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「生物機能を活用した生産プロセス

の基盤技術開発」

宿主細胞創製技術の開発

平成１８年１２月１６日

資料5-3-1

プロジェクトの詳細説明資料（公開）

宿主細胞創製技術の開発

2

生物機能を活用した生産プロセスの基盤技術開発

NEDO ﾊﾞｲｵﾃｸﾉﾛｼﾞｰ・医療技術開発部 ﾊﾞｲｵｲﾝﾀﾞｽﾄﾘｰ協会（JBA) 宿主細胞創製G SPL:穴澤秀治 細胞モデリングG SPL:冨田勝 遺伝子資源ライブラリーG SPL:大竹久夫

PL：清水昌

研究開発委員会 協和発酵 分室 花王 分室 旭硝子 分室 三菱化学 L研分室 ｻﾝﾄﾘｰ 分室 RITE 分室 ﾒﾙｼｬﾝ 分室 ﾀﾞｲｾﾙ 分室 海洋ﾊﾞｲｵ 分室 カネカ 分室 香川大 慶応大 大阪大_広島大 慶応大 広島大 大阪大 岐阜大 製品評価技術基盤機構 奈良先端大 慶応大 大阪大 九工大 東大 茨城大 兵庫県立大 名大 九大 筑波大 日大 京大_岩手大 共同 研究 再委託研究 奈良先端大 筑波大 信州大 経済産業省 2001年∼2005年度

3

物質生産用宿主細胞の創製：

2006.12.16. 事後評価会SPL

生物機能を活用した生産プロセスの基盤技術開発

− 宿主細胞創製グループ −

ゲノムサイズの削減

不要・有害な遺伝子削除

機能未知因子の除去

遺伝子機能解明

遺伝子破壊株ライブラリー

汎用性高機能宿主細胞

バイオプロセスのブレイクスルーをめざして

染色体の大規模加工技術の確立

4

宿主ゲノムサイズの削減による細胞の基本活性の向上

生育到達レベル、ATP再生活性、炭素収率、糖資化性など → 物質生産能力の向上

機能未知遺伝子ついて物質生産への要不要の判断が進展

一遺伝子破壊株ライブラリーの創製

染色体大規模改変技術が進歩

宿主細胞創製技術の開発 成果のまとめ

→ 最小ｹﾞﾉﾑ生物への展開 物質生産に必要な遺伝子の組み合わせの大規模改変が可能

5

成果の普及・活用見通し

大腸菌：各種発酵生産物生産宿主細胞として、評価中 枯草菌：具体的製造プロセスへの適用を検討中 分裂酵母：タンパク質受託生産自社事業において、活用中 コリネ型細菌：各種バイオ化学品、バイオ燃料生産の工業化に向けて各社と協議中

ゲノム削減目標の達成状況

大腸菌：1400kb、枯草菌：1000kb、分裂酵母：524kb、 出芽酵母：510kb, コリネ菌：約200kb,

生産性（最高文献値に対して）

大腸菌：短鎖ペプチド2倍、キシリトール生産量同等、Thr 効果あり、最高値には及ばない 枯草菌：アルカリ性セルラーゼおよびズブチリシン2倍 分裂酵母：ｈGH分泌で30倍、Phytase7倍 出芽酵母：ｸﾞﾘｾﾛｰﾙ生産文献最高値にせまる コリネ型細菌：ポルフィリン5倍

