₂

Glucose

Glycolysis

DHAP

GAP

Pyruvate 2 x

Propanol

5

(6)

従来技術とその問題点

ABE発酵菌のイソプロパノール生合成経路を移

植した組換え大腸菌を用いる方法があるが、

_{生合成経路中にCO}

₂

_{放出反応があり、}

大腸菌の生育等に必要なエネルギー等を

差し引くと、

グルコースからの対糖収率が最大でも

_0.6〜0.7

モル／モル

_{程度にとどまると考えられる。}

(7)

新規1-プロパノール発酵生産経路の概略

Max 2.0 mol/mol glucose

To TCA cycle

Reducing power ATP

Max 1.25 mol/mol glucose

1

×

_{Glucose + 0.375}

×

_O

₂

1.25

×

_{1-Propanol +1}

×

_H

₂

_{O + 2.25}

×

_CO

₂

_{+ 1.75}

×

_ATP

CO

₂

放出のない

新たなプロパノール

生合成系を設計

Glucose

NAD(P)H NAD(P)H Pi Glycolysis

DHAP

GAP

MG

LA

HA

1,2PD

PA

1-Propanol

NAD(P)H NAD(P)H NAD(P)H H₂O CoB₁₂

Glucose

Glycolysis

DHAP

GAP

1-Propanol

7

(8)

新技術の特徴・従来技術との比較

• すでに報告のあるイソプロパノール発酵技術

とは異なり、CO

₂

放出を伴わないプロパノール

生合成経路を設計。

• 対糖収率において、従来技術より1.5〜2倍の

向上が期待できる。

• バイオマス由来のポリプロピレンのCO

₂

排出

量は、化石資源由来のものの半分以下。

(9)

新規1-プロパノール発酵生産経路の概略

To TCA cycle Reducing power ATP

Max 1.25 mol/mol glucose

1

×

Glucose + 0.375

×

O

₂

1.25

×

_{1-Propanol +1}

×

_H

₂

_{O + 2.25}

×

_CO

₂

_{+ 1.75}

×

_ATP

CO

₂

放出のない

新たなプロパノール

生合成系を設計

Glucose

DHAP

GAP

MG

LA

HA

1,2PD

PA

1-Propanol

Glucose

Glycolysis

DHAP

GAP

1-Propanol

9

(10)

DHAP

(R)-1,2-PD

(S)-1,2-PD

(R)-LA

(S)-LA

HA

MG

Glucose

Sporobolomyces salmonicolor由来

Aldehyde reductase II

(arII)

Escherichia coli由来

Glycerol dehydrogenase

(gldA)

Escherichia coli由来

Methylglyoxal synthase

(mgsA)

グルコースから1,2-PDを生産する菌株の育種

10

(11)

pKKArMeGe

(5039 bp)

P

_tac

mgsA

arII

gldA

P

_tac

P

_tac

pKK

223-3

pKK

223-3

pKK

ArMeGe

Aerobic

Microaerobic

Produced

1,2-PD (mM)

N.D.

1.3 N.D.

20.6 Vector

Aeration

0 50 100 150 200 250 C onc ent rat ion (m M )

1,2-PD

Lactate

Formate

Acetate

EtOH

Succinate

pKK

ArMeGe

グルコースから1,2-PDを生産する菌株の育種

100 mM Glucose, 48 hr

Consumed glucose is 100 mM 11

(12)

HA

MG

DHAP

Glucose

グルコースから1,2-PDを生産する菌株の育種（まとめ）

1,2-PD

Escherichia coli由来

Methylglyoxal synthase

(mgsA)

Sporobolomyces salmonicolor由来

Aldehyde reductase II

(arII)

Escherichia coli由来

Glycerol dehydrogenase

(gldA)

1-Propanol

Glucoseから1,2-Propanediolを発酵生産する菌の育種を目的として、想定経路を構

築し、各反応を触媒する酵素遺伝子のスクリーニングによる選抜を行った。

これら酵素遺伝子を導入した組み換えE. coliをGlucose含有培地で微好気的に培

養することにより、100 mM (= 18.0 g/L)のGlucoseより20.6 mM (= 1.57

g/L)の1,2-Propanediolを培養液中に蓄積した。

12

(13)

