博 士 （ 薬 学 ） 福 地 由 美
学 位 論 文 題 名
ヒト造血因子遺伝子導入‑SCID マウスの作製と応用 学位論文内容の要旨
［は じめ に］ 様々 な血 液疾 患の 治療 のた めに 造血 制御 機 構の 解明が望まれており、
中で もヒ ト造血を再現した実験動 物モデルの重要性が増している。しかし、造血系細 胞の維持に必要な増殖因子の多くには種差が存在するた め、ヒト造血系鞠1胞は重度免 疫不 全動 物で あるSCIDマウ スに も生 着性 が悪 い。 そこ で 、ヒ ト造血系細胞を増殖可 能な実験動物の開発を目指して、ヒ卜造血因子遺伝子導 入(Tg）・SCIDマウスの作製と それ らを 用いた白血病モデルの開 発および治療応用に関する検討を行った。今回の遺 伝子導入実験には、ヒト―マウス間て交差性のない多機能増殖因子であるヒト（h)GM― CSFお よ びhILっ と 、 多 種 類 の 造 血 因 子 と 相 乗 効 果 を 示 すhSCFを 選 ん だ 。
［方法およぴ結果］
Iヒ ト 造 血 因 子 遺 伝 子 導 入(Tg)‑S CIDマ ウ ス の 作 製 ヒ ト 造 血 因 子Tg−SCJDマ ウ ス作 製に 用い た導 入遺 伝子 は、 多臓 器に 発現させるためにSRaブ口モ ーターで駆動 さ れ る よ う に 構 築 し た 。 今 回 は 、1． SRahGM ‑CSF/hIL―3遺 伝 子 、2．SRabGM― CSFとSRahIL―3の2種 類 の 遺 伝 子 、3．SRahSCF遺 伝 子 、 を 各 々BDF1の前 核期 受精 卵に顕微注入した。
I‑lhGM ‑CSF Tg‑SCIDマ ウ ス お よ び hIL‑3 Tg‑SCIDマ ウ ス の 作 製 hGM‑CSFとhIL‐3を 同 時 に 産 生 す るTgマ ウ ス を 得 る た め に 、SRahGMーCSFと SRahIL・3遺伝 子 を同 時に 導入 したTgマ ウスの作製実験を行ない、最終 的に血清中に 2‑10 ng／mlの 高 濃 度hGM‑CSFの み を 産 生 するhGM―CSF TgーSCIDマウ ス（lineI） と 、Ing／mlのhIL―3と0.05‑0．2ng/mlの 低 濃 度hGM‑CSFを 同 時 に 産 生す るhILつ Tg‑SCIDマウス(line G)を確立した。
I‑2hGM ‑CSF Tg‑SCIDマ ウ ス お よ び hIL‑3 Tg‑SCIDマ ウ ス の 解 析 得 ら れ たTg‑SCIDマ ウ ス で は 、RT−PCRに よ り 肺、 脾臓 、肝 臓、 骨髄 等、 多臓 器に 導入 遺 伝子 の発 現が 認め られ たが 、各 臓器 およ び 血液 組成 に異 常は なかっ た。hGM・CSF Tg−SCIDマ ウ ス に ヒ トGM―CSFレ セ ブ タ ーQ鎖 とp鎖 を 発 現 す る マ ウ スproB細 胞由 来B a/F3細 胞 （BaF/GMR)を 皮下 移入 した 結果 、全 例が 約2週 間で 死亡 ある いは 瀕死 状 態に なり 、脾 臓をはじめ多臓器に未分化な細胞の浸潤が認められた。 これら移入マ ウ スの 病状 の経 過お よび 剖検 後の 臓器 浸潤 像は自血病に類似していたが、同腹のnon Tg/SCID controlには生着は認められなかった。
IIヒ ト 造 血 因 子Tg‑SCIDマ ウ ス の 応 用 BaF/GMRの 移 入 実 験 で はTg−SCIDマ ウ スがBa F/GMRの増 殖を 支持 した ので 、ヒ ト 自血 病モ デル の作 製を試 みた。移入実 験は、X線照射後のTg‑SCIDマウスの皮下や腹腔内にヒト骨髄性白血病細亅胞株TF−1、 UF―1．UT―7/GMを 移 入 し て 行 っ た 。 さ らに 、TF‑1やUF―1の白 血病 モデ ルに 対し て分化誘導剤6一アミノレブリン酸（6・ALA）やアボトーシス誘導剤亜ヒ酸(As203）を投 与し、自血病治療モデ ルとしての可能性も検討した。