宿主細胞創製技術の開発 成果のまとめ（続き）

6 環境適応機構 生合成制御 余分な資化能力

不要な能力の削除

機能不明な因子

の除去

分解系 競合系

全ゲノム配列情報

遺伝子機能情報

最適化された

微生物生産株

生産性遺伝子

大規模

遺伝子削除

機能遺伝子

付加

Minimum genome

factory

・育種方針が明示

・時間短縮

・メカニズムが明らか

・不確定因子の排除

・ゴールが推測できる

必要な能力の強化 エネルギー供給系

大規模

ゲノム遺伝子操作技術

10年先を行く技術開発

有害な機能の除去

最適宿主を造成

7

Nature (2002) 420:350

Synthetic

Genomics

Hydrogen production from water,

Ethanol and Butanol from cellulose

最高性能の遺伝子を集めて、bestの宿主細胞を合成する。

・自然界からランダムに集めたメタゲノムライブラリー

8

高機能宿主細胞の創製

工業的に利用中の微生物細胞の

不用遺伝子群の削除によるさらなる

最適化・高機能化／MGF

Bestの遺伝子群を組み合わせて

Bestの宿主細胞を合成する

／Synthetic genome

遺伝子機能解析、遺伝子発現解析、代謝ネットワークによる

生物機能維持

ゲノム複製、転写、翻訳、修飾、機能発現 細胞分裂、増殖

システムバイオロジーの発想による

トータルな生物機能の解析が必須

MGFコンセプトによる宿主細胞の造成は、 現在使われている種々の宿主細胞に適応可能 糸状菌、放線菌、動物細胞、

9

大腸菌ミニマムゲノムファクトリー

協和発酵・バイオフロンティア研究所

協和発酵・バイオフロンティア研究所

目指すところは

目指すところは

Predictable system

_{Predictable system}

¾ Simple genome only with defined genes

9 制御、代謝ネットワークのシンプル化

9

9

大腸菌の染色体縮小化

大腸菌の染色体縮小化

¾ Designed and activated metabolism

9 プロセス開発時間が短い

9 高効率で様々なものが作れる

MGF

MGF

：

：

Minimum Genome Factory

Minimum Genome Factory

Predictable system

Predictable system

10

削除遺伝子候補の選択

削除遺伝子候補の選択

網羅的一遺伝子破壊株（4320株、奈良先端森先生）

中距離欠失株群（75株、都立大加藤先生）

○ 親株（野生株）より生育が低下しない削除デザイン

← シンプルなゲノム構造を有する宿主細胞の創製

→ 遺伝子削除により、親株より好ましい形質を獲得

11

大腸菌次世代宿主創製の成果

大腸菌次世代宿主創製の成果

„

シンプルな遺伝子構成

„

高効率な代謝能力を持つ

„

物質生産による次世代宿主評価

9

約30%の染色体を縮小化（世界最小）

9

有用機能道遺伝子の選抜データ整備

9

代謝を活性化する有用欠失を選別

9

MGF-01株への有用欠失導入

9

ペプチド、キシリトールなど

ゲノムを縮小すると

予期しない細胞基本性能の向上が起こる

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枯草菌ＭＧＦの開発研究

枯草菌ＭＧＦの開発研究

◎タンパク質の分泌生産に優れている細胞 ◎タンパク質の分泌生産に優れている細胞 ◎ゲノム構造が明らかにされている ◎ゲノム構造が明らかにされている ◎花王での工業生産の実績がある ◎花王での工業生産の実績がある （安全性が担保されている） （安全性が担保されている） 枯草菌細胞

目的

目的

●枯草菌の蛋白質分泌生産効率の大幅改善により各種産業用酵素および ●枯草菌の蛋白質分泌生産効率の大幅改善により各種産業用酵素および 異種有用蛋白質の安価・大量供給を可能にする技術構築 異種有用蛋白質の安価・大量供給を可能にする技術構築

基本戦略

基本戦略

● ●遺伝子機能解析遺伝子機能解析 ：：削除・強化すべき遺伝子候補の探索削除・強化すべき遺伝子候補の探索 ● ●染色体レベル遺伝子操作技術染色体レベル遺伝子操作技術 ：効率的ゲノム改変技術の開発：効率的ゲノム改変技術の開発 ● ●宿主細胞の創製技術宿主細胞の創製技術 ：：MGFMGFの創製と検証の創製と検証

開発（導入）技術

開発（導入）技術

●枯草菌遺伝子の機能解析→単一遺伝子削除株ライブラリーの構築 ●枯草菌遺伝子の機能解析→単一遺伝子削除株ライブラリーの構築 ●大領域遺伝子削除方法の開発 ●大領域遺伝子削除方法の開発 ●ゲノム改変技術の導入 ●ゲノム改変技術の導入 ● ●DNADNAマイクロアレイ解析技術の導入・深化マイクロアレイ解析技術の導入・深化