新規1-プロパノール発酵生産経路の概略

To TCA cycle Reducing power ATP

Max 1.25 mol/mol glucose

1

×

Glucose + 0.375

×

O

₂

1.25

×

_{1-Propanol +1}

×

_H

₂

_{O + 2.25}

×

_CO

₂

_{+ 1.75}

×

_ATP

CO

₂

放出のない

新たなプロパノール

生合成系を設計

Glucose

DHAP

GAP

MG

LA

HA

1,2PD

PA

1-Propanol

Glucose

Glycolysis

DHAP

GAP

1-Propanol

13

(14)

1,2-PD

を

1-

プロパノールへ変換する菌の探索

1,2-PD

Glycerol

Propionaldehyde

3-Hydroxypropionaldehyde

1-Propanol

1,3-Propanediol

Glycerol dehydratase

1,3-Propanediol oxidoreductase

(15)

Conversion of 1,2-PD to 1-propanol using Shimwellia blattae ATCC33430

0 10 20 30 40 50 60 Glc Gly Glc+Gly C onc ent rat ion (m M )

Culture conditions

M9 minimum medium containing 5 g/L 10 g/L 50 mM Yeast extract CaCO₃ 1,2-PD Sugar : 100 mM (= 18 g/L) Glucose and/or 200 mM (≒ 18 g/L) Glycerol 37ºC, 48 hr 0 5 10 15 20 25 0 12 24 36 48 60 0 20 40 60 80 100 Gluc os e, Gly c erol (m g/ mL ) !-Propanol , 1, 2 -PD ( mM ) Time (h) 1,2PD Glycerol Glucose 1-Propanol

1-Propanol

1,2-PD

15

(16)

dhaK dhaN dhaM dhaL dhaD dhaR dhaH dhaG

dhaT dhaI dhaB dhaC dhaE

dhaF

GeneGene productGeneGene product

dhaKDihydroxyacetone kinasedhaGGlycerol dehydratase reactivation factor small subunit

dhaNPhosphoenolpyruvate-protein kinasedhaT1,3-Propanediol dehydrogenase

dhaMDihydroxyacetone kinasedhaIAdenosyl transferase large subunit

dhaLHypothetical proteindhaBGlycerol dehydratase large subunit

dhaDGlycerol dehydrogenasedhaCGlycerol dehydratase medium subunit

dhaRGlycerol metabolism operon regulatory proteindhaEGlycerol dehydratase small subunit

dhaHAdenosyl transferase small subunitdhaFGlycerol dehydratase reactivation factor large subunit

DhaBCE (apoenzyme)

1,2-PD

PA

DhaBCE (inactive) Inactivation

1-Propanol

DhaT ATP ADP X-Cbl Ado-H Cbl(I) AdoCbl ATP PPP_i Cobalamin reductase(s) DhaBCE (holoenzyme) NAD(P)H NAD(P)+ DhaFG DhaHI CoB₁₂

1,2-PDを1-プロパノールに変換する菌株の育種

Toraya, T., Cell. Mol. Life Sci., 57:106-27 (2000)

(17)

0 10 20 30 40 50 60

○ ×

×

1.3

○

○ ×

×

0.7

○ ×

1.0

○ ×

×

○

1.2

○

○ ×

0.3

○

1.2 dhaBCE

dhaFG

dhaHI

dhaT

OD

₆₆₀

Co

n

cent

ration

(m

M)

100 mM 50 mM 5 μg/mL 96 hr Glucose 1,2-PD CoB₁₂ 1-Propanol PA 1,2-PD C once nt rat ion (m M) pRSF_Eb DhaBCEF pCDF_Eb DhaITGH

○ ×

○

○ 100 mM Glucose, 70 mM 1,2-PD,

5 μg/mL CoB

₁₂

, 72 hr

1-Propanol 1,2-PD

1,2-PDを1-プロパノールに変換する菌株の育種

17

(18)

0 40 80 120 160 200 0 4 8 12 16 20 0 50 100 150

Time (h)

1 -Prop

an

o

l,

1 ,2

-PD

(m

M

)

Glu

co

se

(m

M)

