学位論文題名R/Iixed allogeneic chimerism with wild-type strains ameliorates atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice

博 士 （ 医 学 ） 石 森 直 樹

     学位論文題名

R/Iixed allogeneic chimerism with wild‑type strains     ameliorates atherosclerosis

    in apolipoprotein E‑deficient mice

（混合異系骨髄キメリズムはアポE 欠損マウスにおける      動脈硬化病巣進展を抑制する）

学 位 論 文 内 容 の 要旨

    I

．  背  景

  

動 脈 硬 化 病巣 は 、 高脂 血 状 態の も と血 液細胞 と血管組 織間で誘 導され る複雑な 炎症反 応 の 結 果 形 成さ れ る 。 初期 病 巣 （脂 肪 斑 ；fatty streak)で は

T

リン パ 球 や変 性 脂 質を 貪 食 し たマ ク ロ フ ァー ジ （

M

￠ ） が 認め ら れ、病 巣進展 に伴って

M

￠が 活性化 するとと もに中 膜 平 滑筋 細 胞 が血管 内皮下に 遊走・ 泡沫化す るよう になり、 複雑病変 （線維 性硬斑；

fibrous plaque)

ー と 進 展す る 。 現在 、 動 脈硬 化 症 征圧 の た め新 た な 動 脈硬 化危険因 子の発 見に注 目 が集 ま っ て いる 。 中 でも 免 疫 系因 子 が動脈硬 化発症 ・進展に 深く関 与してい ること が明 ら かに な り つ っあ る が 、い ま だ 危険 因 子の同定 には至 っていな い。マ ウスは遺 伝的背 景が よく 解析され ており、 多因子 疾患であ る、動 脈硬化症 の解析 に有用で ある。高脂肪食を負荷 す るこ と に よ り動 脈 硬 化病 巣 を 生じ さ せること ができ 、この病 巣進展 には近交 系マウ スの 系 統に よ っ て 著明 な 差 、す な わ ち病 巣 がはっき りと形 成される 感受性 系統と、 全く形 成さ れ ない 抵 抗 性 系統 が 存 在す る こ とが 報 告されて いる。 さらに遺 伝学的 解析によ って、 複数 の 修飾 遺 伝 子 （modifier genes；

athl

〜a th9)の 存 在が 予 測 され ており 、その 一部がHDL コ レス テ ロ ー ルレ ベ ル を介 し て 形質 を 規定して いるこ とが報告 されて いる。し かし、 これ ら 修飾 遺 伝 子 の本 態 に つい て は 大部 分 が不明で あり、 形質を規 定する 機能に関 する報 告も なされていない。

    II.  

目

  

的

  

本 研 究 の 目的 は 、 動脈 硬 化 モデ ル マウ スを用 いて血液 細胞の動 脈硬化 病巣進展 に及ば す 影 響を 検 討 し 、動 脈 硬 化進 展 修 飾遺 伝 子の機能 を明ら かにし、 さらに 実験治療 の可能 性を 検討することである。

    III.  

方

  

法

  

高 脂 血 症 を自 然 発 症し 、 著 しい 動 脈硬 化病巣 を呈する

28

―

29

週齢 ・雌

apoE

ノッ クアウ ト マウ ス（apoEー／ ―；

C57BL/6 back

，

H

―

2b

）を11グレイ

(Gy)

全身放射線照射してレシピェン トとした。動脈硬化抵抗性マウス；SJL/J（

H

―

2

）または動脈硬化感受性マウス；Bl0. S/SgSlc

  

（

H

―2 ）より 骨髄細 胞を分離 し、抗

Thyl.2

抗体と補体処理で成熟T細胞を除去したのち、

レシ ピエント

1

匹当 り1．

5X 10r

個と、レシピエントと同系の

apoE

ー／―由来骨髄細胞

0

．

5X107

個を混合し、尾静脈より注入して骨髄キメラマウス（[SJL+apoL‑/‑‑'apoEV‑1、

[B1

びS+apoゲ／・

‑+apoE‑r])

を作製した。コントロールとして未処置apoE−／‐マウス（apo『／−，ルカ、同系移

ー453 ‑

植

apoE

― ／ ・ マ ウ ス （

[apoL‑i‑‑ apoL‑/‑̲7)