共同研究

共同研究

●奈良先端大（小笠原教授）、信州大（関口教授）、筑波大（中村助教授） ●奈良先端大（小笠原教授）、信州大（関口教授）、筑波大（中村助教授）

目標

目標

●蛋白質生産効率の向上→ゲノムサイズの縮小（目標１ ●蛋白質生産効率の向上→ゲノムサイズの縮小（目標１MbpMbp削除）削除）

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酵素生産

酵素生産

枯草菌 枯草菌 ゲノム ゲノム

炭素源

炭素源

安価培地

菌体

菌体

PTSポンプ系 ﾌﾟﾛﾃｱｰｾﾞ欠損 (wprA) 胞子欠損 (sigK) SKIN削除 ﾌﾟﾗｽﾐﾄﾞ 長寿命化 ﾏﾙﾄｰｽ取込み向上 ﾌﾟﾗｽﾐﾄﾞDNAｺﾋﾟｰ数増加 異種蛋白質分泌向上 目的蛋白質以外の 夾雑物分泌低下 酵素分泌生産効率の向上

炭酸ガス

炭酸ガス

●ｹﾞﾉﾑの約

●ｹﾞﾉﾑの約

1/4

1/4

を削除（生育は野生株と同等）：世界初

を削除（生育は野生株と同等）：世界初

●酵素生産効率の向上及び生産性向上（汎用性）

●酵素生産効率の向上及び生産性向上（汎用性）

●培養後半の代謝活動の維持（後処理工程の改善に期待）

●培養後半の代謝活動の維持（後処理工程の改善に期待）

主要炭素源における 生産効率の向上 分泌装置 シャペロン 細胞膜組成

機能性汎用宿主細胞（５年間の成果）

機能性汎用宿主細胞（５年間の成果）

全糖消費（100％）

培養後期での活動性向上

（エネルギー供給系の効率化）

生産性向上（2∼8倍）

（世界最高値を更新）

1.5倍向上

残糖量（野生株：20％）

汎用化

１Mbp削除株を創製

MGB874

MGB874

株

株

14

JBA旭硝子分室

香川大学

分裂酵母MGFの研究開発

大領域除去株

炭素源利用効率向上 分泌能向上 過剰糖鎖付加回避 生産物分解回避 isp6 300∼500kb除去 ght5 pmr1 ① 遺伝子機能解析 加速 破壊が有効な遺伝子の選抜 ∼指標：増殖能・発現能∼ プロテアーゼ遺伝子多重破壊株

実証検討

クリーン除去法の開発 ② 染色体レベル遺伝子操作技 術 ・Cre-loxP 法 ・Latour 法

新技術開発成功

400kb 超除去株 作製完了 異種蛋白質 生産効率向上 分裂酵 母 MGF ・標的効率向上 ・必須遺伝子判定法 ＊100kb以上の領域除去が容易に＊ gmn2 ③ 宿主細胞の創製技術 psp3-isp6- ppp53- ppp16- ppp22- sxa2 ヒト成長ホルモン （hGH） Schizosaccharomyces pombe

15 ＊遺伝子のクリーン除去法を開発し、100kb程度の領域を高い効率で 削除できるシステムを完成した。それを用い、合計524kb （180-ORF）の除去に成功した。 ＊異種タンパク生産において有害なプロテアーゼ、ぺプチダーゼ遺伝子の 欠損変異株を網羅的に造成し、生産する異種タンパクと欠損すべき遺伝 子について組み合わせを解析した。それ以外の遺伝子についても、遺伝 子機能解析から、異種タンパク生産に有利となる形質を持つ破壊株の 取得を行った。 ＊分裂酵母MGFは200kb程度までの除去株で実用可能な生育速度を示し、 除去長に依存した発現効率の向上を示し株を見出した。

