Title マウスの肝臓におけるコネキシン蛋白の発現と肝障害における細胞間コミュニケーションに関する研究( 内容と審査の 要旨(Summary) ) Author(s) 五十嵐, 功 Report No.(Doctoral Degree) 博士(獣医学) 乙第137号 Issue Date 2015-03-13 Type 博士論文 Version ETD URL http://hdl.handle.net/20.500.12099/50996 ※この資料の著作権は、各資料の著者・学協会・出版社等に帰属します。
氏 名 （ 本 （ 国 ） 籍 ） 五十嵐 功（静岡県） 推 薦 教 員 氏 名 岩手大学 教授 古 濱 和 久 学 位 の 種 類 博士（獣医学） 学 位 記 番 号 獣医博乙第１３７号 学 位 授 与 年 月 日 平成２７年３年１３日 学 位 授 与 の 要 件 学位規則第３条第２項該当 研 究 科 及 び 専 攻 連合獣医学研究科 獣医学専攻 研究指導を受けた大学 岩手大学 学 位 論 文 題 目 マウスの肝臓におけるコネキシン蛋白の発現と肝障害に おける細胞間コミュニケーションに関する研究 審 査 委 員 主査 岩 手 大 学 教 授 古 濱 和 久 副査 帯広畜産大学 教 授 古 林 与志安 副差 岩 手 大 学 教 授 御 領 政 信 副査 東京農工大学 教 授 下 田 実 副査 岐 阜 大 学 教 授 柳 井 徳 麿 学位論文の内容の要旨 コネキシン (Cx) は，肝臓における gap junction (GJ)の構成蛋白であり，生体のホメ オ ス タ シ ス 維 持 に 関 わ る 細 胞 間 コ ミ ュ ニ ケ ー シ ョ ン (gap junctional intercellular communication; GJIC) に極めて重要な役割を果たしている。Cx の減少・過剰発現や変 異は，GJIC の正常機能からの逸脱につながり，様々な病気の発生と関係が深いと考え られているがその詳細については不明な点が多い。そこで，マウスの肝臓を用いて， Cx のうち比較的役割が判明している Cx26 と Cx32 を取り上げ，その局在を調べた。 その後，Cx32 の遺伝子をノックアウトした Cx32KO マウスを用いて，長期飼育時の 肝病変発生，Cx 蛋白の発現と GJIC の関連性の解析を試みた。さらに，アセトアミノ フェン (APAP) 投与時の肝毒性の修飾についても検討を加えた。 第 1 章では，肝 Cx26 および Cx32 の局在確認の免疫染色を定型的な病理組織学検 索と同時に行うために，ホルマリン固定パラフィン切片を用いて，検討を加えた。そ の結果，パラフィン切片を 0.2 %のプロテアーゼで 30 分間賦活化処理し，catalyzed signal amplification (CSA) 法を行うと，良好な染色性が得られた。本法を用いて，Cx26 とCx32 の局在に対する加齢 (13, 52 および 104 週間) および性差を調べたが，影響は みられなかった。
第 2 章では，104 週間長期飼育したマウスに発症した肝増殖性病変における肝 Cx26 （２）
およびCx32 の局在を明らかにするために検索した。肝増殖性病変での発現を免疫染色 と画像解析で検索したところ，3 つ（clear cell foci, eosinophilic および basophilic types） のパターンに分類された。一方，Cx26 と Cx32 の間には，増殖性病変で差異が見られ なかった。これら結果より，前がん病変および肝腫瘍によってCx の局在が異なること が示された。
第 3 章では，104 週間長期飼育した Cx32KO マウスの肝増殖性病変と GJIC 阻害と の関連を明らかにするために，肝 Cx の免疫染色と incision loading/dye transfer (IL/DT) assay を行った。対照には wild-type マウスを用いた。その結果，Cx32KO マウスでは， 肝増殖性病変が増加し，Cx32 の局在消失と GJIC 機能を把握できる IL/DT の阻害が確 認された。したがって，GJIC は肝増殖性病変発現には，大きく関与していることが示 唆された。 第 4 章では，Cx32KO マウスの肝逸脱酵素や薬物代謝酵素の特性を確認後，Cx32 欠 損時のAPAP による肝障害の修飾の有無を明らかにするために検討を行った。APAP の 100，200 および 300 mg/kg を単回腹腔内投与し，臨床病理学的検索を行った。