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II‑1ヒト自血病モデルの作製
II‑1‑1ヒ ト 赤 自 血 病 細 胞 由 来TF‑1細 胞 の 移 入 ヒ ト 赤 白 血 病 細 胞 由 来TF・1は hGM−CSF. hlL‑3、hEPOに 厳 密 な 依 存 性 を 示 し 、 ボ ル フ ィ リ ン ・ ヘ ム 生 合 成 中 間 体 6‑ALAに よ っ て 赤 芽 球 系 細 胞 に 分 化 す る 。 今 回 、hGM―CSF Tg・SCIDマ ウ ス やhIL‑
3 Tg‑SCIDマ ウ ス の 皮 下 や 腹 腔 内 にTF・1を 移 入 し た 結 果 、 移 入 経 路 に 依 ら ず 、 両 Tg‑SCIDマ ウ ス で 移 入 細 胞 の 増 殖 を 認 め た 。 一 方 、 同 腹 のnon Tg/SCID controlに は ほ と ん ど 生 着 は 見 ら れ な か っ た 。TF‑1の 増 殖 は 、 皮 下 移 入 で は 皮 下 に 限 局 し た 固 形 腫 瘍 の 形 成 だ っ た が 、 腹 腔 内 移 入 で は 固 形 腫 瘍 の 形 成 に 加え て腹 水 中へ の〃 重瘍 訓泡 の浸i劉とJ)n、肝臓、生殖器および膵臓への浸潤だった。これらの固JF彡J亅亜瘍や浸j閏耐！J胞 は TF−1由 来 の 細 胞 で あ る こ と が 組 織 化 学 的 解 析 やRT―PCRに よ り 確 認 さ れ た 。 II‑1‑2ヒ ト 前 骨 髄 球 性 自 血 病 細 胞 由 来UF‑l細 胞 の 移 入 ヒ ト 前 骨 髄 球 性 白 血 病(APL)細 胞 由 来UF‑1は 、PML―RARa融 合 遺 伝 子 を 持 ちhGM・CSF. hIL，3等 に 反 応 す る が 、 分 化 言 秀 導 剤 レ チ ノ イ ン 酸(RA)に 対 し て は 耐 性 を 獲 得 し て い る 。 今 回 、hGM− CSF TgーSCIDマ ウ ス の 皮 下 や 腹 腔 内 にUFー1を 移 入 し た 結 果 、 い ず れ の 移 入 経 路 で も 固 形 腫 瘍 の 形 成 お よ び 腹 腔 内 移 入 で は 微 量 な が ら も 腹 水 の 貯 留 が 認 め ら れ た 。 こ れ ら 腫 瘍 細 胞 の 細 胞 表 面 マ 一 カ ー 、 染 色 体 の 核 型 、PML・RARa融 合 遺 伝 子 の 存 在 、RA に対 する反応性はいずれもUF‑1と同様であった。
Il‑2ヒト自血病治療モデルとし ての検討
II‑2‐ lTF‑1腹 腔 内 移 入hIL‑3 Tg‑SCIDマ ウ ス へ の ふ ア ミ ノ レ プ リ ン 酸 （6‐ ALA） 投 与 の 効 果TF− 1腹 腔 内 移 入 後18日 目 のhIL−3Tg‑SCIDマ ウ ス に7日 間 、5 mM6‑ALA（ 対 照 群 に はPBS)0.5 mlの 連 続 皮 下 投 与 を 行 っ た 。 そ の 結 果 、6・ALA群 で は 対 照 群 と 比 べ て 固 形 腫 瘍 の 大 き さ が5‑6倍 に 、 腹 水 中 へ の 浸 潤 細 胞 数 も2・24倍 に 増 加 し て い た 。 し か し 、 糸n繊 学 的 に は 赤 芽 球 系 細 胞 へ の 分 化 傾 向 は 認 め ら れ な か っ た 。 従 っ て 、6ーALAのTF―1に 対 す る 作 用 はf門vivoで は 増 殖 促 進 で あ る こ と が 明 ら か にな った。