分裂酵母MGFの研究開発

16 バイオプロセス遺伝子群を ゲノム中で操作することにより発現を制御する技術の開発 三菱化学生命科学研究所 慶應義塾大学理工学部 最適化された バイオプロセス ユニット付与 Ｇ ＡＩ Ｅ Ｆ Ｂ ＨＫＣ ＤＪ ＃ Ｆ Ｂ Ｋ Ｃ Ａ ＄ ＊_Ｊ ＃ Ｈ ＄ Ｄ _＃ ＃ ＄ ＊ ＊ Ｇ 遺伝子集積技術 ＧＡ Ｉ Ｅ Ｆ Ｂ Ｈ Ｋ Ｃ Ｄ Ｊ ユニット化した遺伝子群の ゲノム中位置効果 ゲノム中方向効果 ゲノム中コピー数効果 遺伝子順序効果 遺伝子方向効果 遺伝子間効果 バイオプロセス効率化の ためのゲノム操作 遺伝子群の発現最適化 有用微生物ゲノム Ｉ ＄ ＊ Ｅ ゲ ノ ム 操 作 ・ 回 収 技 術 枯草菌 ゲノムベクター

遺伝子資源ライブラリー

高機能微生物

MGF

Ｇ Ａ Ｉ ＥＦＢ Ｈ Ｋ Ｃ Ｄ Ｊ ・OGAB法の有用 性 ・汎用性の検証

遺伝子集積法の位置付け

OGAB法：Ordered Gene Assembly in Bacillus subtilis

枯草菌のプラスミド形質転換系を

17

B. subtilis 168

ゲノム

プリパスタチン生産量による 遺伝子発現効率の評価 様々な集積順序を持つ ライブラリーの作成

遺伝子集積ゲノム

100∼300 kDaの5つの巨大 ペプチド合成酵素オペロン ppsオペロンの 転写因子（？） ペプチド合成酵素 の修飾酵素

pps

38.4 kb

degQ

0.6 kb

sfp

1.0 kb

プリパスタチン生産関連遺伝子の集積

Glu-D-Orn-Tyr-D-Thr-Glu-D-Ala

Pro Gln-D- Tyr- Ile-β-OH FA-- -18 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 60 62 65 67 69 71 59 61 63 64 66 68 70 72 74 76 78 80 83 85 88 73 75 77 79 81 82 86 89 92 94 96 84 87 90 91 93 95 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 108 110 113 115 117 119 107 109 111 112 114 116 118 120 122 124 126 128 131 133 136 121 123 125 127 129 130 134 137 140 142 144 132 135 138 139 141 143 BEST8824 0̊ 178̊ 173̊ degQ sfp pps プロモーター領域の多様性 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12 14 17 19 21 23 11 13 15 16 18 20 22 24 26 28 30 32 35 37 40 25 27 29 31 33 34 38 41 44 46 48 36 39 42 43 45 47 全144種類

全て作成

全てプリパスタチンを生産 集積ゲノム

全144のプリパスタチン遺伝子のオペロンライブラリー

19 OGAB（Ordered Gene Assembly in B. subtilis)法を用いてカロテノイド生合

成遺伝子を生合成経路に従った順序への並べ替え及び円順列ライブラ リーの構築を行い、大腸菌でのカロテノイド類総生産量を測定し、野生株と の比較を行い、再配列の有効性を検証する。 野生株 （Pantoea ananatis）

E

Ｘ

Y

I

B

Z

カロテノイド生合成経路 Z E B I Y Z I B Y E Z B I Y E I B Y Z E Z I Y E B 円順列 生合成配列

カロテノイド生産

20

①プリパスタチン

②サーファクチン

•

集積体のゲノム位置効果の検証

•

遺伝子集積体ライブラリー作成

枯草菌ゲノム中の5カ所に集積体を組み込み込んだ株を作成 複製開始点に近づくにつれ生産量が向上することが判明した。 144通りのラブラリーを構築し集積パターンと生産量の関係を調べた結果、degQとppsプロ モーター領域が近接するパターンにおいては生産量が減少することが判明した。 形質転換可能な生産用宿主に様々な集積体を導入した。 しかしながらサーファクチンではない物質を生産した。