対照に はwild-type マウスを同様に処置した。その結果，Cx32KO マウスでは 100 mg/kg 以上 で小葉中心性の肝障害が発現し，一方 wild-type マウスでは 300 mg/kg で同程度の障害 を発現した。グルタチオン (GSH) の肝組織内局在は，Cx32KO マウスでは障害部位と 一致して小葉中心部で減少し，その程度はwild-type マウスより強かった。したがって， Cx32KO マウスでは，GJIC を介して GSH が隣接する細胞から伝播されないために， 抱合能が低下し肝障害が増強されたと推測された。 以上，マウス肝臓における Cx の局在と肝増殖性病変での染色性の変化，Cx32KO マ ウスにおける肝障害性について検討し，Cx32 は，マウスでは肝障害や腫瘍発生に対し て防御的に働いていることを明らかにした。 審 査 結 果 の 要 旨 細胞膜に存在するギャップ結合（gap junction, GJ）は，隣接する細胞同士の接着に係 わ り ， 細 胞 間 の コ ミ ュ ニ ケ ー シ ョ ン に 重 要 と 考 え ら れ て い る 。GJ は ， コ ネ キ シ ン （connexin, Cx）と呼ばれる膜貫通型の六量体蛋白で構成され，細胞間の膜上で対を成 すことで接着している。申請者は，マウスの肝臓におけるコネキシン（Cx26 と Cx32） の分布と役割を明らかにする目的で，Cx 蛋白の発現ととともに肝障害との関連性を調 べた。 第 1 章では，健常マウスの肝臓における，Cx26 と Cx32 の局在を明らかにする ために，組織切片の固定法，蛋白分解法および染色条件を検討した。その結果， ホルマリン固定したパラフィン切片において，0.2 %プロテアーゼで抗原性賦活 化処理後，catalyzed signal amplification (CSA) 法を用いれば，良好な染色結果が
あるいは性差があるか検討したが，変化はみられなかった。 第 2 章では，肝増殖性病変を有するマウスを取り上げ，病変のタイプと Cx26 と Cx32 の局在の関連を明らかにするために，まず増殖性病変を分類し，Cx の 細胞内局在を画像解析した。その結果，前がん病変および肝腫瘍によって Cx の局 在が異なり，3 つのパターンに分類されることを示した。 第3 章では，Cx32 遺伝子をノックアウトした Cx32KO マウスの肝臓を用いて， Cx26 および Cx32 の局在と細胞間のコミュニケーション機能を調べた。その後， Cx32KO マウスを長期飼育し，肝臓の自然発生増殖性病変を wild-type マウス（対 照）と比較した。Cx32KO マウスでは，Cx26 の局在には差が見られなかったが，Cx32 の局在が消失および細胞間コミュニケーション機能が低下し，増殖性病変が増加して いた。したがって，Cx32 の欠損は，肝臓の増殖性病変の促進に関与することを示唆 した。 第 4 章では，Cx32KO マウスの特性を明らかにするために，各種臨床病理学的解析 を実施した後，アセトアミノフェン (APAP)で急性肝障害を誘発し，wild-type マウス （対照）と比較した。Cx32KO マウスでは，APAP による肝障害が機能・形態学的に明 らかに増強され，グルタチオンが隣接する細胞から伝播されないため解毒系が働かな かったと推測した。 以上について，審査委員全員一致で本論文が岐阜大学大学院連合獣医学研究科の学 位論文として十分価値があると認めた。 基礎となる学術論文
１） 題 目：Immunohistochemical staining methods for connexin32 on formalin-fixed paraffin-embedded sections
著 者 名：Igarashi, I., Shirai, M., Suzuki, Y., Atsumi, F., Sehata, S., Maejima, T., Manabe, S. and Teranishi, M.
学術雑誌名： Journal of Toxicologic Pathology 巻・号・頁・発行年：19（13）：151-154, 2006
２） 題 目：Background lesions during a 24-month observation period in connexin 32-deficient mice
著 者 名：Igarashi, I., Makino, T., Suzuki, Y., Kai, K., Teranishi, M.,Takasaki, W. and Furuhama, K.