1,2-PD

Glucose

1-Propanol

Plasmids CoB12 Concentration (mM) Consumed glucose 1,2-PD 1-Propanol pKKArMeGe ○ 126.1 19.4 N.D. pKKArMeGe pCDF_EbDhaITGH pRSF_EbDhaBCEF × 120.6 17.2 N.D. ○ 115.1 1.9 16.9

200 mM Glucose, 5 μg/mL CoB

₁₂

, 96 hr

培養時間

144 h

消費グルコース

132.6 mM (≑23.9 g/L)

1-プロパノール生成

19.9 mM

(≑1.2 g/L)

対グルコース変換率

0.15 mol/mol

(0.05 g/g)

組換えE. coliを用いた1-プロパノールの発酵生産

18

(19)

想定される用途

• バイオマスからのプロピレン・ポリプロピレン

生産

• バイオマス由来の燃料添加剤の発酵生産

• バイオマス由来の多目的溶媒の発酵生産

(20)

実用化に向けた課題

• グルコースから1-プロパノールの生産を確認。

しかし、1-プロパノールの収量・対糖収率が不

十分。

• 現在、1-プロパノール生合成経路の強化や副

産物への変換経路の削除を検討中。

• 1-プロパノールの発酵生産条件の最適化に

ついても検討中。

(21)

企業への期待

• バイオマスからのプロピレン生産を目指したプ

ロパノール発酵技術の共同開発。

• 発酵生産技術の開発経験を持つ企業との共

同研究を希望。

• 本技術によるバイオマス由来のプロパノール

のプロピレン製造以外への用途開発。

(22)

本技術に関する知的財産権

• 発明の名称：1-プロパノールの製造方法

• 出願番号：特願2007-298136

• 出願人

：協和発酵ケミカル他

(23)

産学連携の経歴

• 1991年-1999年第一ファインケミカル社と共同研究

☞ D-パントラクトンの酵素法による生産（1999年）

• 1995年-2000年カネカ社と共同研究

☞ キラルアルコールの酵素法的生産（2000年）

• 2007年-2011年文科省-JST ターゲットタンパクプ

ログラムに採択

• 2012年- JST-ALCAプロジェクトに採択

(24)

新技術説明会 様式例

バイオプロピレン生産を目指した

プロパノール発酵技術の開発

大阪府立大学 大学院 生命環境科学研究科

応用生命科学専攻

背景

糖

バイオマス

エタノール

ブタノール

燃焼

エネルギー使用

CO

バイオプロセス

エタノール等のバイオ燃料

⇒ 燃焼により、すぐにCO

2

が排出される

化石資源依存型社会から資源循環型社会へ

バイオ燃料

背景

ポリ乳酸等のバイオポリマー

⇒ 長期間のCO

2

固定が可能となる

化石資源依存型社会から資源循環型社会へ

ポリ乳酸

CO

固定

糖

バイオマス

乳酸

リサイクル

リユース

燃焼

エネルギー使用

CO

バイオプロセス

ケミカルプロセス

バイオポリマー

バイオプロパノール発酵生産の目的

プロピレン

ポリプロピレン

CO

固定

糖

バイオマス

プロパノール

リサイクル

リユース

燃焼

エネルギー使用

CO

バイオプロセス

ケミカルプロセス

化石資源依存型社会から資源循環型社会へ

すでにポリマーとして普及しているポリプロピレンの生産

⇒

バイオマスからのプロパノール生産プロセスの開発

化石資源

約 5 kg-CO

/kg

ナフサ分解法

約 2 kg-CO

/kg

バイオプロピレン

年間生産量

50Mt-PP

既存の組換えE. coliを用いたプロパノール生産系

Max 1.0 mol/mol glucose

ABE発酵菌の

イソプロパノール

生合成系を

E. coliに移植

Glucose

DHAP

GAP

Propanol

従来技術とその問題点

ABE発酵菌のイソプロパノール生合成経路を移

新技術説明会　様式例

大阪府立大学大学院生命環境科学研究科

₂

₂

_{生合成経路中にCO}

₂

_{放出反応があり、}

_0.6〜0.7

_{程度にとどまると考えられる。}

_{Glucose + 0.375}

_O

_{1-Propanol +1}

_H

_{O + 2.25}

_CO

_{+ 1.75}

_ATP

₂

₂

_{1-Propanol +1}

_H

_{O + 2.25}

_CO

_{+ 1.75}

_ATP