受精卵におけるKI が困難な理由は⼤きく２つに分けられる

(1)

⻑鎖（約6 kb）lssODNおよびCRISPR / Cas9を⽤いたヒト科霊⻑類特異的

lncRNAのマウス受精卵へのエレクトロポレーションによるノックイン

近藤星

(2)

緒⾔

近年, clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR

associated proteins 9 (CRISPR/Cas9) をはじめとした遺伝⼦編集技術の急速な発展に伴い, 従来よりも短期間で, より簡便かつ効率的に遺伝⼦改変動物を

作製することが可能になった. しかし, 標的部位を特定配列に改変するKnock- in (KI) の作製は⽬的の遺伝⼦を破壊するKnockout (KO) に⽐べると未だ効率が低く, 特に受精卵におけるKIは困難である^{1, 2)} .

受精卵におけるKI が困難な理由は⼤きく２つに分けられる.

まず, 組換え効率の問題である.

哺乳動物細胞においてはnon-homologous end-joining（NHEJ）が主要な DNA double-strand breaks（DSBs）修復経路であり, homologous

recombination（HR）よりもNHEJによる修復の⽅が起こりやすいことが知

られている^3-6) . このため, 哺乳動物の受精卵において, HRを利⽤するKI は NHEJを利⽤したKOよりも効率が低い.

もう１つは, 導⼊効率の問題である.

KIのすべての⽅法では, DSBsを起こすためのCas9タンパクなどの⼈⼯ヌクレアーゼに加えて, ドナーDNAを前核内まで送達する必要がある. その際, 哺

(3)

乳動物の受精卵に存在する透明帯などの膜が物理的障壁となり, ⼈⼯ヌクレア

ーゼやドナーDNAの導⼊を困難にしている⁷⁾.

この透明帯は, 哺乳動物の受精卵の⼀番外側に存在する糖タンパク質のマトリックスでできた膜である. 哺乳動物の受精卵には, この透明帯と卵細胞膜, そして核膜が存在し, これらが導⼊時の物理的障壁となっているため, ドナーDNA のサイズが⼤きくなるほど, その導⼊は困難になる.

マイクロインジェクション法は, これらすべての物理的障壁を顕微鏡下の細い

ガラス針で通過し, ⼤きなDNA断⽚であっても⼈⼯ヌクレアーゼとともに胚の前核に直接注⼊することができるため, 受精卵への⻑鎖遺伝⼦のKIでは主流の⽅法である. しかし, マイクロインジェクションを⾏うためには, ⾼価な機器や⼿技の習熟が必須であり,さらに熟練者であっても作業には⼀定以上の時間

と労⼒がかかる. また, ⼀度に操作できる受精卵の数は限られる^{2, 7-10)}. このため, エレクトロポレーションを⽤いた遺伝⼦導⼊法がその簡便さと, 短時間で遺伝⼦を⼀度に導⼊できる受精卵の数の多さ, 費⽤の安さなどから, ゲ

ノム編集のもう⼀つの選択肢として使⽤されている^{7, 10)}.

しかし、エレクトロポレーションを⽤いた⻑鎖遺伝⼦のKIは, マイクロインジェクション法に⽐べ, ⾮常に困難である2, 7, 8, 11). エレクトロポレーション法

(4)

は電気の作⽤により細胞に微⼩な⽳をあけることで, そこから遺伝⼦を導⼊する⽅法である.

従来のエレクトロポレーションでは, 受精卵へ⼤きなダメージを与えずに透明帯と細胞膜に⽳をあけ, そこから遺伝⼦を導⼊することは困難であった. 受精

卵をTyrod酸で前処理し, 透明体を弱めることで導⼊効率が向上する報告もあ

る¹²⁾が, これは⼿順が煩雑になるだけでなく, 胚の発⽣⾃体に影響を及ぼす可

能性がある^{13, 14)} .