学術雑誌名：The Journal of Veterinary Medical Science 巻・号・頁・発行年：75（2）：207-210, 2013
３） 題 目：Role of connexin 32 in acetaminophen toxicity in a knockout mice model
著 者 名： Igarashi, I., Maejima, T., Kai, K., Arakawa, S., Teranishi, M. and Sanbuissho, A.
学術雑誌名： Experimental and Toxicologic Pathology 巻・号・頁・発行年：66（2-3）：103-110, 2014
既発表学術論文
１） 題 目： An attempt to predict the response of human glutathione S-transferase (GST) to chemical inducers using transgenic rats harboring human GST gene
著 者 名： Manabe, S., Ando, Y., Ohashi, Y., Igarashi, I., Yamoto, T., Takaoka, M., Tanase, H., Matsunuma, N., Suzuki, T. and Itoh, K.
学術雑誌名：Journal of Toxicologic Pathology 巻・号・頁・発行年：10（3）：133-136, 1997
２） 題 目 ： Effect of glucose feeding on regenerating rat liver following partial hepatectomy
著 者 名： Tanaka, K., Igarashi, I., Ohashi, Y., Yamashita, K., Teranishi, M., Yamoto, T., Takaoka, M. and Manabe, S. 学術雑誌名：Journal of Toxicologic Pathology
巻・号・頁・発行年：11（2）：95-99, 1998
３） 題 目：Induction of glutathione S-transferases and hepatocellular proliferating activities in the rat liver treated with tert-butylated hydroxyanisole,
1,2-bis(2-pyridyl)ethylene, and phenobarbital
著 者 名：Makino, T., Sehata, S., Igarashi, I., Watanabe, T., Ohashi, Y., Manabe, S. and Yamoto, T.
学術雑誌名： Journal of Toxicologic Pathology 巻・号・頁・発行年：11（3）：183-189, 1998
４） 題 目： Comparison of bone changes between hypophysectomized rats and mini rats
著 者 名：Teranishi, M., Sato, S., Tani, Y., Yamamoto, H., Makino, T., Tanaka, K., Sehata, S., Ogata, S., Watanabe, M., Igarashi, I., Maeda, N., Matsumoto, E., Yamoto, T., Takaoka, M., Fukushige, J., Endo, K., Hosokawa, T. and Manabe, S. 学術雑誌名：Journal of Toxicologic Pathology
巻・号・頁・発行年：12（3）：131-140, 1999
５） 題 目：Comparison of bone changes between neonatally monosodium glutamate-treated rats and mini rats
著 者 名： Teranishi, M., Sato, S., Tani, Y., Yamamoto, H., Makino, T., Tanaka, K., Sehata, S., Ogata, S., Watanabe, M., Igarashi, I., Maeda, N., Matsumoto, E., Yamoto, T., Takaoka, M., Fukushige, J., Endo, K., Hosokawa, T. and Manabe, S. 学術雑誌名： Journal of Toxicologic Pathology
巻・号・頁・発行年：12（4）：183-190, 1999
６） 題 目： Osteosarcomas in the lungs of an ICR mouse
著 者 名：Maejima, T., Sehata, S., Igarashi, I., Makino, T., Watanabe, M., Ogata, S., Manabe, S. and Teranishi, M.
学術雑誌名：Journal of Toxicologic Pathology 巻・号・頁・発行年：16（2）：113-116, 2003
７） 題 目： A novel model of continuous depletion of glutathione in mice treated with L-buthionine (S,R)-sulfoximine
著 者 名： Watanabe, T., Sagisaka, H., Arakawa, S., Shibaya, Y., Watanabe, M., Igarashi, I., Tanaka, K., Totsuka, S., Takasaki, W. and Manabe, S.
学術雑誌名：The Journal of Toxicological Sciences 巻・号・頁・発行年：28（5）：455-469, 2003
８） 題 目：Relationship between GST Yp induction and hepatocyte proliferation in rats treated with phase II drug metabolizing enzyme inducers
著 者 名： Makino, T., Ishikawa, K., Igarashi, I., Yamoto, T., Manabe, S. and Nakayama, H.
学術雑誌名：Toxicologic Pathology
