t 22 9 30 4236

氏 名 授 与 し た 学 位 専 攻 分 野 の名 称 学 位 授 与 番 号 学 位 授 与 の 日付 学 位 授 与 の 要 件

学 位 論 文 の題 目 張 博

弦士

学 術

博 甲第

4236

号 平成

22

年

9

月

30

日

自然科学研 究科 バイオサイエ ンス専攻 (学位規則第

5

条第

1

項該 当)

Specific detection and assessmentofthephysiologlCalactivlty Ofan anaerobicbenzene degrader

, Az oar c u

ssp.StrainDNl1incontaminatedundergroundwater

(汚染地下水 にお ける嫌気的ベ ンゼ ン分解菌Az

oar c u

ssp.DNll株の特異的検 出 と生理 活性評価)

論 文 審 査 委 員 教授 鈴木 信 弘 准教授 園 田 昌司 教授 金原 和秀 (静岡大学)

学位論文内容の要 旨

Thephysiologicalactivityandcellnumberarethemostimportantdeterminantsthataffecttheefnciencyofbioremediationof benzeneincontaminatedundergroundwaterwithananaerobicbenzenedegrader

,Az o wc u

ssp.StrainDNl1.Inthisstudy,various methodsareappliedtoassessthephysiologicalactivityofthestrainunderanaerobiccondition.

MPNIPCRmethodwasappliedtoquan

t

ify cellconcentrationsofstrain DNlIinenvironmental samples,whichartificially i

noculatedwithstrainDNlI.As aresult,thedetectionofPCRproductsdidnotcorrelatetothedilutionseriesofundergroundwater samples.Thetechniquewassofarsuccessfullyappliedtomanycases,butfurtherconsiderationonexperimentalConditionshouldbe necessarytoapplythetechniquetothesamples.

A

n enumerationprotocolof

Az oay eu

ssp.strainDNllwith瓜uorescentprobeswasdeveloped.Theeffectofbenzene concentrationontheviability ofstrainDNl1wasevaluatedwiththeprotocol.SeveralGFP‑labeledstrainDNl1wereconstructedto monitoritsactivity underanaerobiccondition.Theresultshowedthatalthough theaerobicgrowthofstrainDNl1onbenzenewas rapid,itsanaerobicgrowthwouldbehighlystressfu)conditionsasrevealedbythisexperiment.Thepossiblecausesforthisdecrease inphysiologiCalactivitywereunknown,buttechmiquesforevaluatingphysiologicalactivitywerethusestablished.

A methodtoanalyzephysiologlCalstatus ofamodeltargetbacterium wasestablished.A uniquemethodthatenables identincationandmonitorlngOfphysiologicalstatusofindjvidual targetbacterialcellswasestablished.Thekeystrategyofthis methodistheusageofglue,whichcanimmobilizethecellsonmembranefilterswithoutaffectingtheirviability andmicroscopic observation.TogetherwithimprovedFISH procedure,mostofcellswerelabeledwithhigh elRciency.Themethodenablesboth identiGcationoftargetbacteriainamixtureofvariousbacteriaandanalysisofitsphysiologicalactivlty.

ThemethodwasappliedtoanalyzestrainDNllgrowninanaerobiccontaminatedundergroundwater.Atthesametime, degradationofbenzenewastraced･Theresultssuggestedthatbenzenedegradationoccurredbuttheenergygeneratedbythe degradationwasusedforsurvivalbutnotfortheirgrowth.TheresllltsalsosuggestedthatinordertogainCellmassande氏cient benzenedegradationinanaerobiccondition,SomemoremodiRcationsoncultWeconditionsincludingitscompositionshouldbe f

urtherinvestigated.

Byapplbngthemethoddescribedinthisstudy,thephysiologlCalactivltyOfatargetbacterium inamixedpopulationcan be evaluated,toknowwhethertheinoculated(orintroduced)bacterium aree氏cientlydegradingthecontaminantsinenvironments.The combinedtechniquecanbeusedinmonitoringbacterialcellviabilityforbioremediation･Wh entheirphysiologicalactivityislowas foundinthisstudy,thebioremediationconditionscanbechangedtofacilitatedegradation.Theinform ationisveryusefulforbetter understandingforactualbioremediationprocessandwillbeappliedforpracticalmanagementofbioremediation.

論文審査結果の要 旨

8 月 1 7 日に行 われた博士論文発表会での発表な らびに質疑応答 を受 けて､本論文の学位審査 を行 った｡本論 文では､地下水の汚染 を処理す るバイオ レメデ ィェ‑シ ョンでの分解活性 の維持 をモニタ リングするため､

生理活性の計測を行 う手法の構築 を嫌気的ベ ンゼ ン分解菌 ､Az oar c u ss

p

.DN ll 株 を用いて行ったOまず ､DNll 株 のベ ンゼ ン分解性 を解析 した結果､一般的な汚染濃度である 1 mg / 1 のベ ンゼ ンを 1 2 週間で分解可能なことを 確認 した｡また､生細菌の計測法を確立 し､高濃度のベ ンゼ ン存在下では､生存率が著 しく減少することを 見出 した｡次に､地下水 中での DNl l 株のベ ンゼ ン分解 と生残性 を解析す るため､ 生存活性 と Fl uo r e s c e nc el nSi t u Hy br i di z a t i o n ( FI S H) 法を組み合わせ た､新規の解析手法の構築 を行 った oFI SH 法は細菌 を固定化 して行 うた

め､生細菌の計測 を行 った後 に､菌体をメンブラン上に固定 して FI SH を行 う､新規の手法の構築を試みた｡

様 々な試行錯誤の結果､希釈 した接着剤 を用いることで､菌体のメンブラン上‑の固定 と､効率的な FI SH

検

出法の構築に成功 し､地下水環境の複合微生物系の中か ら､特定の生 きた分解菌 を計測す ることを可能に し

た｡次に､実際の地下水サンプルに DNll 株 を添加 し､ベ ンゼ ン分解 と生残性のモニタ リングを行った｡その

結果､ベ ンゼンの分解は達成す るが ､DNll 株 の総菌数は減少 し､生残性 も著 しく減少す ることが認め られたC

この結果は､分解の過程で分解菌が死滅す ることを示 してお り､今後､分解活性 を維持す るには､栄養塩や

電子供与体の添加が必要であることを示唆 し､モニタ リングの重要性 を示す結果が得 られた｡ また､本論文

で開発 した手法の重要性 に関 して質疑応答 を行い､見出 した現象の重要性 を認識す ることができた｡その結

果､行った研究は学位論文 として十分価値があると評価 された｡ また､論文で行 った研究の周辺分野に関 し

て､質疑応答 を行った｡学力 については､当該分野の知識は十分であ り､今後の研究の展開に関 して意義あ

る議論 をす ることができ､博士号取得者 として十分な レベルであることを確認 した｡論文作成能力に関 して

は､英語で1 編の投稿論文を書いていることか ら､十分な英語能力 を有 していることを確認 した｡以上の結果

か ら､論文は博士 ( 学術) として十分価値 があ り､学力 は博士課程修 了者 として十分な レベルであるもの と

判定 した｡