Il‑2‐ 2UF‑1皮 下 移 入 hGM‑CSF Tg‑SCIDマ ウ ス へ の 亜 ヒ 酸(A s203） 投 与 の 効 果RA耐 性 のAPL症 例 にAs203を 投 与 す る とAPL細 胞 が ア ボ ト ー シ ス を 起 こ す こ と カs報 告 さ れ て い る 。 そ こ で 、ur―1の 皮 下 腫 瘍 が 冫1cm3を 越 え たhGM―CSF Tg−SCIDマ ウ ス に21日 間 、9．43mピ ノkgB．W．(ICRマ ウ ス に お け るLDso値 ） の As203（ 対 照 群 に はPBS） の 連 続 皮 下 投 与 を 行 っ た 。 ま た 、all‑trans RA (ATRA)徐 放 剤(25mg/21 day release/pellet） の 皮 下 埋 め 込 み も 実 施 し た 。 そ の 結 果 、 皮 下 腫 瘍 の 大 き さ はATRA群 、 対 照 群 と も 経 時 的 に 増 大 し 剖 検 時 に は 約4．5倍 に な っ て い た が 、As203群 で は 約0，5倍 に 縮 小 し て い た 。 さ ら に 、As203群 で は ア ボ ト ー シ ス を 誘 導 し た 個 体 と 顆 粒 球 ヘ 終 末 分 化 し た 個 体 が 認 め ら れ ， 後 者 の 成 熟 顆 粒 球 系 細 胞 が ヒ ト 由 来 で あ る こ と が ヒ 卜 特 異 的 な 抗 体 に よ る 解 析 か ら 明 か に な っ た 。 従 っ て 、UF．1へ のAs203お よ びATRAの 作 用 がf冖 レitroを 追 試 す る と と も に 、GM−CSFとAs203の 組 み 合 わ せ て 分 化 誘 導 が 起 こ る 新 し い 治 療 法 と し て の 可 能 性 も 示 唆 さ れ た 。
［ 考 察 ］ 今 回 、 ヒ ト 骨 髄 系 細 胞 の 維 持 に 優 れ た 実 験 動 物 の 開 発 を 目 指 し て ヒ ト 造 血 因 子Tg―SCIDマ ウ ス の 作 製 を 行 っ た 。 得 ら れ たhGM―CSF Tg‑SCIDマ ウ ス やhIL―3 Tg・SCIDマ ウ ス は 、 従 来 のSCIDマ ウ ス に は 生 着 が困 難な ヒ ト骨 髄性 白ifii病 翁 ｜胞 を増 殖 可 能 で あ り 、 ま た 、 自 血 病 縦0胞 を 移 入 し たTピ −SCIDマ ウ ス へ の 薬 剤 投 与 実 験 か ら は 、 本Tg・SCIDマ ウ ス の 実 験 動 物 と し て の 有 用 性 も 示 さ れ た 。 し か し 、 ヒ ト 正 常 造 血 系 細 胞 や 白 血 病 の 臨 床 検 体 を 用 い て の 検 討 が 遅 れ て い る こ と 、 移 入 白ml病耐0胞 のマ ウ ス 骨 髄 や 牌 臓 へ の 浸 潤 ／ 末 梢 血 中 の 循 環 な ど 、 白 血 病 特 有 の 病 型 を 再 現 で き な か っ た こ と か ら 、 得 ら れ たTg．SCIDマ ウ ス に は さ ら な る 改 良 が 必 要 で あ る こ と も 明 か に
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なった。しかし、未だに優れた白血病モデルがなく、その一方で治療薬の開発が危急 に望まれている現状では、ヒト骨髄性自血病翁0胞を増殖できる本Tg・SCIDマウスの 有用性は非常に高いと考えられた。
学位論文審査の要旨
学 位 論 文 題 名
ヒト造血因子遺伝子導入 ‑SCID マウスの作製と応用
