博 士 （ 医 学 ） 伊 藤 裕 子
学位論文題名
N ー linked neutral oligosaccharides in the stratum corneum of normal and ichthyotic skin
（正常及ぴ魚鱗癖皮膚の角層におけるN 結合型中性オリゴ糖鎖）
学位論文内容の要旨
オ リ ゴ 糖 鎖 は 、 細 胞 問 相 互 作 用 や細 胞 の 分化 の 過 程で 重 要 な役 割 を 担う こ と が 知ら れ る 。 ボ リ ペ プ チ ド の ア ス パ ラ ギ ン 残 基 へ のN結 合 型 オ リ ゴ 糖 鎖 の 付 加は 、 タ ンバ ク の 翻 訳後 修 飾 の う ち 最 も 頻 度 の 高 い も の で あ る が 、 皮 膚 の 角 層 に お け るN結 合型 オ リ ゴ糖 鎖 は 、 まだ 詳 細 に研究されていない。
N結 合 型 オ リ ゴ 糖 鎖 は 、 マ ン ノ ー ス 、 ガ ラ ク 卜 一 ス 、N‑ア セ チ ル グル コ サ ミ ン、N‑アセ チ ル グ ル コ サ ミ ン 酸 の 組 み 合 わ せ に よ り高 度 な 多様 性 を 持ち 、 糖 タン パ ク の細 胞 内 局 在、 細 胞 外 分 泌 、分 解 な ど の調 節 を 行う と さ れる 。 従 来、 腫 瘍 や膠 原 病 など ヒ 卜 の各種疾 患におい て、
N結 合 型 オ リ ゴ 糖 鎖 構 造 の 変 化 が 存 在 す る こ と が 報 告 さ れ て い る。 表 皮 にお け る オ リゴ 塘 鎖 の 重 要 性は 、 オ リ ゴ糖 鎖 に 結合 す る レク チ ン や抗 体 を 用い て 以 前か ら 研 究が行わ れてきた が、
レ ク チ ン や 抗 体 は 、 糖 タ ン バ ク あ る い は 糖 脂 質 の オ リ ゴ 糖 鎖 中 の2〜3糖 残 基 を 認 識 す る の み で あ り 、 オ リ ゴ 糖 鎖 の 全 体 の 構 成 を把 握 す るこ と は 困難 で あ った 。 そ こで 我 々 は 、正 常 及 び 魚 鱗 癬 皮 膚 の 角 層 に お け るN結 合 型 オ リ ゴ 塘 鎖 の 構 造 を 、 高 速 液 体 ク ロ マ 卜 グ ラ フ ィ −
（HPLC）を用いて解析を試みた。
正 常 コ ン ト 口 ― ル と し て は 、 良 性 皮 膚 腫 瘍 の 摘 出 術 を 受 け た患 者3名の 、 手 掌 ある い は 足 蹠 以 外 の 正 常 皮 膚 を 用 い た 。 魚 鱗 癬 患 者 は 非 水 疱 型 先 天 性 魚 鱗 癬様 紅 皮 症患 者3名 及び 葉 状 魚 鱗 癬 患 者2名 で 、 い ず れ も 下 腿 の 鱗 屑 を 用 い た 。 当 研 究 は 北 海道 大 学 の医 の 倫 理 委員 会 の 承認を得、全ての被験者からは書面で説明を行い同意を受けた。
正 常 皮 膚 は60℃ のPBSを 用 い て 表 皮 と 真 皮 に 分 離 し 、 全 て の 検 体 はlOOmMの 重 炭 酸 ア ン モ ニ ウ ム を 用 い て 変 性 し た 後 に ハ サ ミで 細 か く刻 ん だ 。ク 口 口 フォ ル ム とメ タ ノ ― ルを 用 い て 脱 脂 を 行 っ た 後 、Trypsin及 びChymotrypsin処 理 に よ ル タ ン バク を ポ りペ プ チ ドレ ベ ル ま で 分 解 し 、N‑GlycosidaseFに よ ルポ リ ベ プチ ド か らオ リ ゴ 糖鎖 を 遊 離 させ 、Pronaseに よ ルポ リ ペ プ チ ド を ア ミ ノ 酸 レ ベ ル ま で 分 解し た 。Bio‑Gel‑P4カ ラ ムを 用 い て 糖鎖 と ア ミノ 酸 を 分 離 し、糖 鎖分画を2‑aminopyridineを 用いて 標識（PA化 ）し、 過剰の2‑aminopy ridineはSephadex G‑15カ ラ ム を 用 い て 除 去 し た 。 以 上 の よ う に し て 作 成 し たPAオ リ ゴ 糖 は 、0．OINの 塩 酸 を 用 い て シ ア ル 酸 を 遊 離 し 、 重 炭 酸 ア ンモ ニ ウ ムで 中 和 した 。PAオ リ ゴ 糖をamide‑silicaカ ラ ムを用いて精製した後、ODSカラムを用いて分析した。
