2014年5月に駿河湾で採集されたセンジュエビ類後期幼生のDNA分析による種判別

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報告

2014年5月に駿河湾で採集されたセンジュエビ類後期幼生の

DNA分析による種判別

Species identiﬁcation of Polychelid postlarvae collected in Suruga Bay

on May, 2014 by DNA analysis

柳本　卓

1

・小西光一

1

・髙見宗広

2

Takashi Yanagimoto, Kooichi Konishi, and Munehiro Takami

はじめにセンジュエビ科は，第_{1から4歩脚，種によって} は第_{5歩脚までその先端に鋏を持つことから，千手} 観音にちなんで「センジュエビ」という名前が付けられている．センジュエビ科は世界中の中～漸深層に分布し，_{6属40種以上存在している (Galil, 2000)．} 日本周辺には8種類が記録されている（山本・長澤， 2011）．センジュエビ科の複眼は退化し，角膜などの痕跡もない．センジュエビ類は中生代から新生代の初期にかけて浅海に生息していたエリオン科（Eryonidae）に似た形態を持っていることから，このグループから深海へと適応拡散した（蒲生，_1980）生きた化石として考えられている．そのため，センジュエビ科は甲殻類の系統進化を調べる上で重要であり，様々な先行研究が行われている（Schram & Dixon, 2004; Boisselier-Dubayle et al., 2010; Bracken-Grissom et al., 2014など）．一方，センジュエビ科は 関東以南の太平洋沿岸の深海域に広く分布しているが（馬場，1986），まとまった漁獲量がないので漁業価値がなく，調査研究はほとんど行われていない．しかし，近年，主要漁獲対象種のみばかりでなく，生態系管理という立場から，漁獲対処種以外についての正確な種判別と生態の把握が重要となってきている．センジュエビ科の幼生に関する情報はほとんどなく，地中海西部で採集された幼生について外部形態とDNA分析からセンジュエビ（Polycheles typhlops） の幼生であると報告され_{(Torres et al., 2014)，日本} 周辺では福島沖と駿河湾で採集されたセンジュエビ類の幼生についてDNA分析による種判別を行い，これらがセンジュエビ類のPentacheles laevisの幼生 であることが報告されている（柳本ら，2015）．本研究では，2014年5月に駿河湾で採集されたセンジュエビ類の幼生_{（Fig. 1）について，先行研究と同様に} DNA分析により種判別を行い，何種であるか検討した．材料と方法本研究で用いた後期幼生は東海大学海洋学部所属の実習船北斗によって_{2014年5月に駿河湾から口径} 1.6 mリングネット（目合い2 mm, 1 mm, 0.5 mm） (Takami & Fukui, 2010)）によって採集された．得られた標本は写真を撮影した後_{（Fig. 1），70％エタノー} ルで固定した．

幼生の腹節あるいは胸脚から筋肉片約10 mgを摘

1_{国立研究法人　水産研究・教育機構　中央水産研究所}

〒236–8648　神奈川県横浜市金沢区福浦2–12–4 National Research Institute of Fisheries Science, Fisheries

Research and Education Agency, 2–12–4 Fukuura, Kanazawa, Yokohama, Kanagawa 236–8648, Japan E-mail: [email protected]

2_{東海大学海洋学部}

〒424–8610　静岡県静岡市清水区折戸3–20–1 Tokai University, School of Marine Science and

Technol-ogy, 3–20–1 Orido, Shimizu, Shizuoka, Shizuoka 424– 8610, Japan

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出して_{QuickGene （Fuji Co.）を用いてDNAを抽出し} た．抽出したDNAをテンプレートにして，PCR法によりmtDNAのCOI領域と核DNAのITS1を含む領域（以下，_{ITS1領域と略記する）の増幅をおこなっ} た．COI領域の増幅にはユニバーサルプライマーの LCO1490 （5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG- 3′）とHCO2198 （5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAA AATCA-3′）を用いた(Folmer et al., 1994)．ITS1領域

の増幅にはユニバーサルプライマーのMD-1（5′-

cttgactatctagaggagt-3′）と5.8 SH （5′-agcttgcgttcttcatcga- 3′）を用いた(Sajdax & Phillips, 1997)．サーマルサイクラーとしてABI9700（Applied Biosystems）を用いた．PCR反応は，最初に94℃2分加熱し，その後， 94℃30秒，55℃30秒，72℃2分を30サイクル行い，最後に72℃で7分加熱した．PCR反応溶液は，粗 DNA溶液1 μl, 2.5 mM dNTP溶液2.5 μl, 10×Buffer （_{TaKaRa） 2.5 μl, 50 μMの各プライマー0.5 μl, TaKaRa}