を 用 意し た。 各群 とも 普 通食 （normal chow diet） で 飼 育 し 、 骨 髄 移 植 施 行

10

週 目 に 、 前 夜 よ り 絶 食 に し た の ち 屠 殺 し た 。 採 取 し た 末 梢 血 は 、 一 部 フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー で 自 血 球 表 面 抗 原 の 違 い を 利 用 し て 造 血 系 細 胞 の 置 換 を 解 析 し 、 キ メ リ ズ ム を 算 出 し た 。 残 り の 血 液 か ら 血 清 を 分 離 し 、 総 コ レ ス テ 口 ー ル 値 （

T

―

Cho

） 、

HDL

コ レ ス テ ロ ー ル 値 （

HDL

―

Cho)

、 中 性 脂 肪 値 （

TG

） を 酵 素 法 で 測 定 し た 。

apoE

蛋 白 レ ベ ル は 、 血 清 サ ン プ ル を

12

％

SDS

ー ポ リ ア ク リ ル ア ミ ド ゲ ル で 電 気 泳 動 後 ブ ロ ッ ト し 、 マ ウ ス

apoE

と 交 差 す る 抗 ラ ッ ト

apoE

抗 体 を 用 い て 化 学 蛍 光 法 で バ ン ド を 得 た の ち デ ン シ ト メ 卜 リ ー で 解 析 し た 。 キ メ ラ マ ウ ス の サ ン プ ル と 同 時 に ブ ロ ッ ト し た 、 未 処 置

SJL

あ る い は

Bl0.S

の

apoE

発 現 量 に 対 す る 割 合 を 求 め て 比 較 検 討 の 指 標 と し た 。 ま た 摘 出 し た 上 行 大 動 脈 を 含 む 心 臓 は 、 固 定 ・ 包 埋 し た の ち 、 大 動 脈 弁 三 尖 と も 含 む 面 で

10

皿

m

厚 の 連 続 切 片 を 作 製 し 、

Oil RedO

で 脂 肪 染 色 し た 。 脂 肪 染 色 陽 性 の 病 巣 を コ ン ピ ュ ー タ 画 像 解 析 装 置 を 用 い て 解 析 し 、 各 群 と も マ ウ ス

1

匹 ．

1

切 片 当 り の 平 均 病 巣 面 積 を 求 め 検 定 し た 。 病 巣 の 質 的 変 化 を 検 討 す る た め 一 部 の 切 片 は

Masson strichrome

染 色 し 、 結 合 組 織 を 評 価 し た 。

    IV.  

結  果

  

