平 成7年12月(1995年) 15一
総
説
新 規 生 理 活 性 因 子:ピ
ロ ロ キ ノ リ ン キ ノ ン(PQQ)
森 下
恵 美1),成 田 宏 史2)
A Novel Bioactive Factor: Pyrroloquinoline
Quinone (PQQ)
Emi Morishita
and Hiroshi
Narita
は じ め に ピ ロ ロ キ ノ リ ン キ ノ ンPyrroloquinoline quinone (PQQ)がFAD, NADに 次 ぐ第 三 の 補 酵 素 と して 生 体 内 酸 化 還 元 反 応 に 関 与 して い る こ とが 報 告 され た の は1979年 で あ る 。 最 近 に な っ て,こ れ ま で PQQと 思 わ れ て い た い く つ か の 酵 素 の 共 有 結 合 型 の補 欠 因 子 が チ ロ シ ンや ト リプ トフ ァ ン誘 導 体 で あ る こ と が 明 ら か に され,こ れ らの キ ノ ン系 補 欠 因 子 を持 つ 蛋 白質(キ ノ プ ロテ イ ン)が 脚 光 を 浴 び て い る。 一 方,PQQは,微 生 物 に 対 す る増 殖 因 子 活 性, 花 粉 の 発 芽 促 進,肝 障 害 ・白内 障 の予 防 効 果 を 示 す こ と,さ ら に は マ ウ ス でPQQ欠 乏 症 が 観 察 さ れ た こ とか ら,新 た な 生 理 活 性 物 質 と して も注 目 され て い る。 ま た,PQQの ユ ニ ー クな 生 合 成 経 路 も 明 ら か に さ れ つ つ あ り,PQQ研 究 は 今 佳 境 に 入 っ た と い え よ う。 1.酵 素 の 補 欠 因 子 と して のPQQ PQQは1979年 に メ タ ノ ー ル 資 化 性 細 菌 の メ タ ノ ール 脱 水 素 酵 素 の 補 酵 素 と して 発 見 さ れ1),当 初 は メ トキ サ チ ン と命 名 され た が,現 在 で は そ の 特 徴 的 な構 造 に 従 ってPQQと 呼 ば れ て い る(図1)。 PQQは 中 性 水 溶 液 中 に お い て249nmと330nm に 吸 収 極 大 を 持 ち,400∼600nmの 広 い 吸 収 に よ り 赤 紫 色 を 示 す 。 ま た,還 元 され る と318nmに 吸 収 極 大 を 示 す よ う に な る(PQQHa,図1)。 PQQの 補 酵 素 活 性 は この0一 キ ノ ン部 に お け る 電 子 の 授 受 に起 因 して い る。 現 在 の と こ ろ確 実 にPQQを 補 酵 素 と して 有 して い る酵 素 は グ ラ ム陰 性 菌 を 中心 と し た 原 核 微 生 物 に 限 ら れ て い る 。 こ れ ら の 酵 素 と PQQと の 結 合 は 非 共 有 結 合 で あ り,そ の 結 合 に は カ ル シ ウ ムが 関 与 して い る。 また,こ れ ら の酵 素 は ポ ロ型 で 安 定 で あ る が,Comamanas testosteraniの ア ル コ ー ル 脱 水 素 酵 素 の よ うに ア ポ 型 と し て容 易 に 単 離 可 能 な 酵 素 も存 在 す る2)0 一 方,こ れ ま でPQQと 思 わ れ て い た ア ミン酸 化 酵 素3)や メチ ル ア ミン脱 水 素 酵 素4)の 共 有 結 合 型 補 欠 因 子 は,そ れ ぞ れ 酵 素 分 子 内 の 特 定 の チ ロ シ ン残 基 や ト リプ トフ ァ ン残 基 の翻 訳 後 修 飾 に よ っ て生 じ たTOPAキ ノ ン(TPQ)や ト リプ トフ ァ ン ト リプ 表1PQQに 対 し て 得 ら れ た モ ノ ク ロ ー一ナ ル 抗 体 (Narita and Morishita5)よ り改 変)
No.種 類 pQQ-BSA TOPA-BSA 遊 離pQQ 2 9 1 6 7 3 5 IgGl IgGl IgM IgM IgM IgM IgM 十 十 十 十 十 十 十 十 十 十 十 1)京都 大学 大学 院農学研 究科 2)京 都女 子大学 家政学部 食物 栄養 学科食 品学 第一研 究 室 PQQは 低 分 子 化 合 物 で あ る の で 抗 原 性 が な い た め, pQQをBSAに 結 合 さ せ たPQQ-BSAを 抗 原 と し て,7つ の モ ノ ク ロー ナ ル 抗 体 を 得 た 。 これ ら の う ち3番 と5番 は 非 特 異 的 で あ り,1,6,7番 は結 合 状 態 のPQQし か 認 識 せ ず,2番 と9番 は 遊 離 の PQQも 認 識 し た 。2番 と9番 がPQQに 対 して も っ と も特 異 性 の 高 い 抗 体 で あ る。