Technique for animal knockout system by electroporation (TAKE法)の開発により, 透明帯を前処理せずに, エレクトロポレーションを⽤いてラット受精

卵にZFN, TALENおよびCRISPR/Cas9などを導⼊し, KOラット作製に成功したことが報告された¹⁰⁾. また, TAKE法とCRISPR/Cas9, single-stranded oligodeoxynucleotides (ssODN)を利⽤すれば, 短い遺伝⼦であればマイクロインジェクション法に匹敵する効率で, 正確なKIが得られたとの報告もある⁷⁾.

⼀⽅, 今⽇まで1.1 kbを超える⻑鎖遺伝⼦の受精卵へのKIは, エレクトロポ

レーションでは報告されていない^{7, 15)}.

そこで本研究では, ヒト科霊⻑類特異的long-noncoding RNA(lncRNA)である urothelial cancer-associated 1 (UCA1)を, CRISPR/Cas9システムおよびlong

(5)

single-stranded oligodeoxynucleotides (lssODN)を⽤いて, エレクトロポレーションによりマウス受精卵に導⼊し, 通法では困難な⼤きなDNA断⽚(約６kb) をKIすることを⽬的とした.

材料と⽅法

1. 実験動物

精⼦および卵採取に⽤いたマウスはB6D2F1/Slcであり, 精管結紮マウスおよび移植の仮親はSlc:ICRマウスを⽤いた。いずれのマウスもJapan SLC (静岡,

⽇本) から⼊⼿した.

全てのマウスに標準的なペレット⾷および⽔道⽔を⾃由に摂取させ, 温度と湿度, 明暗周期を制御した部屋で飼育した. 本研究で⾏われた全てのマウスの飼育および実験は, 岡⼭⼤学の動物実験ガイドラインに従っており, 岡⼭⼤学動物実験委員会承認（承認番号：OKU-2018025, OKU-2019502）および岡⼭⼤

学組換えDNA実験安全委員会承認（承認番号：14095）を受けている.

2. Cas9 タンパク質とsingle-guide RNA (sgRNA)

(6)

Cas9 タンパク質は, Guide-it^TMRecombinant Cas9 Nuclease (Takara Bio

USA, CA, USA）を使⽤した. mRosa26遺伝⼦を標的とするようにgRNA

(T7Rosa26gTemp) を設計し, gRNA発現プラスミド(Thermo Fisher Scientific, MA, USA)に組み込んだ (図1A, B). このプラスミドを制限酵素 (KpnI) 処理し, T7 RNA polymeraseを⽤いて, Guide-it^TMsgRNA In Vitro Transcription and Screening Systems User Manual (Takara Bio USA）に従ってsgRNAを合成した.

3. Long ssODN

製造業者のプロトコルに従って, lssODN調製キット（Biodynamics

Laboratory, 東京, ⽇本）およびIn-Fusion HDクローニングキット（Takara Bio）を使⽤した. PCMV-UCA1発現カセットとその両端の1.5 kbの相同性アームを含むDNA断⽚を, HRによってpcDNA3.1の2つの制限酵素部位

（BsrDI）の間に組み込んだ. 得られたプラスミドをニッキングエンドヌクレ

アーゼNb.BsrDIで消化した. ⽬的とするDNAのバンドをアガロース電気泳

動により分離し, ゲルから切り出し, 精製してlssODNを得た（図2A, B）.

(7)

4. ⼈⼯授精と胚の培養

B6D2F1/Slc成熟雄マウスからの精⼦を, TYH培地 (LSI Medience, 東京,⽇本) 中に懸濁し, 37℃で1.5時間培養した.

B6D2F1/Slc成熟雌マウスを, pregnant mare serum gonadotropin (PMSG：

Aska Animal Health, 東京,⽇本) およびhuman chorionic gonadotropin (Aska Animal Health) の注射により過剰排卵させた。. 次に,採取した前核期胚をKSOM培地 (ARK Resource, 熊本,⽇本) 中で37℃で0.5時間培養した.