レ シ ピ ェ ン マ ウ ス に 致 死 量 の 放 射 線 を 照 射 し た の ち 骨 髄 移 植 を 行 な い

[SJL +ap08‑1

・ →

ap

〇ゲ ／ 一丿

9

匹、

[810. S+apoL‑/

―

‑*apob‑

ノ

I

丿

10

匹 の 骨髄 キメラマウスを作製した 。骨髄移植後

10

週 日 で の 末 梢 血 を 用 い た

FACS

解 析 で は 、

[SJL +apo

ゲ ノ 一 →

apoE‑

ノ

I

丿

77.5

土

8

．

8

％ 、

[810.S +apo

ゲ ／−

‑ apo

ゲ ／ ー丿

70.9

土6．5%が異 系ド ナ ー由 来の自血球に置換してお り、明らかな 拒 絶 反 応 ．

 GVHR

は 認 め ら れ な か っ た 。 骨 髄 キ メ ラ マ ウ ス の 血 清 脂 質 は 、 未 処 置

apoE

ナ マ ウ ス と く ら べ て

HDL

―

Cho

が 両 骨 髄 キ メ ラ マ ウ ス 群 で

2

．

5

〜

2

，

6

倍 と ほ ば 同 程 度 上 昇 し て い た 。 動 脈 硬 化 惹 起 性

non HDL

ー

Cho

は 、

[SJL+apoL‑/‑‑ apoEv‑] 109

土

15mg/dl

、

[B10. S+apoL‑/

− →

apoEv‑] 42

土

5mg/dl

と 、 そ れ ぞ れ 未 処 置

apoE‑t‑

マ ウ ス

370

土

llmg/dl

の

29%

お よ び

ll

％ で あ り 、 予 想 に 反 し て 動 脈 硬 化 感 受 性 系 統

Bl0.S

で 置 換 し た 骨 髄 キ メ ラ マ ウ ス の 方 が 有 意 に 低 値 を 示 し た 。 骨 髄 移 植 に よ る

TG

値 へ の 有 意 な 影 響 は 認 め な か っ た 。

Western blotting

に よ る 血 清

apoE

は、 ド ナー のapoE゛ ／゛ マ ウス （SJLま たは

Bl0.S

） にく らべ て 、[SJL +apoL‑ノ −

→   apo『／一丿3．3土0．4%、[81けS+apoゲノI→ap〇ゲ／一丿3．0土0．6％と低値ではあるが、両骨髄キ メ ラ マ ウ ス 群 で は 同 程 度 の 発 現 が 認 め ら れ た 。 従 っ て 、 骨 髄 由 来 細 胞 の

apoE

産 生 は 、 他 の 組 織 （ 主 に 肝 臓 ） の 産 生 量 に 較 べ る と 低 い と 考 え ら れ た 。 骨 髄 移 植 施 行 前 （

28

―

29

週 齢 ） の レ シ ピ ェ ン ト

apoE

―

/

― マ ウ ス で は 、 広 範 囲 に 著 し い 動 脈 硬 化 病 巣 が 認 め ら れ 、

10

週 後 に は 未 処 置

apoE

マ ウ ス で は さ ら に 病 巣 が 進 展 し 、 脂 質 沈 着 や 中 心 部 壊 死 を 伴 っ た 泡 沫 細 胞 に 富 む 複 雑 性 病 変 が 形 成 さ れ て い た 。 一 方 骨 髄 キ メ ラ マ ウ ス 群 で は 、 病 巣 は 大 動 脈 弁 周 囲 の み に 限 局 し て 細 胞 成 分 に 乏 し く 、 細 胞 外 マ ト リ ッ ク ス に 富 む 安 定 化 し た 状 態 に 変 化 し て お り 、 泡 沫 細 胞 は ほ と ん ど 認 め ら れ な か っ た 。 定 量 評 価 の 結 果 、 未 処 置

apoE

・

/I

マ ウ ス に く ら べ て

[S

凡+apoゲ／―‑*apoゲ／‑]群で4．

7

％、[B10.S +apoL‑ノー‑'apoEv‑]群で8．8％まで病巣は縮小し、改 善 度 は 動 脈 硬 化 抵 抗 性 系 統

SJL

で 置 換 し た 骨 髄 キ メ ラ マ ウ ス の 方 が 著 明 で あ っ た 。

    V

．

  

考  案

  

動 脈 硬 化 モ デ ル マ ウ ス （

apoE

ナ マ ウ ス ） の 血 液 細 胞 を 部 分 的 に

apoE

ソ ゛ マ ウ ス 由 来 の 細 胞 で 置 換 す る こ と に よ り 、 著 し い 動 脈 硬 化 病 巣 の 縮 小 を 認 め た 。 病 巣 退 縮 の 機 序 と し て は 、

HDL

ー

Cho

の 上 昇 や

non HDL

―

Cho

の 低 下 な ど 、

apoE

ー ／ − マ ウ ス で 認 め ら れ る 脂 質 代 謝 異 常の 改 善 が 考 え ら れ る 。 ま た 、 発 現 は わ ず か で あ る が

apoE

蛋 白 直 接 の 抗 動 脈 硬 化 作 用 （ 泡 沫 化 し た

M

￠ か ら の 脂 質 の 引 き 抜 き を 促 進 、 抗 炎 症 作 用 ） も 挙 げ ら れ る 。 さ ら に 、 病 巣 縮 小 の 程 度 に 対 し て 、 キ メ リ ズ ム 、 血 清 脂 質 、

apoE

蛋 白 発 現 量 な ど が 与 え る 影 響 を 考 慮 す る た め 、 こ れ ら を 共 変 数 と し て 処 理 し 、 多 変 量 解 析 を 行 っ た 。 そ の 結 果 、 ド ナ ー と し て 用 い る マ ウ ス の 系 統 （ 骨 髄 由 来 細 胞 ） が 、 脂 質 代 謝 と 独 立 し て 動 脈 硬 化 病 巣 進 展 を 規 定 し て い る こ と が 明 ら か と な っ た 。