PQQ
PQQH2
OPQ
TPQ
TTQ
図1 PQQお よび その関連 化 合物 の構 造 トフ ィル キ ノ ン(TTQ)で あ る こ とが 最 近 明 らか に され つ つ あ る(図1)。 我 々 もPQQに 対 す る モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 を 作 製 し(表1),こ れ らを 用 い た 免 疫 化 学 的 解 析 か ら 同 様 の 結 論 を 得 て い る5)0す で に 他 の グ ル ー プ に よ る ポ リ ク ロ ー ナ ル 抗 体6),モ ノ ク ロー ナ ル抗 体7)を 用 い た 報 告 が あ るが,こ れ ら は 特 異 性 が 甘 か っ た た め 誤 っ た 結 論 に 至 っ て い た 。 現 在 これ ら の キ ノ ン系 補 欠 因 子 を 持 つ 蛋 白質 は キ ノ プ ロ テ イ ン と総 称 され,そ の 構 造 と機 能 の 解 明 な ら び に 新 た な キ ノ プ ロ テ イ ンの 検 索 が 活 発 な 研 究 対 象 と な っ て い る8)0 皿.PQQの 生 合 成 メタ ノ ー ル資 化 性 菌 は培 地 に 多 量 のPQQを 蓄 積 し,そ の 量 は 条 件 に よ って は培 地1リ ッ トル あ た り 19に も 達 す る 。 現 在 の と こ ろ,量 の 多 少 に 違 い は あ る も の の,ほ とん どの 微 生 物 にPQQ産 生 能 が あ る と考 え られ て い るが,動 植 物 に お け るPQQ産 生 は 疑 問 で あ る。 PQQの 生 合 成 経 路 に 関 し て は トレ ーサ ー 実 験 の 結 果 か ら,図29)に 示 す よ うな グ ル タ ミ ン酸 と チ ロ シ ンを 前 駆 体 と した 経 路 が 予 想 され て い る 。 一 方, Goosenらlo)はAcinetobactey calcoaceticumのpQQ 生 合 成 能 欠 損 株 の 相 補 実 験 か ら,4っ の翻 訳 可 能 領 域 を コ ー ド して い る5000塩 基 対 のPQQ合 成 系 遺 伝 子 を 単 離 した 。 も っ と も小 さ い 翻 訳 可 能 領 域 は24ア ミノ酸 か ら な る ペ プチ ドを コ ー ドして お り,部 位 特 異 的 変 異 を 用 い た解 析 に よ り,こ の ペ プ チ ドの16番 目の グ ル タ ミ ン酸 と20番 目の チ ロ シ ンがPQQ合 成 に 必 須 で あ る こ とが 明 ら か に な っ た 。 さ ら にKleb-siella pneumon iaeのPQQ合 成 系 遺 伝 子 に は,同 様 の ペ プ チ ドに 加 え て 分 子 量84kDaの プ ロテ ァ ー ゼ 様 の 蛋 白質 も コ ー ドされ て い た 醜 こ れ ら の 結 果 か ら,PQQは 遊 離 の グ ル タ ミ ン酸 と チ ロ シ ンか ら で平 成7年12月(1995年) 17
Tyrosine DOPA DOPAquinone DOPAchrome
PQQ
図2 pQQの 予 想 さ れ る 生 合 成 経 路(MAG van Kleef and JA Duineg))
き る の で は な く,ペ プチ ド鎖 内 に 離 れ て 存 在 して い る グ ル タ ミン酸 残 基 とチ ロ シ ン残 基 が 結 合 した 後 切 り出 さ れ て生 じ る,と い う極 め て ユ ニ ー クな 合 成 経 路 の存 在 が 示 唆 され て い る 。 この 切 り出 し機 構,他 の 翻 訳 産 物 の 機 能 な ら び に,PQQ生 合 成 系 の 発 現 調 節 機 構 が興 味 深 い 。
凪
定
量