この培養ドロップに前培養した精⼦懸濁液を添加し, 媒精した. M16培地

(Sigma-Aldrich, MO, USA) 中で37℃で3時間培養後, 受精卵を洗浄しエレクトロポレーションに使⽤した.

5. エレクトロポレーション

受精卵およびsgRNA/Cas9/DNA (100 ng/µl each)を含む50 µl Opti-MEM (Thermo Fisher Scientific) を電極溝に⼊れ, NEPA21 Super Electroporator (Nepa Gene, 千葉, ⽇本) を⽤いて, TAKE法に従ってエレクトロポレーションを⾏なった. ⼀晩培養して分裂した２細胞期胚を偽妊娠雌に移植した.

6. ゲノムDNAの分離

(8)

産仔の尾と指のサンプルをプロテナーゼKで37℃で⼀晩インキュベートし, フェノール・クロロホルム抽出またはDNeasy Kit (Qiagen, Hilden, Germany) を使⽤してゲノムDNAを得た.

7. PCR分析

テンプレートDNA（1 µL/10 µL）, プライマー (表1) およびDNAポリメラーゼ (表2) を含むPCRバッファーで実施した. 使⽤したDNAポリメラーゼの各製造元 (Takara BioおよびTOYOBO)のプロトコルに従って, 表2に⽰す条件下でPCRを⾏った.

8. dual-labeled Real-time PCR

Luna Universal Probe qPCR Master Mix (New England BioLabs, MA, USA) を使⽤して, New England BioLabsのプロトコルに従って, テンプレート DNA（2 µL/20 µL）, プライマーおよびプローブを使⽤して⾏った (表3) .

9. シークエンス解析

pGEM-T Easy Vector System (Promega, WI, USA) にクローニングされた PCR増幅断⽚ (図3D, F, 図4) およびQIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen)

(9)

で精製された産仔＃22の断⽚ (図3B) は, ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, CA, USA) , BigDye terminator v3.1 cycle sequencing kit (Thermo Fisher Scientific) およびSpin sequencing reaction cleanup (Sigma-Aldrich) を使⽤してシークエンスを⾏った.

結果

1. KI変異マウスの同定

マウスRosa26A遺伝⼦座での全⻑lssODN（約6 kb）のKIを確認するため

に, 産仔＃16-27および＃41-67のPCRを実施した（図3A, 表1）. 以下, 番号付けは, 産仔および産仔から得られたDNAサンプルを⽰す.

PCMV−UCA発現カセットを含む領域を標的とするPCR（図3B）により, ＃ 22, ＃23および＃60において⽬的のバンド（3.3 kb）が認められた.

次に, KIの可能性が⾼い＃22, ＃23および＃60がトランスジェニックマウスではなく, 標的部位に完全⻑lssODNが正確に挿⼊されたKIマウスであることを確認するためのPCRを⾏った.

(10)

PCRは, KI領域の外側からUCA1内側までの領域, およびUCA1内側からKI 外側までの領域をターゲットとして⾏った（図3C）. ＃22および＃23では,

⽬的のバンド（3.9, 2.5 kb）が, 5 'および3'末端の両⽅で認められた. ＃60ではバンドは検出されなかった. しかし, WTにも同様の⻑さのバンドが認められ

たため, 鑑別のために, 図3CのPCR産物をテンプレートとして使⽤して, UCA1挿⼊遺伝⼦内の短いnested PCR（図3D）を⾏った.

＃22および＃23は, 5 'および3'側の両⽅で⽬的のバンド（300 bp）を⽰した.

＃60においても⽬的のバンドが認められた. WTには⽬的のバンドは認めな

かった. KI領域の外側から挿⼊されたUCA1遺伝⼦までの⻑いバンドが5 'お

よび3'側の両⽅で観察されたため, ＃22および＃23はKIであることが確認さ

れた. nested PCRにおいて, WTでは⽬的のバンドを認めなかったため, 図3C でのWTのバンドは⾮特異的増幅と⾒なされた. ＃60では⻑いバンドは認めなかったが, nested PCRはUCA1遺伝⼦の挿⼊を⽰唆した.