S

儿 は 未 知 の 動 脈 硬 化 修 飾 遺 伝 子

ath7

に よ っ て 、 動 脈 硬 化 抵 抗 性 が 規

―454 ‑

定されているとの報告がある。今回の結果からath7 は骨髄由来細胞の性質を規定している 可能 性 が示唆さ れた。今 後、遺伝 子座の解 明や詳細 な機能解析 が必要と 思われる 。     VI ．   結   語

   動脈硬化抵抗性マウス SJL の動脈硬化抵抗性は骨髄由来細胞の性質に由来しており、骨 髄由来細胞が動脈硬化病巣進展を市I 亅御していることが示された。混合異系骨髄キメラは、

動脈硬化性疾患の新しい治療法を探る上で有用と考えられた。

‑ 455―

学位論文審査の要旨 主 査    教 授    上 出 利 光 副 査    教 授    北 畠    顕 副査    教授   小野江和則

     学位論文題名

Mixed allogeneic chimerism with wild‑type strains     ameliorates atherosclerosis

    in apolipoprotein E‑deficient mice

（混合異系骨髄キメリズムはアポE 欠損マウスにおける      動脈硬化病巣進展を抑制する）

動 脈 硬化 病 巣 は 、 高 脂 血状 態 の も と 血 液 細胞 と 血管 組織間 で誘 導され る複 雑な炎 症反 応の結 果形 成され る。 現在、

動 脈 硬 化症 征 圧 の た め 新 たな 動 脈 硬 化 危 験 因子 の 発 見 に 注 目 が 集ま っ て い る 。 中 でも 免 疫 系 因 子 が動 脈硬 化発症 ・ 進 展 に 深く 関 与 し て い る こと が明 らかに なり つっあ るが 、いま だ危 険因子 の同 定には 至っ ていな い。 マウス は遺 伝的背 景 が よ く 解 听さ れ て お り 、 多 因子疾 患で ある動 脈硬 化症の 解析 に有用 であ る。高 脂肪 食を負 荷す ること によ り動脈 硬化 病 巣 を 生 じ させ る こ と が で き、 この 病巣進 展に は近交 系マ ウスの 系統 によっ て著 明な差 、す なわち 病巣 がはっ きり と形 成 され る感受 性系 統と、 全く 形成さ れない揺ガ囃E系統が存在することが報告されている。さらに遺伝学的角翠析によって、

複 数 の 修 飾 遺 伝 子(modifier genes; athl〜ath9)の存 在 が 予 測 さ れ て おり 、 そ の 一 部 がHDLコレス テロ ールレ ベル を 介 し て形 質 を 規定し てい ること が報 告され てい る。し かし 、これ ら修 飾遺伝 子の 本態に っい ては大 部分 が不明 であ り、

形 質 を 規 定す る 機 能 に 関 す る 報告 も な さ れ て い ない 。 申 請 者 は 血 液細 胞 の 動 脈 硬 化 病 巣進 展 に 及 ば す 影 響に 着目し て 、 骨 髄 キ メ ラマ ウ ス を 用 いて 動脈硬 化進 展修飾 遺伝 子の機 能を 明らか にし 、さら に実 験治療 の可 能性を 検討 した。 方 法は 、 高 脂 血 症 を 自然 発 症 し 、 著 し い 動脈 硬 化 病巣 を呈 する28129週齢 ・雌apoEノッ クアウ トマ ウス(apoE'‑)を致 死量 放射線 照射 してレ シピ ェント とし 、動脈 硬化 抵抗性 マウ ス；SJUJ、また は動 脈硬化 感受 性マウス；BlO.S/SgSlcより骨髄細 胞 を 分離 し 、 抗Thy112抗 体と補 体処 理で成 熟T細 胞を除 去し たのち 、レ シピェ ント1匹当り1．5x107個と 、レシ ピェ ント と 同 系 のapoEt由 来 骨 髄 細 胞0.5x l07個 を 混 合 し、 尾静脈 より 注入し て混 合骨髄 キメ ラマウ ス（[SJL+apoず →叩Dザ7， 凪 ´ 〇 ． 針印 ° 〆 ― 伽 ザ7） を 作 製し7己 靜嵒 食 瑚 請 し 、 骨 髄椡 繊 行10週 目に 屠 殺 し7乙 採取 した末 梢血 を用い てフ     ―456―