Ex Taq Polymerase 0.125U，総量が25 μlになるように

超純水を加えたものである．PCR産物を1.5％アガ

ロースゲル_{（NuSieve3:1, TaKaRa）で電気泳動し，エ} チジウムブロマイド染色によって増幅産物の確認をした．増幅産物をQuick PCR Puriﬁcation Kit （Qiagen）

により精製した．COI領域について，精製した増幅

産物をテンプレートとして，_{BigDye Terminator Kit} v3.1（Applied Biosystems）を用いてシーケンス反応

を行った．シーケンス反応には，PCRで用いたのと

同じプライマーを用いた．シーケンス反応物をエタノールで精製した後，ABI PRISM 3730XL Genetic Analyzer（Applied Biosystems）で電気泳動して塩基

配列を決定した．核_{DNAのITS1領域の増幅産物を}

TOPO TA Cloning kit （Invitrogen）によりTAクローニングした．形質転換した大腸菌からM13 （5′-gtaaaa cgacggccag-3′）とM13R （5′-caggaaacagctatagac-3′）のプライマーを用いて，コロニー_{PCRを行った．PCR} の反応条件等は上記と同様である．精製したPCR産物について，上記したCOI領域と同様にシーケンス反応を行い，塩基配列を決定した．決定した塩基配列を用いて，インターネット上の遺伝子相同性検索ソフトBlast (Altschul et al., 1990) により，本サンプルの塩基配列がどのような種と近いか調べた．また，データベース上から近縁種の塩基配列を集め，Clustal W (Thompson et al., 1994) によ

りアライメントを行った．また，MEGA5.05ソフト

ウエア_{(Tamura et al., 2011) により，Kimura’}_{s two-} parameter model (Kimura, 1980)の遺伝距離を算出し，近隣結合法(Saitoh & Nei, 1987)により系統樹を作成

した．系統樹の信頼性は_{1,000回のブーストラップ} 検定(Felsenstein, 1985)により評価した．また， MEGA5.05ソフトウエアにより，種間の塩基置換数や塩基置換率を調べた．幼生の塩基配列は_DNA データベースにLC076645–LC076650で登録した．結果幼生のITS1領域の塩基配列を5つの配列を得るこ

Fig. 1. Photograph of eryoneicus postlarvae collected from Suruga Bay on July 2014. A) Dorsal view, B) lateral view, C) frontal view.

Table 1. Frequencies (％) of variable sites on ITSI region among species of Polychelidae．

Sample and

species name Abbreviation

Sample and speices name Larvae PT HA PL polychelid postlarvae Larvae

Polycheles typhlops PT 19.6

Homeryon armarium HA 23.0 22.2

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とができた．5つの平均塩基置換数は0.4塩基で，平

均塩基置換率は0.1％であった．この塩基配列につ

いて，_{Blast分析を行ったところ，Pentacheles laevis,} Homeryon armarium, センジュエビPolycheles typhlops の塩基配列と相同性が高かった（柳本ら，2015）．それら以外では，ジャノメガザミの_{ITS1の塩基配列} （AM410544）と相同性が高かったが，一致率は非常に低かった．得られたITS1の塩基配列と相同性の高かった上記_{3種のデータを比較すると，平均塩} 基置換数は88～104塩基で，平均塩基置換率は19.6 ～23％であった．塩基置換率が高く，本幼生の親種のITS1の塩基配列は，既存のデータにはなかった． Pentacheles laevis（LC022102–LC022113, LC022126– LC022127），Homeryon armarium （LC022114–LC022122）， Polycheles typhlops （LC026058–LC026068）とそれら 以外で一番相同性が高かったジャノメガザミの塩基配列_{（AM410544）を外群として，系統樹を作成した} （Fig. 2）．3種はそれぞれクレードを形成したが，幼生の配列は幼生だけでクレードを形成し，他種と塩基配列が明らかに異なっていることが分かった．しかし，幼生の塩基配列はPentacheles laevisやHomeryon armariumよりもセンジュエビPolycheles typhlopsの クレードに近かった．幼生の_{COI領域の塩基配列について，Blast分析を} 行ったところ，一致率の高かった上位種はStereomastis panglao （98％） （KF828017），Stereomastis sculpta （92％） （_{KF828016），Stereomastis nana（92％）（JQ305992）} などのStereomastis種であった．相同性の高かった 上位種と外群としてセンジュエビ類以外で一番相同性の高かったコシオリエビの一種（_{AY288292）(Lee} & Kim, 2013)の塩基配列を用いて，系統樹を作成したところ（Fig. 3），幼生の塩基配列はStereomastis panglao（KF828017）の塩基配列と高い信頼度で一 つのクレードを形成した．続いて，ヒメセンジュエビStereomastis nana （JQ305992），Stereomastis sculpta （KF828016）が順にクレードに加わるという形であった．塩基置換率は_{Stereomastis panglaoと1.2％の違} いで，他種とは8.3％以上異なっていた（Table 2）． Fig. 2. Neighbor-joining tree of the sequences of

ITSI region constructed using Kimura two-parameter distances for polychelid species and the postlarvae. Numbers beside internal branches indicates bootstrap probabilities based on 1,000 pseudoreplicates. Bootstrap probabilities higher than 50％ are shown.