PQQの バ イ オ ア ッセ イ 法 と して は,ア ポ 型 の グ ル コ ー ス脱 水 素 酵 素12)や ア ル コ ー ル 脱 水 素 酵 素2) の ホ ロ化 に と も な う酵 素 活 性 の 回 復 を 指 標 と した 方 法 が あ る 。 逆 相 カ ラ ム を 用 い たH肌Cに よ る 定 量13)で は,紫 外 部 吸 収,蛍 光,電 気 化 学 法 な ど, 検 出法 が 工 夫 さ れ て い る。 簡便 で 感 度 も よ い た め 汎 用 され て い る の は,PQQが ア ミ ノ酸 を 脱 炭 酸 し自 表2 GC-MS法 に よ るPQQ定 量 値 (Kumazawa A, et a1199215、199316)よ り抜 粋) ら は 還 元 され る性 質 を 利 用 した酸 化 還 元 サ イ クル 法 で あ る14)。本 法 で は 遊 離 の み な らず 結 合 体 のPQQ も 測 定 で き る が,特 異 性 の 点 で 注 意 を 要 す る。13C-PQQを 内 部 標 準 に 用 い た ガ ス ク ロ マ トグ ラ フ ィ ー 質 量 分 析 法(GGMS法)は 簡 便 さに は 劣 るが も っ と も 信 頼 で き る方 法 と 思 わ れ る 。 表 15,16)に本 法 に よ るPQQ定 量 値 を ま とめ た 。 著 者 らは モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体(表1)を 用 い た 酵 素 抗 体 法 に よ るPQQ及 び そ の グ リシ ン付 加 体 で あ る オ キ サ ゾ ピ ロ ロキ ノ リン(OPQ,図1)の 高 感 度 定 量 法 を 開 発 し17),ヒ ト,ウ シ胎 児 血 清,牛 乳,卵 白,食 酢 に 数nMのPQQの 存 在 を 確 認 して い る。 これ ま で 天 然 物,食 品,生 体 試 料 中 のPQQ含 量 は 過 大 評 価 され て お り,再 評 価 す る必 要 が あ る と思 わ れ る 。いず れ の 方 法 を 用 い る に しろ,測 定 法 の特 性, 試 料 の前 処 理,他 法 と の比 較 な どを 含 め て 結 果 を 解 釈 す る必 要 が あ る。 IV. 生 理 作 用 試 料 ・AA (ng/9湿 重 量, ml) ヒ ト ラ ッ ト ニ ワ ト リ ウ シ 小腸 肝臓 腎臓 脳 血 清 尿 小 腸 肝 臓 腎 臓 脳 卵 白 乳 1.9±0.3 1.0土0.9 2.4±0.9 1.7±0.6 0.8±0.2 1.6±1.0 1.0±0.4 4.1±2.6 3.4±0.4 一:検 出 不 能 PQQは 微 生 物 の 生 育 促 進 活 性 を示 す 。 この 場 合, 全 菌 体 量 を 増 加 させ る 「ビ タ ミ ン型 」 と,誘 導 期 を 短 縮 させ る 「ホ ル モ ン型 」 が あ る が,補 酵 素 活 性 と の関 連 は 不 明 で あ る18)0植 物 に 対 して も花 粉 の発 芽 促 進 作 用 が 報 告 され て い る が そ の 生 理 的 意 味 も不 明 で あ る19)0 す で に 述 べ た よ うに,現 在 の と こ ろ動 物 の酵 素 で PQQを 補 酵 素 と して 要 求 す る も の は な い し,動 物 に お け るPQQ生 合 成 の 報 告 もな い 。 しか し動 物 は 飲 料 水 や 食 料,腸 内 細 菌 か らPQQを 摂 取 して い る 。 Killgoreら20)は マ ウ ス を離 乳 時 か らPQQを 含 まな い配 合 飼 料(腸 内 細 菌 の生 育 を抑 え るた め の 抗 生 物質 を含 む)で 飼 育 す る と,2週 間 目あ た りか ら成 長 が 遅 延 しは じめ,8週 間 後 に は20∼30%の マ ウス で 皮 膚 の 脆 弱 化,脱 毛,猫 背(骨 軟 化)な どの 症 状 が 現 れ た と報 告 して い る 。 この と き,40匹 中8匹 が 死 亡 し,う ち3匹 に は 大 動 脈 瘤,腹 腔 内 出血 が 観 察 さ れ た 。 生 化 学 的 に は,PQQ欠 乏 に よ り皮 膚 に お け る抽 出 可 能 コ ラ ー ゲ ン量 が 倍 増 し,リ シル 酸 化 酵 素 活 性 が10∼30%に 低 下 して い た。 こ の酵 素 活 性 の 低 下 が コ ラ ー ゲ ンの 成 熟 を 遅 らせ,皮 膚 の脆 弱 化,骨 軟 化 に つ な が って い る も の と思 わ れ る。 また,8∼ 9週 間PQQ欠 乏 に した 雌 マ ウス は,不 妊 に な る か 出産 直 後 に 子 ど も を 食 べ て しま う。 これ らの 症 状 は 対 照 群 で は 見 ら れ な か った し,PQQ投 与 に よ り改 善 され た 。 この よ うにPQQは 動 物 の 成 長 と生 殖 に と って 重 要 な 因 子(ビ タ ミン)か も しれ な い。 