•

集積体のゲノム中でのコピー数効果の検証

枯草菌ゲノムに導入した集積体を遺伝子増幅法により、5コピー程度にコピー数を増加させたと ころ、数倍程度生産量が向上した。 PR, CIリプレッサー集積プラスミド5種の大腸菌形質転換体は、カロテノイド類生産量に差があり、 生合成の順序に従った再配列がより多くカロテノイド類を生産していた。 野生株由来プロモーターを用いた集積系では、生合成順に従った集積体が野性型に比べて5倍 高い生産性を有し、遺伝子群再配列による効果が示された。

③カロテノイド

3つの実生産系を通してOGAB法の有用性・汎用性が実証された

21

「染色体の分断によるゲノムの大規模改変技術の開発と最小ゲノム酵母の創製」

目標 ・染色体を分断し多数のミニ染色体を持つマス ターMGFを創製する ・染色体の任意の部分を削除してゲノム削除株を 創製する ・マスターMGFからグリセロール高生産株を選抜 し、生産性を実証する ・ゲノム削除株で高度不飽和脂肪酸生産系を構築 し、生産性を実証する

出芽酵母MGFの創製

目的 １. 出芽酵母染色体の大規模改変技術を開発し、出芽酵母MGFを創製する ２. 出芽酵母MGFを用いて、有用物質生産の宿主細胞としての有用性を示す JBAサントリー分室 大阪大学、慶應義塾大学、広島大学 汎用宿主酵母 （マスターＭＧＦ） 種々の生産株選抜条件で培養し、ミニ染色 体の脱落（ゲノムの再編）によって最適化し たMGFを取得する 特定物質生産に最適化した微生物工場 条件Ａ 条件Ｂ 条件Ｃ 生産物Ｘ 生産物Ｙ 生産物Ｚ 汎用宿主酵母 （マスターＭＧＦ） 種々の生産株選抜条件で培養し、ミニ染色 体の脱落（ゲノムの再編）によって最適化し たMGFを取得する 特定物質生産に最適化した微生物工場 条件Ａ 条件Ｂ 条件Ｃ 生産物Ｘ 生産物Ｙ 生産物Ｚ 22

出芽酵母MGFの創製

PCR-mediated Chromosome Splitting : PCS法

ゲノムの大規模改変技術の開発

23 Chr. V (575 kb) Chr. X (745 kb) Chr. IX (440 kb) Chr. XIV (784 kb)

脱落可能領域

11ｹ所 376 kb 198 ORFs

M3

株

① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧ ⑨ ⑪ ⑩ Chr. IV (1,522 kb) Chr. XI (666 kb) Chr. VI (270 kb) Chr. V (574 kb)

脱落可能領域

8ｹ所 285 kb 135 ORFs

M2

株

① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧

脱落可能領域

16ｹ所 596 kb 287 ORFs

M1

株

① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑪ ⑮ ⑨ ⑧ ⑩ ⑫ ⑬ ⑭ ⑯ Chr. I (230 kb) Chr. XV (1,091 kb) Chr. II (813 kb) Chr. III (315 kb) Chr. XI (666 kb) Chr. XIV (784 kb) Chr. VIII (563 kb) Chr. XIII (924 kb) Chr. XVI (948 kb) Chr. X (745 kb)