魚 鱗 癬 皮 膚 のN結 合 型 オ リ ゴ 糖 鎖 は 正 常 皮 膚 と 比 較 し て 、 複 合 型 オ リ ゴ 糖 鎖 に 相 当 す る 15.8分 及 び18.8分 に 溶 出 す る 分 画 が 増加 し て おり 、26.9分 に溶 出 す る 分画 が 滅 少し て い た。
これらの分画は、各々
a： Gaipi，4GlcNAcf31，2Manal，3 (Gaipi，4GlcNAcpi，2Manal，6)Manpi，4GlcNAc{31,4GlcNAc， b： Gaipi， 4 GlcNAc31， 2Manal， 3(Manal， 6)Manf31， 4GlcNAcpi， 4 GlcNAc c：Gaipi，4GlcNAcpi，2Manal，3(Gaipi，4GlcNAcpi，2Manal，6)Manpi，4GlcNAcpi，4(Fucal，3)GlcNAc に相当すると考えた。
分 画aは 、 ヒ 卜 の 血 漿 中 に 存 在 す る ― 般 的 なN結 合 型 オ リ ゴ 糖 鎖 で あ り 、 分 画bよ り 糖 転 移 酵 素GnT‑II活 性 に よ り 合 成 さ れ る 。 ま た 分 画cは 、 分 画aよ り 糖 転 移 酵 素Fut8活 性 に よ り 合 成 さ れ る 。 こ の た め 魚 鱗 癖 皮 膚 で は 、GnT‑II及 びFut8活 性 が 低 下 し て い る と 推 測 し た 。 魚 鱗 癬 皮 膚 と 正 常 皮 膚 と の 間 に は、 複 合 型オ リ ゴ 塘鎖 の 構 造に 差 異 が見 ら れ た が、 高 マ ン ノ ー ス 型 オ リ ゴ 糖 鎖 に は 変 化 が な か った 。 高 マン ノ ー ス型 オ リ ゴ糖 鎖 は 、主 に 細 胞 質と デ ス モ ソ ー ム に 分 布 す る こ と が 知 ら れ て おり 、 こ の知 見 は 、魚 鱗 癖 皮膚 に お いて は 、 細 胞質 及 び
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デスモソームに存在するN 結合型オリゴ糖鎖よりも、細胞表面に分布するN 結合型オリゴ糖 鎖の方がより障害されていることを意味すると考えた。
魚鱗癖皮膚における
N結合型オリゴ糖鎖構造の変化は、皮膚の角化におけるN 結合型オリ ゴ糖鎖の役割について示唆するものと考えた。
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学位論文審査の要旨
学位論文題名
N ― linked neutral oligosaccharides in the stratum corneum of normal and ichthyotic skin
（正常及び魚鱗癖皮膚の角層におけるN 結合型中性オリゴ糖鎖）
オリ弍暗鎖の付加は、タンソくクの翻訳後修飾のうち最も頻度の高いものであるが、皮膚の角層におけるN 結合型オリゴ糖鎖は、まだ詳細に研究されていなレ丶。
N結 合型オ リゴ糖 鎖は、 マンノース、ガラクトース、N‑アセチルグルコサミシ等の組み合わせにより高 度な多掲牲を持ち、糖タン／くクの機能に深く関与する。従来、腫瘍などヒトの名爾邑突患において、N結合 型 オリ司瞎鎖構造の変化が存在することが報告されている。表皮におけるオリゴ糖鎖の重要陸は、オリゴ 糖 鎖に結合するレクチンや抗体を用いて以前から研究が行われてきたが、レクチンや抗体は、糖タンパク あ る い は脂 質 の オ リj'A鎖中の2〜3糖 残基を認 識する のみで あり、 オリa睹 鎖の全 体の構 成を把 握す る ことは 困難であ った。 そこで申請者は、正常及び魚鱗癬皮膚の角眉におけるN結合型オリゴ糖鎖の構造 を 、 高 速 液 体 ク ロ マ ト グ ラ フ イ ー(HPLC)に よ る2次 元 マ ッ ピ ン グ 法 を 用 い て 解 析 を 試 み た 。 