次に, KI領域の外側からアームとpcDNA3.1の接合部までの領域を標的とするPCRを実施した（図3E, G）. ＃22, ＃23および＃60では, 5 '側と3'側の両⽅に約2 kbの⽬的のバンドが認められた. ＃60では, WTには⽬的のバンドを認めなかった（図3G）. しかし図3Eでは, WTにも同様の⻑さのバンドが認められた. このため, 先ほどと同様に, アームの接合領域を標的とする

(11)

nested PCRを⾏い（図3F）, ＃22および＃23は5 'および3'末端の両⽅で⽬

的のバンド（430および320 bp）を確認した. WTでは⽬的のバンドは観察されなかったため, 図3E におけるWTのバンドは⾮特異的増幅とみなされた.

さらに, ＃60は, アームの接合領域をターゲットとするPCRにおいて, 5 'およ

び3'側の両⽅で⽬的のバンド（214 bp、310bp）が確認された（図4）.

＃22および＃23は, 図3Aに⽰すすべての領域のPCRで⽬的のバンドを認めたため, 全⻑lssODNがノックインされていることが確認された.

＃60は, 図3Cを除く他のすべてのPCR領域 (図3A) で⽬的のバンドを⽰した. さらに, ＃41-67産仔について, ゲノムDNA 1モル中に挿⼊されたUCA1 遺伝⼦のモル数を測定するdual-labeled Real-time PCRを⾏った結果, ＃60 は他の産仔と⽐較して最⾼値を⽰した（図5）.

以上から, ＃60も全⻑lssODNがノックインされていることが確認された.

2. KI遺伝⼦配列の検出

PCRにより全⻑lssODNの挿⼊を確認した後, ＃22, ＃23および＃60についてシークエンス解析を⾏った.

図3B, C, E, Gで確認された⻑いバンドのクローンを作製することは困難であ

った. このため, 図3D, F, 図4に⽰す⽬的のバンドをTAクローニングし, 遺

(12)

伝⼦配列を解析した. ＃22, ＃23および＃60は, 5 'および3'末端の両⽅のアームの接合領域で, 正確な結合を⽰すことが確認された（図6B–E）. さらに, ＃ 22, ＃23および＃60は, 挿⼊されたUCA1内部の正確な配列を⽰した（図 6F）.

次に, ＃22について, 図3Bで確認された3.3kbのバンドのダイレクトシークエンスを⾏った. 5 '側には, アームとpcDNA3.1の接合部を経てCMVプロモーターに⾄る正確な配列が確認された（図7B）. 3 '側には, アームと

pcDNA3.1の接合部, およびpcDNA3.1とUCA1の接合部に⾄る正確な配列が確認された（図7C）. さらに, 5 'および3'末端の両⽅において, pcDNA3.1と UCA1の接合部は正確な配列を有していた（図7D、E）. 図3C, E, Gで確認された⻑いバンドは, ダイレクトシークエンスには⼗分な収量が得られなかった.

以上より, ＃22, ＃23および＃60は, 図7Aに⽰す領域にlssODN配列が正確に挿⼊されていることが確認された.

考察

(13)

エレクトロポレーションにおける電気パルス強度は, 受精卵が損傷を受けず,

⾃⼰修復できる程度に制限される. この制限により, ⼤きなDNA断⽚が受精卵内へ⼊るために必要なサイズの通過孔が作られない場合がある. さらに、ドナ

ーDNAが⼤きく, 導⼊電圧が制限された場合, 細胞質内のDNA断⽚の電気泳動移動度は低下する. したがって, 核に移動するまでに時間がかかるため, 核膜が通過しやすい間にドナーDNAは核の近くに到達できないか, あるいは核に到

達する前にエンドヌクレアーゼによって分解されてしまう可能性が⽣じる⁷⁾. したがって, ドナーDNAのサイズと導⼊電圧は, エレクトロポレーションによ

る⻑鎖遺伝⼦KIの制限要因であると考えられている.