染色体分断株（マスターMGF）の創製

24

染色体削除株の創製

染色体削除株の系統図

25

マスターMGFから、グリセロール高生産性株を構築

生産性検証

対糖収率： （理論値：0.51） 代謝経路 の強化 GPD1 の強化 Gly cer ol ( g /l) 0 0.5 1 1.5 2 2.5YPD WT Percoll 分離株 ＃７ 高生産培地 0.33 g/g-glucose 0.40 g/g-glucose 0 2 4 6 8 10 WT _#7 +GPD1 0 10 20 30 40 50 WT #7 亜硫酸塩培地 対糖収率： （理論値：0.51） 代謝経路 の強化 GPD1 の強化 代謝経路 の強化 GPD1 の強化 Gly cer ol ( g /l) 0 0.5 1 1.5 2 2.5 0 0.5 1 1.5 2 2.5YPD WT Percoll 分離株 ＃７ YPD WT Percoll 分離株 ＃７ 高生産培地 0.33 g/g-glucose 0.40 g/g-glucose 0 2 4 6 8 10 WT _#7 +GPD1 0 2 4 6 8 10 0 2 4 6 8 10 WT _#7 +GPD1 0 10 20 30 40 50 WT #7 0 10 20 30 40 50 WT #7 亜硫酸塩培地 高浸透圧条件 脱水・収縮 グリセロール生産 など（数時間） （数分） 密度勾配遠心分離 野生株 グリセロール 高生産株 高浸透圧条件 脱水・収縮 グリセロール生産 など（数時間） （数分） 高浸透圧条件 脱水・収縮 グリセロール生産 など（数時間） （数分） 高浸透圧条件 脱水・収縮 グリセロール生産 など（数時間） （数分） 密度勾配遠心分離 野生株 グリセロール 高生産株 密度勾配遠心分離 野生株 グリセロール 高生産株 ＜パーコール密度勾配遠心分画＞ 26 【γリノレン酸 ⇒ジホモγリノレン酸生成】 【ジホモγリノレン酸 ⇒アラキドン酸生成 】 脂肪酸量（ ％乾燥 菌体重量）

染色体削除株の高度不飽和脂肪酸生産性検証

生産性検証

0 0.5 1 1.5 2 2.5 5209 1150 1157 1211 元 株 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 5209元 株 1150 1157 1211

27 ade2 ade3 白色 ade2 ade3 ADE3 赤色 YAC-AWA (12 kb) 多コピー酵母染色体DNAライブラリー YAC-AWAの脱落： 赤色セクターの割合が 低いコロニーを形成 YAC-AWAの脱落抑制 赤色セクターの割合が 高いコロニーを形成 ade2ade3＋YAC-AWA ⇒赤色 ade2ade3 ⇒白色 CEN4 ADE3 TRP1/ARS1 Telomere Telomere Lo ss ra te ( /g ene r a tio n ) 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 YEp13-△ YEp13 YEp13-ZDS1

より高機能な出芽酵母MGFの創製

ミニ染色体安定化（脱落抑制）因子の取得

：導入 これまでに、12kbのミニ染色体を安定化する因 子として、酵母多コピーライブラリーから機能未 知の遺伝子(333bp)を含む約1.3kbのDNA断片 を単離. この遺伝子の発現が安定化に必須である事を 確認. 28

出芽酵母MGFの開発成果

・ゲノムの大規模改変技術を開発し（特許出願済み）、 596 kb の脱落可能

領域を持つ染色体分断株（マスターMGF)と 519 kb /245遺伝子を削除した

ゲノム削除株を創製した。

・分断されたゲノムの安定化因子を発見し、マスターMGFのより高度な機能

制御技術開発の可能性を広げた

・染色体分断株ではミニ染色体の脱落や増幅など大規模なゲノム再構築が

生じ、その結果代謝機能が向上した。

・染色体分断株でｸﾞﾘｾﾛｰﾙ生産系を構築。突然変異育種を用いない簡便な

手法で対糖収率 ０．４を示す生産性を達成した。

・染色体削除株で高度不飽和脂肪酸生産系を構築。アラキドン酸生産で

元株の６倍の生産性を達成した。

29

RITE

RITE

分室

分室

Research Institute of Innovative Technology for the Earth

（実用化研究）H18∼

有用菌株開発

より高度な技術開発

基礎技術・知見の充実

第1期（H13∼H17）（基盤技術確立）

C. glutamicum C. glutamicum RR ( (3,314,179bp)) 2990 2990 ORFORF 75 75 kDakDa 50 50 kDakDa 35 35 kDakDa 30 30 kDakDa 25 25 kDakDa 15 15 kDakDa 10 10 kDakDa Transketolase Transketolase Enolase Enolase (2 (2--phosphoglycerate phosphoglycerate dehydratasedehydratase)) Chaperonin ChaperoninGroELGroEL (HSP60 family) (HSP60 family) Fumarase Fumarase Acetyl Acetyl--CoACoAhydrolasehydrolase Elongation factor

Elongation factor TuTu Glyceraldehyde Glyceraldehyde--33--phosphate dehydrogenasephosphate dehydrogenase

Phosphoserine Phosphoserine aminotransferase aminotransferase Myo Myo--inositolinositol--11--phosphate phosphate synthase synthase Cysteine Cysteinesynthasesynthase Malate Malatedehydrogenasedehydrogenase