造 血 器 腫 瘍 性 疾 患 を 初 め と す る 様 々 な 血 液 疾 患 に 対 す る 効 果 的 な 治 療 法 を 確 立 す る た め に 、 造 血 制 御 機 構 の 解 明 が 強 く 望 ま れ て い る 。 こ の 造 血 制 御 機 構 の 解 析 を 進 め て い く 上 で 、 ヒ ト の 造 血 系 を 忠 実 に 再 現 し た 実 験 動 物 は 必 要 不 可 欠 で あ り 、 そ の 作 製 は 今 日 の 重 要 な 課 題 の ー つ に な っ て い る 。
種 々 の 血 液 細 胞 は 、 多 能 性 造 血 幹 細 胞 が 自 己 増 殖 し つ つ 、 種 々 の 造 血 前 駆 細 胞 を 経 て 、 末 梢 の 赤 血 球 、 白 血 球 、 血 小 板 な ど に 分 化 し て 得 ら れ る 。 そ の 際 に は、 造 ｜觚 支持 細胞 など から 分泌 され る多 種類 の造J川因 子や 支 持ra1胞 上 に 発現 して いる 接着 分子 や網 ‖胞 外 マ卜 リッ クス 等、 いわ ゆる 造 血 微 小 環 境 を 構 成 す る 囚 子 の 多 く は 種 交 差 性 が な い た め に 、 ヒ ト の 造 血 系 細 胞 、 巾 で も 骨 髄 系 の 細 胞 をSCIDマ ウ ス 等 の 免 疫 不 全 動 物 体 内 で 維 持 し 、 モ デ ル 化 す る 事 は 困 難 で あ る 。
遺 伝 子 導 入 マ ウ ス(Tgマ ウ ス ） は 、 目 的 と す る 遺 伝 子 が マ ウ ス 染 色 体 に 挿 入 さ れ る た め に 、 ひ と た び 目 的 と す るTgマ ウ ス が 確 立 さ れ る と 、 導 入 遺 伝 子 由 来 の タ ン バ ク 質 の 安 定 し た 発 現 が 可 能 と な る 。 本 研 究 で は 、 ヒ ト の 造 血 を 支 持 す る ヒ ト 型 の 諸 因 子 を 補 う 手 段 と し て SCIDTgマ ウ ス の 作 製 に 挑 戦 し 、 下 記 の よ う な 成 果 を 挙 げ た 。 1： ヒb造 血 因 壬 遺 伝 壬 導 ム ヱ 立 スQ佐 製
造 血 因 子 と し てGMーCSFの 遺 伝 子 を 導 入 し たTgマ ウ ス の 作 製 を 試 み 、 生 涯 を 通 じ て 安 定 し た 造JnL支 持 因 予 を 発 現 さ せ る マ ウ ス の 誕 生に 成 功 し た 。 こ れに より 、 均質 なマ ウス を安filIiに 大 量に 研究 市場 へ供 給す る 事 が 可 能 に な っ た 。
2： ヒ 上 造 血 遺 伝 壬 遵 △ ヱ 空 スQ広 ロ 皿 究
GMーCSFあ る い はIL―3を 発 現 し たTgマ ウ ス を 用 い て ヒ 卜 自 血 病 モ デ
治
幸 彦
修
滋
靖 和
康
澤
村 橋
熊
長 野
高 大
授 授
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教 教
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助 助
査 査
査 査
主 副
副 副
ル マ ウ ス を 作 製 する 事を 試み た。 ヒ ト向 血病 瀦‖ 胞 とし て、 赤I≧llflL病細 ntci ln来のTFー11l胞、前骨髄性I三1ifiL病細‖亅包I！I来のUI，−i ‑%111JYcjl、さらには臣核 球 系 白 血 病 細 胞 山 来 のUT―71%IU胞 をSCIDTgマ ウ ス ヘ 移 入 し 、 ヒ1血 病 モ デルマウスを作製することに成功した。