最近, CRISPR/Cas9 とlssODNをエレクトロポレーションによってマウス受精卵に導⼊することに成功したとの報告があったが, ドナーDNAは相同性アー

ムを含めて最⼤1.1kbであった¹⁵⁾. また, 卵管内エレクトロポレーション (i- GONAD) 法で導⼊に成功したドナーDNAは925bpと報告されている⁹⁾. しかし本研究において, CRISPR / Cas9システムと約6 kbのlssODNを⽤いることで, これまで困難とされてきたエレクトロポレーションによるマウス受精卵へ⻑鎖遺伝⼦のKIが可能であることが⽰された.

(14)

このため, エレクトロポレーションでのKIの制限要因と考えられていたDNA の⼤きさや, 導⼊時の電圧等の条件は, ⼀本鎖ドナーDNAが6kb程度であれば問題ないと考えられる.

また, 導⼊後にKIの効率を⾼める⼯夫を併せて⾏った. まず, 受精卵内での迅速な標的部位切断のためにCas9 mRNAではなくCas9タンパク質を導⼊した.

これにより導⼊直後から, 核内に移⾏さえできれば, 標的部位の切断が可能に

なる. またCas9タンパク質の半減期は数時間と短く, 標的部位切断後は速やかに分解されるため, オフターゲット変異の⼤幅な抑制にもつながる^{8, 16)}. さらに, dsDNAではなく修復ドナー鋳型として相同性アームを有するlssODNを使

⽤することによってより⾼いKI効率が報告されている^17-20). 本研究では,

lssODNの相同性アームを5’,3’側それぞれ1.5kbと, ⼀般的に使⽤されている

数百〜数⼗ベースよりも⻑く設計したため, HR時の特異性やKI効率を⾼めることにつながったと考えられる.

しかし, この⻑鎖遺伝⼦KIが成功した理由については, さらなる分析が必要である. さらに, 本研究で⽤いた⽅法の最適条件は, マウス以外の動物ではまだ決定されていない.

適切な導⼊⽅法の選択は, 受精卵への⻑鎖遺伝⼦KIを達成するために⾮常に重要である. これらの⽅法には, マイクロインジェクション, ウイルスベクター

(15)

感染による送達, およびエレクトロポレーションが含まれる. マイクロインジェクションは最も広く使⽤されている⽅法だが、実験環境や実験者によっては実施が困難となる.

ウイルスを使⽤する導⼊⽅法の中で, アデノ随伴ウイルス（AAV）は感染効率

が⾼く, 無傷の透明帯を通過して受精卵に感染する. ただし, 収容できるDNA 断⽚の最⼤容量は制限される（5.2 kb以下）. ウイルス粒⼦も調製して濃縮す

る必要があり, Cas9タンパク質やgRNAをAAVに収容しない場合には, 感染のための共培養の前にエレクトロポレーション等でそれらを受精卵へ導⼊する

必要がある^{2, 21)}.

エレクトロポレーションは, マイクロインジェクションよりも短時間で遺伝⼦

を多数の受精卵に同時に導⼊でき, ⾼価な機器や特別な技術スキルを必要としない. また, ウイルス送達システムよりも時間と労⼒がかからない. 表４に, 本

研究におけるエレクトロポレーションによるKI効率と, 他の先⾏研究で⾏われたエレクトロポレーション, マイクロインジェクションおよびAAVによる KI効率との⽐較を⽰した^{2, 7)}. 本研究での⻑鎖遺伝⼦KI効率は, ドナーDNA のサイズが最も⼤きい約6kbであるにも関わらず, マイクロインジェクションによる導⼊の約2倍, AAVによる導⼊法の0.6倍と, ほぼ同程度の効率が得られている.