Translation elongation factor Ts Translation elongation factor Ts Putative fructose Putative fructose--1,6 1,6--bisphosphatase bisphosphatase Pyruvate Pyruvatekinasekinase Ribosome Ribosome--associatedassociated protein Y protein Y Triosephosphate Triosephosphateisomeraseisomerase Phosphoglycerate Phosphoglyceratemutasemutase ABC ABC--type transporter, type transporter, ATPase ATPasecomponentcomponent Fructose Fructose--bisphosphatebisphosphatealdolasealdolase

Superoxidedismutase Superoxidedismutase L L--2,32,3--Butandiol Butandiol dehydrogenase dehydrogenase Inorganic Inorganic pyrophosphatasepyrophosphatase

Peptidyl

Peptidyl--prolylprolylciscis--trans trans isomeraseisomerase((rotamaserotamase)) 10

10 kDakDaChaperoninChaperonin(Protein Cpn10)(Protein Cpn10)

Nucleoside Nucleoside diphosphatediphosphate

kinase kinase • 多数遺伝子導入 • 大規模ランダム削除法 • ミニトランスポゾンの開発 • マーカーレス繰り返し 多数遺伝子削除 • Cre/loxPシステム利用 多数遺伝子削除 • プロテオミクス解析 • 全遺伝子対応 DNAチップ解析 •破壊株ライブラリー の構築 • トランスポゾン単離 • マーカーレス 遺伝子導入法・削除法 • 遺伝子導入法・破壊法 • 代謝パスウェイ解析 • 推定非必須領域抽出 • 全ゲノム解析 • 有用遺伝子導入 による化学品生産 • ゲノムの大規模改変

民間企業

と

の

協力

コリネ型細菌宿主細胞創製技術の

コリネ型細菌宿主細胞創製技術の

研究開発とその応用

研究開発とその応用

30

世界初：コリネ型細菌破壊株ライブラリーの構築

世界初：コリネ型細菌破壊株ライブラリーの構築

転写、翻訳など 細胞分裂など 代謝、エネルギー生産 機能未知 分類不能 300 370 720 320 650 C. glutamicum C. glutamicum RR ((2990 ORFs)) 445 185 大腸菌・枯草菌 必須遺伝子 その他、推定重要遺伝子

−遺伝子機能解析の重要な研究資源−

−遺伝子機能解析の重要な研究資源−

C. glutamicum C. glutamicum RR ( (3,314,179bp)) 2990 2990 ORFORF Red: mini-Tn31831 Blue: Tn5-based mini transposon

31

コリネ型細菌：ゲノム工学技術の開発

コリネ型細菌：ゲノム工学技術の開発

人為的改変

・人工ミニトランスポゾン化 ・複数種作製、利用 Transposase Ant DR (8bp) DR (2bp) DR (3bp) DR (8bp) Transposase (1311bp,436AA) DR (8bp) 1453bp Transposase (1035bp,344AA) _{DR (2bp)} 1150bp Transposase (765bp,254AA) DR (3bp) 1294bp Transposase (1311bp,436AA) DR (8bp) 1453bp

