「植物機能改変技術実用化開発」
（事後評価）分科会資料
個別テーマ
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詳細説明資料（公開）
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植物で機能する有用ﾌﾟﾛﾓｰﾀｰの単離と活用
植物で機能する有用ﾌﾟﾛﾓｰﾀｰの単離と活用
奈良先端科学技術大学院大学バイオサイエンス研究科
奈良先端科学技術大学院大学バイオサイエンス研究科
新名惇彦、山川清栄
新名惇彦、山川清栄
「植物機能改変技術 実用化開発」 （事後評価）分科会 資料６－２－１１／２９
背景・目的・意義
• シロイヌナズナのゲノム解析が平成12年(2000)に完了
• 各種有用遺伝子の実用化に際しては、構造遺伝子産
物の機能解析と共に、プロモーターなど遺伝子発現の
制御領域の情報収集が不可欠である。
ゲノム解析完了に先立つ平成
11年
(1999)よりプロジェクト開始
２／２９
事業原簿 １０ページ３／２９
平成
11年度～平成15年度の成果 １
cDNAマイクロアレイを用いた発現解析
ACT2遺伝子 ACT8遺伝子 P5CS遺伝子Cy5/Cy3 = 0.5
Cy5/Cy3 = 2.0
４／２９
独立した
5,722
クローンを搭載
平成
11年度～平成15年度の成果 ２
葉特異高発現クローン
平成
11年度～平成15年度の成果 ３
５／２９
葉特異高発現クローン
(2)
平成
11年度～平成15年度の成果 ４
６／２９
７／２９
約
1.5 kb断片
平成
11年度～平成15年度の成果 ５
平成
11年度～平成15年度の成果の要約
・ シロイヌナズナの均一化cDNAライブラリーによ
るマイクロアレイ系を構築し、葉および根特異高
発現遺伝子を選択した。
・ 葉・根特異高発現遺伝子のプロモーター領域の
単離と一過性発現検定を行い、特異性・高発現
性の期待される約
180クローンを選択した。
８／２９
平成
16年度～平成17年度の研究目標
• プロジェクト前半で得られた葉および根特異高発
現プロモーターにGUSレポーター遺伝子を連結
し、形質転換植物シリーズを作成する。
• 形質転換植物を用いて各プロモーターの発現特
性を検定すると共に、植物ホルモンなどを用いて
各種環境条件下での発現変化を検定する。
• プロモーターの発現特性や各種情報を網羅した
カタログを作成し、プロジェクト内外の研究者の
利用に資する。
９／２９
事業原簿 １０ページ減圧
遮光・多湿環境（1 - 2 日）
栽培（通常環境）
減圧浸潤法によるシロイヌナズ ナの 形質 転換
菌懸 濁液 植 物体 （播 種後 3 0 - 4 0 日）種子採取
形質転換種子
感染
１０／２９
事業原簿 ３７ページ移植～2 1 日 目
図3 G U S 染色による発現部位の解析
移植植物 採取 、G U S 染色
カナマイ シン選択培地 平板培養 ナイロン メッシュ 発芽～7 日 目 G M 培地、斜面 培養発現 組織 の特 定
観察
再スクリーニング 種子採取１１／２９
葉特異プロモーター
多くは葉身部全面 ：光合成、光化学系
葉脈のみ
根特異プロモーター
維管束 ：代謝、細胞構造
表 皮 ：ストレス、傷害応答（部位は不規則、外部要因で変動
根 端 ：転写、細胞増殖（活性は低いが特異性高い）
解析したプロモーターの要約
（一部は平成15年度までに終了）
植物への感染
一次スクリーニング
GUS解析
葉特異プロモーター
69
51
44
根特異プロモーター
61
44
45
合
計
130
95
89
１２／２９
１３／２９
１５／２９
１７／２９
光学顕微鏡による
GUS発現観察 （R5：側根発達部、機能未知）
側根発生初期より発生部の維管束全体、根端では発現しない
主根
側根
R5 の側根での発現の連続縦断面観察
主根維管束から側根維管束の境界で強い発現
１９／２９
R40（機能未知）の連続縦断切片の発現解析
側根発生初期より発現、主根の表皮、皮相の始原細胞
根端では表層、基部の細胞伸長が盛んな部位では表層から中心柱でも発現
２１／２９
R23 (fructokinase) はIAA処理により発現低下
（
7日後）
R28 （機能未知）はIAA処理（７日後）により特に根端で発現上昇
２３／２９