(16)

最近, 受精卵の回収や卵管移植の必要がない, 卵管内エレクトロポレーション

（i-GONAD）法が開発され, エレクトロポレーションはより簡便になった⁹⁾. 本研究では, ⻑鎖遺伝⼦KIマウスを簡単かつ安価に⽣産できることを⽰した.

⻑鎖遺伝⼦のKIにエレクトロポレーションを使⽤できれば, 学⽣や初⼼者であっても実験を⾏いやすく, ⾼価な機器が使⽤できる環境でなくともKIなどのゲノム編集を⾏うことが可能になると考えられる.

結論

本研究で、従来は困難とされてきたエレクトロポレーションでのマウス受精卵

への⻑鎖遺伝⼦のKIが可能であることが⽰された. ⻑鎖遺伝⼦のKIにエレクトロポレーションが使⽤できれば, 実験環境や技術による制約が緩和され, より簡単により多くの研究者がKIを⾏うことが可能になる.

謝辞

(17)

稿を終えるにあたり, 懇篤なる御指導, 御校閲を賜りました岡⼭⼤学⼤学院医

⻭薬学総合研究科⼝腔⽣化学分野, 久保⽥聡教授, 服部⾼⼦助教に⼼より感謝いたします. そして主任教授であります岡⼭⼤学⼤学院医⻭薬学総合研究科顎

⼝腔再建外科学分野の飯⽥征⼆教授に謹んで感謝の意を表します. また, 研究の遂⾏に際し, 多⼤な御協⼒をいただいた岡⼭⼤学⼤学院医⻭薬学総合研究科分⼦医化学分野, ⼤野充昭准教授, ⼝腔⽣化学分野の諸先⽣⽅ならびに岡⼭⼤

学⻭学部研究室配属の学⽣各位に⼼より感謝いたします. さらに, 本研究を進めるにあたり種々の御配慮, 御援助, 御助⾔をいただいた徳島⼤学⼤学院医⻭

薬学研究部⼝腔顎顔⾯矯正学分野, 泰江章博講師, 岡⼭⼤学⼤学院医⻭薬学総合研究科組織機能修復学分野, 宝⽥剛志准教授, 細胞組織学分野, 藤⽥洋史助教, ⻭学部先端領域研究センター (ARCOCS), 滝川正春センター⻑に謹んで感謝の意を表します. 最後に, 様々な⾯にわたり, 終始御協⼒, 御指導いただきました⼝腔⽣化学分野, ARCOCSならびに顎⼝腔再建外科学分野の諸先⽣⽅・

スタッフの皆様に厚く御礼申し上げます.

資⾦提供

(18)

本研究はJSPS科研費 JP16K11476およびJP19K22716 (代表：久保⽥聡教授), JP19K17399 (代表：近藤星), JP17K19756 (代表：服部⾼⼦助教)の助成を受けた.

表題脚注

岡⼭⼤学⼤学院医⻭薬学総合研究科

顎⼝腔再建外科学分野（主任：飯⽥征⼆教授）

岡⼭⼤学⼤学院医⻭薬学総合研究科

⼝腔⽣化学分野（委託：久保⽥聡教授）

本論⽂の⼀部は, 以下の学会において発表した.

・ブレインストーミング2018 (2018年9⽉, 岡⼭)

・第41回⽇本分⼦⽣物学会年会 (2018年11⽉, 横浜)

・ブレインストーミング2019 (2019年9⽉, 岡⼭)

・第92回⽇本⽣化学会⼤会 (2019年9⽉, 横浜)

(19)

⽂献

1) Yoshimi, K., Kunihiro, Y., Kaneko, T., Nagahora, H., Voigt, B., Mashimo, T.: ssODN-mediated knock-in with CRISPR-Cas for large genomic regions in zygotes. Nat Commun, 7, 10431, 2016.