新規トランスポゾンの単離

C. glutamicum R genome 3,314,179 bp

多数遺伝子削除（ランダム法）

Cre recombinase

loxP

loxP

DNA

多数遺伝子削除（ターゲット法）

32

多数遺伝子導入法の開発

多数遺伝子導入法の開発

Cre/ mutant lox

従来相同組換え法

lox66

lox71

従来法より100∼1000倍の 高効率化達成 Kmr

hemF hemE hemA hemBhemC hemD

hemF hemE hemA hemBhemChemD

Cre recombinase

loxP

lox71

LE+RE lox

人工オペロンの作成と

コリネ型細菌への導入

ポルフィリン生合成遺伝子群 ポルフィリン生合成遺伝子群 染色体 従来法 多数遺伝子導入法

33

ゲノム改変株のポルフィリン生産

ゲノム改変株のポルフィリン生産

ポルフィリン生合成遺伝子 6重遺伝子導入株 33 oC, 48 h

ポルフィリン生産性（最高文献値に対して）5倍以上

野生株 細胞外に排出された ポルフィリン（赤色） 34

コリネ型細菌遺伝子工学技術の確立

コリネ型細菌遺伝子工学技術の確立

人工ミニトランスポゾンの作成（3種類） ランダム遺伝子導入法・破壊法 マーカーレス遺伝子導入法、破壊法 コリネ型細菌大規模ゲノム領域削除法 マーカーレス大規模ゲノム領域削除法 ターゲット、ランダム多数遺伝子導入法 ホスト・ベクターシステムの開発：プラスミド安定化法等 高効率遺伝子導入法（非メチル化DNA利用電気パルス法） コリネ型細菌トランスポゾンの単離（5種類） 単一遺伝子破壊株ライブラリーの構築 新規コリネ型細菌誘導性プロモーターの単離

Superior cells

Superior cells

Genome manipulation

C. glutamicum R コリネ型細菌genome情報 Corynebacterium glutamicum R genome 技術基盤の確立

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コリネ型細菌MGF研究成果

コリネ型細菌MGF研究成果

＜学術論文＞

Appl. Environ. Microbiol. 71:407-416. 2005. Microbiology 151:501-508. 2005.

Appl. Microbiol. Biotechnol. 67：225-233. 2005. Appl. Environ. Microbiol. 71:3369-3372. 2005. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8:243-254 2005.

Appl. Environ. Microbiol. 71:7633-7642. 2005 (Review) . Appl. Environ. Microbiol. 71:8472-8480. 2005.

Appl. Microbiol. Biotechnol. 69：151-161. 2005. Appl. Environ. Microbiol. 72:3750-3755. 2006. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006. (in press). Microbiology 2006. (in press).

＜特許＞ 「コリネ型細菌内で機能する挿入配列」特開2005-65649 「プロモーター機能を有するDNA断片」PCT/JP2005/16269 ＜学会発表＞ 国内学会 17件、国際学会 14件 ＜新聞記事＞ 2件 C. glutamicum R株 AEMの表紙に採用 36

要素技術・微生物種別のプロジェクト内自己評価

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有用性・ 汎用性 実証

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総合評価

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宿主細胞 創製技術

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遺伝子 機能解析 技術

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大規模染 色体改変 技術 枯草菌 (OGAB) コリネ菌 出芽酵母 分裂酵母 枯草菌 大腸菌

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宿主ゲノムサイズの削減による細胞の基本活性の向上

生育到達レベル、ATP再生活性、炭素収率、糖資化性など

→ さらなる物質生産能力向上への新展開

・機能未知遺伝子ついて物質生産への要不要の判断が進展

一遺伝子破壊株ライブラリーの創製

・染色体大規模改変技術が進歩

宿主細胞創製技術開発のまとめ

→ 最小ｹﾞﾉﾑ生物への展開 物質生産に必要な遺伝子の組み合わせの大規模改変が可能

物質生産用宿主として不要・有害な遺伝子削除

生産物分解系、競合する生合成系、プロファージ、転移因子など → 汎用性の高い、遺伝子構成をデザインしやすい、明確な評価が可能 生産メカニズムか明確、生産細胞として安定 38

物質生産に最適な宿主細胞の創製の今後の展開

汎用性宿主細胞（MGFプロジェクト）

・ゲノムの大規模改変技術の確立 ・ゲノム改変の有効性の検証 ・分解系、抑制系の削除 ・機能未知遺伝子（機能）の解明

生産物ごとにゲノム設計が異なる（DGFプロジェクト）

（Designed Genome、Refined genome、Intelligent Genome） ・不要な制御系の排除（恒常性（ロバスト性）の打破） ・最適なタイミングと部位で物質生産にかかわる遺伝子を適切な量発現させる ・デザインが予想通り反映するシンプルな代謝経路をもつ、宿主細胞の創製 （ブラックボックスの解消） ・遺伝子強化による代謝改変の効果の検証 発酵、酵素反応宿主に 革新的な変化をもたらす

生産性の大幅な向上

菌株育種の手法の行き詰まり