ビオ チ ンや ビ タ ミンKの よ うに 健 常 人 で はPQQ欠 乏 症 は 問 題 とな ら な い よ うで あ る が,乳 幼 児 や,長 期 間 に わ た る輸 液 あ る い は 抗 生 物 質 使 用 時 に は 考 慮 す る 必 要 が あ るか も しれ な い 。 V.薬 理 作 用 PQQはin vitroで ア ス コ ル ビ ン酸 よ り強 力 な ラ ジ カ ル ス カ ベ ン ジ ャ ー 活 性 を 示 す21)。ま た,PQQ は 四 塩 化 炭 素 やD・ ガ ラ ク トサ ミ ンな ど に よ っ て 誘 発 され る ラ ッ ト肝 障 害22)や カ ラ ゲ ニ ン惹 起 ラ ッ ト 足 浮 腫 の 発 症21),あ るい は ヒ ド ロ コル チ ゾ ン投 与 に よ る鶏 胎 児 の 白 内 障 形 成23)(表3)を 抑 制 す る 。 こ れ ら の 炎 症 は 組 織 内 グ ル タ チ オ ン量 が02な どの ラ ジ カル に よ る酸 化 ス トレス を 十 分 解 消 で き な い た め に 生 じ る と考 え ら れ て い る 。PQQがin vivoに お い て 良好 な ラ ジ カ ル ス カ ベ ン ジ ャ ー と して 機 能 す る な らば,ア ル コ ー ル 性 肝 障 害 や脳 卒 中,痴 呆 な どの 脳 の 酸 化 ス ト レス 障 害 に 対 し て も 効 果 が 期 待 され る。 ま た,糖 尿 病 性 白 内 障 に対 して もPQQの 抑 制 効 果 が 期 待 され て い る。 本 症 は 水 晶体 に 蓄 積 した グ ル コ ー ス が ア ル ドー ス還 元 酵 素 の 作 用 に よ り細 胞 外 に 排 出 され な い ソル ビ トー ル に 変 換 され,浸 透 圧 増 加 を き た して 水 晶 体 が 膨 潤,白 濁 す る こ とが 一 因 と して考 え ら れ て い る。PQQは 本 酵 素 の 阻 害 活 性 を 持 っ て い る24) 一 方,PQQ(ll.5mg/kg)を4日 間 ラ ッ トに 腹 腔 内投 与 す る と血 中 尿 素 態 窒 素 や 血 清 ク レア チ ニ ン 濃 度 が 著 し く上 昇 し,尿 中 の 蛋 白 質,糖,ケ ト ン体, 潜 血 反 応 が 陽 性 とな り腎 障 害 が 見 られ る25)0こ の と き,肝 臓 や 膵 臓 で は 大 き な変 化 は 見 られ な い が,腎 障 害 は2.9mg/kgの 投 与 で も 見 られ る。 マ ウ ス で 表3 ヒ ド ロ コ ル チ ゾ ン 投 与 に よ る ニ ワ ト リ胎 児 の 白 内 障 形 成 に 対 す るPQQの 予 防 効 果 (Nishigori H, et al 198923>) 処 置 白 内 障 の 程 度 I II III IV-V 対 照a 20 0 0 0 ヒ ドロ コ ル チ ゾ ン(0.1mg) 0 0 0 20 ヒ ドロ コ ル チ ゾ ン+PQQ(mg/卵)b (0.1) (0.5) (0.5) {1.0) 0 0 0 5 3 5 9 5 6 6 1 3 20 7 0 0 受 精 鶏 卵 の15日 目胎 児 に0.1mgの コ ハ ク酸 ヒ ド ロ コ ル チ ゾ ンを 注 入 す る と,48時 間 後 に は す べ て の 胎 児 が 白 内 障(IV-V)と な るが, PQQ投 与 に よ りそ れ が 軽 減 され る 。 数 字 は 卵 の数 。 aPQQの 代 わ りに 酢 酸 カ リウ ム を 投 与 bヒ ドロ コ ル チ ゾ ン投 与 の3 ,10,20時 間 後 にPQQ を投 与 cヒ ド ロ コ ル チ ゾ ン 投 与 の3 ,10時 間 後 の みPQQ を投 与 のPQQのLD50は 約70 mg/kgと され て い る。 な お,OPQはPQQと 同 等 あ る い は そ れ 以 上 の 薬 理 活 性 を 持 つ うえ 腎 毒 性 を 示 さ ず,LD50は 約lg/kg と高 い24)0ま た,OPQがin vivoで 神 経 成 長 因子 分 泌 促 進 活 性 を示 す こ と も報 告 され て い る26)0こ の ほ か に もPQQ及 び そ の 誘 導 体 に い くつ か の 薬 理 作 用 が 報 告 され て い るが,ま だ不 明 な 点 が 多 く今 後 の 進 展 が 期 待 され る 。
文
献
1) S. A. Salisbury, H. S. Forrest, W. B. T. Cruse,
and 0. Kennard: Nature 280, 843 (1979)
2) B. W. Groen, M. A. G. van Kleef, and J. A.