Fig. 3. Neighbor-joining tree of the sequences of COI region constructed using Kimura two-parameter distances for polychelid species and the postlarvae. First and second numbers after species name indicate individual and clone number, respectively. Numbers beside internal branches indicates bootstrap probabilities based on 1,000 pseudoreplicates. Bootstrap probabilities higher than 50％ are shown.

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このことからも，本幼生はStereomastis panglaoであ ると推測された．考察本分析で2014年5月に採集されたセンジュエビ類の幼生は核DNAのITS1の塩基配列からセンジュエビ科であることが分かった（_{Fig. 2）．mtDNAのCOI} の塩基配列からStereomastis属に属し，Stereomastis panglaoであると考えられた（Fig. 3, Table 2）．ただ し，本研究ではStereomastis panglaoの成体サンプル を用いたのではなく，データベースに登録している塩基配列を用いている．そのため，今後，成体を入手して再検討する必要がある．_{Ahyong & Chan (2008)} によると，_{Stereomastis panglaoはボホール海とスル} 海の水深784–1773 mに限定的に分布していると報告しているが，本幼生が駿河湾で採集されたことから，本種の成体の駿河湾において分布している可能性が考えられた．一方，Stereomastis panglaoの幼生 期の生態について明らかになっていないが，南の海域に生息するStereomastis panglaoの幼生がウナギの シラス幼生のように，北赤道海流から黒潮に乗って駿河湾まで移送された可能性も否定できない．本報告で使用した駿河湾で採集されたセンジュエビ幼生は，柳本ら（2015）で用いている駿河湾のセンジュエビ科の幼生と同時に採集されていた．当初，柳本ら（2015）が用いている駿河湾と福島沖で採集されたセンジュエビ幼生は_{Pentacheles laevisで} あったことから，本報告で用いた幼生も同一種と考えられていた．しかし，本解析で明らかになったように，本幼生はStereomastis panglaoであると考えら れた．センジュエビ類の幼生の分布が単純でないことが推測される．今後，よりサンプル数を増やして，網羅的に検討していく必要がある．謝辞駿河湾で採集されたセンジュエビ科幼生の採集には，東海大学海洋学部水産学科教授福井　篤氏，東海大学海洋学部所属小型舟艇北斗の乗組員各位にご協力して頂いた．この場を借りて厚くお礼申し上げる．本研究の一部は，平成27年度東京大学大気海洋研究所学際連携研究費で実施された．文献

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Table 2.　Frequencies (％) of variable sites on COI region among species of Polychelidae．

Sample and species name Abbreviation Sample and speices name

Larvae SP SN SS PE PT PL1 PL2 PL3 PL4 HA WL

polychelid postlarvae (This study) Larvae

Stereomastis panglao (KF828017) SP 0.012

Stereomastis nana (JQ305992) SN 0.083 0.081

Stereomastis sculpta (KF828016) SS 0.085 0.088 0.093

Polycheles enthrix (KF828019) PE 0.135 0.136 0.159 0.136

Polycheles typhlops (EU377738) PT 0.169 0.164 0.164 0.174 0.162

Pentacheles laevis 1 (LC022126) PL1 0.199 0.197 0.202 0.18 0.199 0.187 Pentacheles laevis 2 (LC022127) PL2 0.197 0.195 0.2 0.178 0.199 0.187 0.002 Pentacheles laevis 3 （LC022126) PL3 0.197 0.195 0.2 0.178 0.199 0.187 0.002 0 Pentacheles laevis 4 （LC022127) PL4 0.197 0.195 0.2 0.178 0.199 0.187 0.002 0 0 Homeryon armarium (LC022128) HA 0.202 0.207 0.192 0.2 0.216 0.192 0.136 0.135 0.135 0.135 Willemoesia leptodactyla (KF828020) WL 0.185 0.192 0.197 0.192 0.185 0.168 0.147 0.145 0.145 0.145 0.152

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Bracken-Grissom, H. D., Ahyong, S. T., Wilkinton, R. D., Feldmann, R. M., Schweitzer, C. E., Breinholt, J. W., Bendall, M., Palero, F., Chan, T. Y., Felder, D. L., Ro-bles, R., Chu, K.-H., Tsang, L.-M., Kim, D., Martin, J. W., & Crandall, K., 2014. The emergence of Lobsters: Phylogenetic relationships, morphological evolution and divergence time comparisons of an ancient group (Decapoda: Achelata, Astacidea, Glypheidea, Polyche-lida). Systematic Biology, 63: 457–479.

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2014年5月に駿河湾で採集されたセンジュエビ類後期幼生のDNA分析による種判別

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