ロ ー サイ トメ ト リー で 造血 系 細胞 の 置換 を確 認1 、 残りの血液か ら血清を分離 し、総コレス テロール値、HDLコレステロ ー ′ レ 値 、 中 性 脂 肪 値 を 酵 素 法 で 測定 し た。 また 、 血清apoE蛋 白 はWemmbl讎ingをお こ なぃ 評 価し た。 摘 出し た 上行 大動 脈う ゝ ら連 続 切片 を 作製 し、Oil RedOで脂 肪 染色U商 巣面 積 を求 め 検定 し た。 骨 髄キ メラマウス では、70‑80％ が異 系 ド ナ ー 由 来 の白 血 球に 置 換さ れて い た。 血 清脂 質 では 、 動脈 硬化 惹 起性non HDLコ レ ステ 口ー ル が著 し く低 下 し、

動 脈 硬 化 感 受 性 系 統BlO.Sで 置 蜘 た 骨 髄 キ メ ラ マ ウ ス の方 が 、抵 抗性 系 統SJLで 置 換し た 骨髄 キメ ラ マウ ス にく ら べ て 有 意に 低 値を 示 した 。 また 血清apoEは 、 わず かでは あるが両骨髄 キメラマウス 群とも同程度 発現 していた 。動脈硬化 病 巣 は著 しく 縮 小し て おり 、 改善 度は 動 脈硬 化 抵抗 性 系統SJLで置 換 した 骨 髄キ メラマウ スの方が著明 であった。ま た、

SJLの 腹 腔M￠はBlO.Sのも のと 較 べて 、 変性 脂 質の 取 り込 みが 少 ない こ とをin vitroで 明 らか に した 。 申請者は、 キメ ラマ ウ スで 認 めら れた 病 巣過 縮 は、apoE＾ マ ウス で認 め られ ろ 脂質f嬬 射 異常 の改 善 、apoE蛋白 直 接の 抗動脈硬化作 用

（泡 沫 化し たMdか らの 脂 質の 引 き抜 き を促 進、 抗 炎症作用 ）、そしてド ナーマウスの 骨髄由来細胞に よるものと推 論し、

未 知 の 動H化 修 飾 遺 伝 子ath7は 骨髄 由 来細 胞の 性 質を 規 定し て いる と結 論 づけ た 。骨 髄 由来 紬 包が 動所 弼 巨イ ヒ 病巣 進 展を 規 定し てい る こと を 示し た 報告 はこ れ が初 め てで あ り、 今 後の 動脈 硬 化症 治 療の戦略とし て有望である ことが示

唆 され た 。

学 位 論文 公開 発 表後 、 副査 の 北畠 影d受か ら アポE蛋 白 の機 能 にっ いて 、 キメ ラ マウ ス での 結 果の 臨床 応 用へ の 可能 性 に つ い て、 ま た、 主 査の 上出 教 授か ら 、動 脈 硬化 病 巣に おけ る 血管 平 滑筋 細 胞の 関与 に っい て 、マ ウ ス系 統 問で の 動 脈 硬 化 感 受性 の違 い にっ い て、 キ メラ マ ウス で認 め た動 脈 硬化 退 縮の 考え ら れる 機 序に つ いて 、 また 、副 査 の小 野 江 教 授 め ゝ ら、SJLの抗 動 脈硬 化 作用 の 機序 につ い て、 キ メラ マ ウス で 認め たア ポE蛋 白の 由 来に つ いて 質問 が なさ れ

た。 申 請者 は研 究 結果 に 基づ い て、 あ るい は文 献 的知 識 を駆 使 して 、誠 実 にか つ 、概ね適切に 回答し得た。

本 論 文は 、綿 密 かつ 精 緻な 免 疫学 的手 法 を駆 使 して 、 血液 細 胞の 動朋 そ 硬f眇南 巣 進展 に 及ば す影響を明 らかにした 上 で 、 未 知 の 動 脈 硬 化 修 飾 遺伝 子ath7の性 質 を解 忻 し、 今 後の 動脈 硬 化症 治 療研 究 にラi竣 と方 向 性を 与 えた 点 が高

＜ 評 価 さ れ る 。

審 査 員 一 同 は 、 こ れ ら の 研 究 成 果 と 申 請 者 の豊 富 な知 識 なら び に科 学に 対 する 識 見な ど をあ わせ 、 申請 者 が博 士

（医 齣 を受 ける に 充分 な資 格を有するも のと判定した。

‑ 457−