正 常コン トロー ルとし ては、良性皮膚腫瘍の摘出術を受けた患者3名の、正常皮膚部分を用いた。魚鱗 癬患者は非水疱型先天性魚鱗病弱諦ニ皮症患者3名及乙麟亂犬魚鱗癬患者2名で、いずれも下腿の鱗肩を用い t:o検 体は、 糖タン パクを 抽出し た後、酵 素反応 によりN結合型オリゴ糖鎖を遡難させ精製し、糖鎖分画 を2‑aminopyridineを用 いて螢 光標識(PAイ匕） し、ODSカラム及びAmideカラムの二種類のカラムを用い て分析し、両分析の結果から2次元マッピング法により構造を決定した。
魚 鱗癬鬩 青のN結 合型オ リゴ糖 鎖は正常 皮膚と 比較して、以下のa丶bの構造が増加し、cの構造が減少 していた。
aニ Gaipi，4GlcN Acp1皿 恤1，3くG都1，4GlcNAcp12ぬ 恥1， ） 恤p1，4Gld岨cp1，4GlcNAc， b：G出p1，4GlcNAcp12M簡n13（MaI弧1，6〕nIanp1コ4Gld岨．cp1，4Gld乢へc
c： 制p1，4GlcNAcp12〜 伽 弧1，3刪p1，4GlcNAcp1，2ぬ 弧1触 恤p1，4Gl泓cpl，4m贓1，3）cNAc 構 造cは、 ヒトの 血漿中に 存在す る一般 的なN結 合型オ リゴ糖 鎖であ り、構 造bより糖転移酵素GnT−nに よ り、ま た構造aより糖転 移酵素FuT8によ り合成 される。 このた め魚鱗 癬皮膚では、GnTーH及ぴFuT8の 発現あるいは活性が低下していると推測した。
魚 鱗癬皮 膚と正 常皮膚 との間には、N結合型オリゴ糖鎖の構造に差異が見られたが、水疱型先天陸魚鱗 癬 様紅皮症と葉状魚鱗癬との間には、明らかなオリゴ糖鎖溝造の変化を認めなかった。魚鱗癬皮膚におけ るN結 合 型 オ リ ゴ 糖 鎖 構 造 の 変 化 は 、 遺 伝 性 角 イ 断 生 疾 患 の 病 態 解 明 の 一 助 と なる と 考 え た。
副 査の岩永敏彦教授からは、魚鱗癬皮膚の角層と正常皮膚の表皮とを比較する事の妥当性について、ま ―307―
次 彦
宏
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畠 岩
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授 授
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教 教
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査 査
査
主 副
副
た従来皮膚科疾患において糖鎖構造解析を行なった例があるかどうかとの質問があり申請者は最初の質問 に、マウスでは今回検出した糖鎖構造については角層と表皮の間で差がないというデータがあるので、ヒ トにおいても同様と考えたこと、次の質問には本研究が皮膚疾患で糖鎖構造を解沂した初めての例である ことを回答した。副査の清水宏教授からは今回の結果を今後どのように発展させていくかという質問があ り、申請者は今後酵素の発現角耽斤などを行い、その詳しい機序を明らかにする必要があると考えると回答 した。主査の畠山鎮次教授からは、他の疾患において今回の結果とは逆に、FuT8及びGrlT．uの発現あるい は機能が上がった例はあるかという質問があったが、申請者は知り得る範囲ではそのような知見はなかっ たと回答した。
こ の論文は、皮膚疾患におけるN結合型オリョ睹鎖の構造変化を初めて明らかにした研究である点が高 く 評 価 さ れ 、 今 後 、 そ の i鞴 ロ に つ い て 明 ら か に し て ゆ く こ と が 期 待 さ れ る 。 審査員一同は、これらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑚や取得単位なども併せ申請者が博 士（医学）の学位を受けるのに充分な資格を有するものと判定した。
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