Duine: Biochem. J. 234, 611 (1986)
3) S. M. Janes, D. Mu, D. Wemmer, A. J. Smith,
S. Kaur, D. Maltby, A. L. Burlingame, and J.
P. Klinman: Science 248, 981 (1990)
4) W. S. McIntire, D. E. Wemmer, A.
dov, and M. E. Lindstrom: Science 252, 817
(1991)
5) H. Narita, and E. Morishita: J. Biochem., 117,
830 (1995)
6) G. Citro, A. Verdina, R. Galati, G. Floris, S.
Sabatini, and A. Finazzi—Agro, A.: FEBS lett.,
247, 201 (1989)
平 成7年12月(1995年)
7) S. Marini, B. Giardina, G. F. Fasciglione, and
A. Finazzi-Agro: J. Biol. Chem., 268, 13352
(1993)
8) J. P. Klinman, and D. Mu: Annu. Rev.
chem., 63, 299 (1994)
9) M. A. G. van Kleef, and J. A. Duine: FEBS
Lett. 237, 91 (1988)
10) N. Goosen, R. G. M. Huinen, and P. van de
Putte: J. Bacteriol., 174, 1426 (1992)
11) J. J. M. Meulenberg,
E. Sellink, N. H.
man, and P. W. Postma: Mol. Gen Genet., 232,
284 (1992)
12) M. Ameyama, M. Nonobe, E. Shinagawa, K.
Matsushita,
and 0. Adachi: Anal. Biochem,
151, 263 (1985)
13) J. A. Duine, Jzn. Jr. Frank, and J. A. Jongejan:
Anal. Biochem., 133, 239 (1983)
14) M. A. Paz, P. M. Gallop, B. M. Torrelio, and
R. Fluckiger: Biochem. Biophys. Res. Commun.,
154, 1330 (1988)
15) T. Kumazawa, H. Seno, T. Urakami, T.
sumoto, and 0. Suzuki: Biochim. Biophys Acta,
1156, 62 (1992)
16) T. Kumazawa, H. Seno, and 0. Suzuki:
chem. Biophys. Res. Commun. 193, 1 (1993)
17)成 田 宏 史,森 下 恵 美:モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 を 用 い たPQQ, OPQの 解 析 ・ミイ オ サ イ エ ン ス と
イ ン ダ ス ト リ ー 51,30(1993)
19
18) M. Ameyama, K. Matsushita, E. Shinagawa,
and O. Adachi: Vitamins and Hormones, (D. B.
MaCormick ed.) , 46 p. 229, Academic Press,
New York (1991)
19) L. B. Xiong, J. Sekiya, and N. Shimose: Agric.
Biol. Chem., 54, 249 (1990)
20) J. Killgore, C. Smidt, L. Duich, N. Romero—
Chapman, D. Tinker, K. Reiser, M. Melko, D.
Hyde, and R. B. Rucker: Science, 245, 850 (1989)
21) Y. Hamagishi, S. Murata, H. Kamei, T. Oki,
O. Adachi, and M. Ameyama: J. Pharm. Exp.
Ther., 255, 980 (1990)
22) A. Watanabe, N. Hobara, and T. Tsuji: Curr.
Ther. Res., 44, 896 (1988)
23) H. Nishigori, M. Yasunaga, M. Mizumura, J.
W. Lee, and M. Iwatsuru: Life Sci., 45, 593
(1989)
24)浦 上 貞 治:補 酵 素PQQ及 びPQQ誘 導 体 の 毒 性 と薬 理 作 用 につ い て 日本 農 芸 化 学 会 誌,65, 682 (1991)