2) Mizuno, N., Mizutani, E., Sato, H., Kasai, M., Ogawa, A., Suchy, F., Yamaguchi, T., Nakauchi, H.: Intra-embryo Gene Cassette Knockin by CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing with Adeno-Associated Viral Vector.

iScience, 9, 286-97, 2018.

3) Peng, Y., Clark, K.J., Campbell, J.M., Panetta, M.R., Guo, Y., Ekker, S.C.:

Making designer mutants in model organisms. Development, 141, 4042-54, 2014.

4) Shrivastav, M., De Haro, L.P., Nickoloff, J.A.: Regulation of DNA double- strand break repair pathway choice. Cell Res., 18, 134-47, 2008.

5) Sonoda, E., Hochegger, H., Saberi, A., Taniguchi, Y., Takeda, S.:

Differential usage of non-homologous end-joining and homologous

(20)

recombination in double strand break repair. DNA Repair (Amst), 5, 1021-9, 2006.

6) Mao, Z., Bozzella, M., Seluanov, A., Gorbunova, V.: DNA repair by nonhomologous end joining and homologous recombination during cell cycle in human cells. Cell Cycle, 7, 2902-6, 2008.

7) Remy, S., Chenouard, V., Tesson, L., Usal, C., Menoret, S., Brusselle, L., Heslan, J.M., Nguyen, T.H., Bellien, J., Merot, J., De Cian, A., Giovannangeli, C., Concordet, J.P., Anegon, I.: Generation of gene-edited rats by delivery of CRISPR/Cas9 protein and donor DNA into intact zygotes using electroporation. Sci. Rep., 7, 16554, 2017.

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9) Ohtsuka, M., Sato, M., Miura, H., Takabayashi, S., Matsuyama, M., Koyano, T., Arifin, N., Nakamura, S., Wada, K., Gurumurthy, C.B.: i- GONAD: a robust method for in situ germline genome engineering using CRISPR nucleases. Genome Biol., 19, 25, 2018.

(21)

10) Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T.: Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos. Sci. Rep., 4, 6382, 2014.

11) Chen, S., Lee, B., Lee, A.Y., Modzelewski, A.J., He, L.: Highly Efficient Mouse Genome Editing by CRISPR Ribonucleoprotein Electroporation of Zygotes. J. Biol. Chem., 291, 14457-67, 2016.

12) Peng, H., Wu, Y., Zhang, Y.: Efficient delivery of DNA and morpholinos into mouse preimplantation embryos by electroporation. PLoS One, 7, e43748, 2012.

13) Modlinski, J.A.: The role of the zona pellucida in the development of mouse eggs in vivo. J. Embryol. Exp. Morphol., 23, 539-47, 1970.

14) Bronson, R.A.M., A.: Transfer to the mouse oviduct of eggs with and without the zona pellucida. J Reprod Fertil 22, 129–37, 1970.

15) Miyasaka, Y., Uno, Y., Yoshimi, K., Kunihiro, Y., Yoshimura, T., Tanaka, T., Ishikubo, H., Hiraoka, Y., Takemoto, N., Tanaka, T., Ooguchi, Y., Skehel, P., Aida, T., Takeda, J., Mashimo, T.: CLICK: one-step generation of conditional knockout mice. BMC Genomics, 19, 318, 2018.

(22)

16) Kim, S., Kim, D., Cho, S.W., Kim, J., Kim, J.S.: Highly efficient RNA- guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res., 24, 1012-9, 2014.

17) Yang, H., Wang, H., Shivalila, C.S., Cheng, A.W., Shi, L., Jaenisch, R.:

One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell, 154, 1370-9, 2013.

18) Wang, H., Yang, H., Shivalila, C.S., Dawlaty, M.M., Cheng, A.W., Zhang, F., Jaenisch, R.: One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell, 153, 910-8, 2013.