R55 (DEAD box RNA helicase) はIAA処理後、維管束を中心に発現低下。
収録内容
１７９系統：
cDNAマイクロアレイデータ、DNA配列情報
葉、根特異的プロモーター８９系統：一過性発現活性、GUS histochemistry
各種データベースにリンク
２５／２９
事業原簿 ３７ページ平成
16年度～平成17年度の研究の要約
• プロジェクト前半で選抜したプロモーター群について、そ
れらを導入した形質転換植物シリーズを作成した。
• 形質転換植物シリーズを用いて各プロモーターの発現特
性を詳査すると共に、植物ホルモンなど各種環境条件下
での発現変動を検定した。
プロモーター群を導入した形質転換植物シリーズを揃えるこ
とにより、実用化の際に必要な各種環境条件下での
プロモーター特性の検証が容易となった。
プロモーター解析は広く行われているが、
組織的に大量の
プロモーターを解析した最初の例である。
２６／２９
事業原簿 ３７ページ目標達成度
以上を総合して、既存のデータ ベースともリンクさせたプロモー ターカタログを作成した。100
プロモーターカタログの作成 葉特異的プロモーターでは、葉身 全面または葉脈のみで発現するも の、根特異的プロモーターでは、 維管束、表皮、根端など、特異的 に発現するものを得、それぞれの 機能と関連づけた。IAA処理により プロモーターごとに特徴的なパ ターンを観察した。100
GUS histochemistry法によるプロ モーター発現特性の解析 葉、根特異的プロモーター/GUS融 合遺伝子130系統をシロイヌナズナ に導入し、最終的に葉、根それぞ れ特異的プロモーターを保有する 44系統および45系統を取得した。100
プロモーター/GUSレポーター遺伝子 をシロイヌナズナに導入論拠
達成度
（％）達成目標
２７／２９
誌上発表論文 ・山川清栄、河内孝之、シロイヌナズナの遺伝子プロモーターの系統的解析 BIO INDUSTRY Vol. 19, No.9: 16-27 (2002)・山川清栄、河内孝之、シロイヌナズナの遺伝子プロモーターの系統的解析 環境修復と有用物質生産（シーエムシー出版）第III部第3章 (2003)
・Kohei Ando, Seiyei Yamakawa, Kyoko Miyashita, Kazuya Yoshida, Akiho Yokota, Atsuhiko Shinmyou, and Takayuki Kohchi: Efficient construction of cDNA microarrays utilizing normalized cDNA libraries of Arabidopsis thaliana, Journal of Bioscience and Bioengineering, 97 (1) : 85-88 (2004)
・山川清栄、河内孝之、吉田和哉、新名惇彦、マイクロアレイを用いた植物プロモーターの網羅的探索 BIO INDUSTRY Vol. 21, No.12: 51-63 (2004)
・Seiyei Yamakawa, Kohei Ando, Aya Chisaka, Kazuya Yoshida, Atsuhiko Shinmyo, and Takayuki Kohchi: Systematic transient assays of promoter activities for leaf-specific genes identified by gene-expression prpfiling with cDNA microarrays in Arabidopsis thaliana, Journal of Bioscience and Bioengineering, 98 (2): 140-143 (2004)
・Seiyei Yamakawa, Kohei Ando, Kazuya Yoshida, Akiho Yokota, Atsuhiko Shinmyo and Takayuki Kohchi: Phylogenetic profiling of Arabidopsis genes by monitoring spatial gene expression using cDNA microarrays, Plant Biotechnology, 22(1): 55-58 (2005)
学会口頭発表： 7件
