Title
Use of PCR and Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel
Electrophoresis Techniques for Differentiation of Prevotella
intermedia Sensu Stricto and Prevotella nigrescens( 内容の要旨
(Summary) )
Author(s)
Premaraj, Thyagaseely
Report No.(Doctoral
Degree)
博士（医学）甲 第452号
Issue Date
2001-03-24
Type
博士論文
Version
URL
http://hdl.handle.net/20.500.12099/14670
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氏名 (本籍) 学位の種類 学位授与番号 学位授与日付 学位授与の要件 学位論文題目 審 査 委 員 Premaraj Thyagaseely(スリランカ) 博 士(医学) 甲第 452 号 平成13 年 3 月 24 日 学位規則第4条第1項該当
Use of PCR and Sodium DodecylSu暮fate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis Technjques for Differentiation of伽vote舶k7termedib Sensu Stricto and什evoteNb njdrescens
(主査)教授 渡 連 邦 友 (副査)教授 江 崎 孝 行 教授 立 松 憲 親 論 文 内 容 の 要 旨 P柁UO亡eJgαよ花￡eJme(Ziαは偏性嫌気性グラム陰性梓菌で,全身各部位の化膿性複数菌感染症に関係しているほ か,歯周病病原体の一つとして示唆されている｡近年,P.i花￡en≠e(Zぬ(広義)が遺伝学的に異質な集団である ことが明らかにされ,P.よ几￡emedぬ(狭義)とP柁UO亡e〃α几な柁ぶC飢ぶ(新種)に再分類された｡従って,これ
までぞ.よ融mediαが関係すると考えられていた疾患のこれらの2菌種との関連性について再考の必要性が生じ
そのため両菌種の簡便,迅速,且つ正確な鑑別法の開発が必要となった｡ そこで,申請者は,16SrRNAのシークエンスから作製したプライマーを用いるPCR(Polymerase chain reaction)法の応用を計画し,これまで報告されたAP-PCR法による方法やSDS-PAGE法と比較検討を行うとと もに,一般検査室でも利用可能とされていた簡易鑑別法であるリパーゼ試験の信頼性を検討した｡ 方 法 使用菌株:当施設にて遺伝学的手法を用いない従来の同定法に準拠し同定されていたP.よ几とe′medよαの174株を用 いた｡P.intennediaATCC25611とP.nigrescensATCC33563のタイプを含む61菌種61株の参考菌株と59種59 株の臨床分離株も使用した｡ PCR法:1)16SrRNAシークエンスから決定したP.intennedia用のプライマー(以下16Sプライマーと呼ぶ) PiPlとPiP2,P.nigrescens用の16SプライマーPnRlとPnR2を作製し使用した｡2)GuilletらによるAP-PCR法 のためのP.intennedia用のプライマーPi754-1とPi754-2,P.nigrescens用のPnllOO-1とPnllOO-2を作製して使 用した｡3)1および2)で使用したプライマーを使用して,Multiplex PCR法をも実施した｡ SDS-PAGE法:参考菌株を含む50株について,定法に従って行った｡ リパーゼ試験:エッグヨーク寒天培地を用いて行った｡最終判定は10日間の嫌気培養後に行った｡ 結果と考察 16Sプライマpを用いたPCR法で,P.intennediaとP.nigrescensではそれぞれ267bpと301bpの増幅産物を得 た｡しかし,その他のいづれの菌種菌株でも増幅産物は得られなかった｡また,AP-PCR法で,P.inteTmedia とP.几な柁SCeJ乙Sはそれぞれ900bpと1100bpの増幅産物を得た｡従来の同定法でP.よ花とemledよαと同定されていた 174株について,これらのPCR法を行ったところ,いずれの方法でも,P.i花￡e/mediα97株,P.花なreβCe那75株, 同定不能2株となり,全く同一の成績が得られた｡同定不能の2株は新種の可能性があると考えられた｡ 次に,Multiplex PCR法を行ったところ,AP-PCR法では両菌種の増幅産物が得られたが,16SプライマーPCR 法では,両菌種の増幅産物を同時に得る条件の設定は困難であり,応用のための検討の余地を残した｡一方,SDS-PAGE法では,参考菌株のP.intennediaとP.nigrescensは,それぞれ60kDaのタンパクバンド, 61kDaと58KDaのバンドを生じ区別できた｡しかし,PCR法でP.inteT7nediaと同定された30株の検討では,4 株がP.几な柁ぶC飢βと誤同定された｡また,リパーゼ試験は,参考菌株を加えたP.i肋medぬとP.几な柁SC飢ぶで 1株を除きすべて陽性であった｡陰性の1株はPCR法で陰性であった｡その信頼性はなかった｡ 以上のことから,16SrRNAから作製した16Sプライマーを用いるPCR法は2菌種の鑑別に有用であることが明 らかになった｡また,SDS-PAGE法は2菌種の鑑別法としては問題があり,リパーゼ試験はその鑑別法として不 適であることが明らかになった｡
論文審査の結果の要旨
申請者 Premaraj Thyagaseelyは,Preuotellaintennediaが,P.inteTmedia(狭義)とP.nigrescens(新 種)とに再分類されたことに伴う両菌種の正確な同定法と簡便,迅速,信頼性のある鑑別法として16SrRNAか ら作製したプライマーを用いるPCR法について検討し,それが極めて特異性の高い,信頼性の高い鑑別法であ ることを明らかにした｡また,型別の目的で広く用いられるSDS-PAGE法は菌種の鑑別法としては問題があり, リパーゼ試験は菌種の鑑別に不適であることを明確に示した｡この成果は嫌気性菌学の分野の発展に寄与すると 認める｡ [主論文公表誌]Use of PCR and Sodium DodecylSulfate-Polyacrylamide GelElectrophoresis Techniques for Differentiation ofPreuotellaintennediaSensu Stricto andPreuotellanigrescens
Journalof ClinicalMicrobiology37(4):1057∼1061,1999