19) Chen, F., Pruett-Miller, S.M., Huang, Y., Gjoka, M., Duda, K., Taunton, J., Collingwood, T.N., Frodin, M., Davis, G.D.: High-frequency genome editing using ssDNA oligonucleotides with zinc-finger nucleases. Nat Methods, 8, 753-5, 2011.

20) Yoshimi, K., Kaneko, T., Voigt, B., Mashimo, T.: Allele-specific genome editing and correction of disease-associated phenotypes in rats using the CRISPR-Cas platform. Nat Commun, 5, 4240, 2014.

(23)

21) Sato, M., Ohtsuka, M., Watanabe, S., Gurumurthy, C.B.: Nucleic acids delivery methods for genome editing in zygotes and embryos: the old, the new, and the old-new. Biol. Direct, 11, 16, 2016.

図の説明

図1.（A）gRNA（T7Rosa26gTemp）の配列. （B）gRNAを発現するプラスミド

(24)

図2. (A), (B) プラスミドを使⽤したlssODN調製法の概略図.

UCA1発現カセットの両端にそれぞれ1.5 kbの相同性アームを, HRによって

pcDNA3.1の2つの制限酵素部位（BsrDI）の間に組み込んだ. 得られたプラ

スミドをニッキングエンドヌクレアーゼNb.BsrDIで消化した後, ⽬的のDNA 断⽚をアガロース電気泳動により分離, ゲルから切り出し, 精製してlssODN (約6kb) を得た.

図3. KI確認のための産仔のPCR分析

（A）マウスRosa26A遺伝⼦座（WT対⽴遺伝⼦）, KI lssODNおよびプライマーセットの概略図（B–Gで使⽤。表1を参照）。 WT：野⽣型, KI：ノックイン

（B）産仔＃16–27, ＃41–67のPCR分析. ＃22, ＃23および＃60は,

lssODN 全⻑KIを⽰唆する3.3 kbのバンドを⽰した. 他の産仔は, WT（500 bp）と同じバンドを⽰した. M1：100bp, M2：1kbマーカー。 W1, W2, W3：

WT. P：ポジティブコントロール.

（C）KI確認のためのPCR分析. ＃22, ＃23は, 5 '側と3'側の両⽅で⽬的のバンド（3.9, 2.5 kb）を⽰した. nested PCR（D）は, WTと区別するために⾏った.

(25)

（D）nested PCR（テンプレート：CのPCR産物）. ＃22, ＃23および＃60 は, 5 '側と3'側の両⽅で⽬的のバンド（300 bp）を⽰した.

（E）KI確認のためのPCR分析. ＃22, ＃23は, 5 '側と3'側の両⽅で⽬的のバンド（1.9および1.8 kb）を⽰した. nested PCR（F）は, WTとの区別するために⾏った.

（F）nested PCR（テンプレート：EのPCR産物）. ＃22, ＃23は, 5 '側と3' 側の両⽅で⽬的のバンド（430, 320 bp）を⽰した.

（G）KI確認のためのPCR分析. #60の産仔について, テンプレートDNAの精製法と希釈倍率をそれぞれ変えたサンプル1〜7を作製し, PCR分析を⾏った. その結果, ＃60−5, 6のサンプル条件において, 5 ', 3'の両側で⽬的のバンド（1.8, 1.6 kb）が確認された (表2−1).

図4. KI確認のための産仔＃41-67のPCR分析.

プライマーセット（図3A, 表1）を使⽤. ＃58,＃65：⽋番. M1：100 bpマーカー. W1, W2：WT. P：ポジティブコントロール.

（A）25匹の産仔のうち14匹が⽬的のバンドを⽰した（アスタリスク, 214 bp）. ※：空のウェル.

（B）25匹の産仔のうち7匹が⽬的のバンドを⽰した（310 bp）.

(26)

図5. 産仔＃41-67のdual-labeled Real-time PCR分析

1モルのゲノムDNAに挿⼊されたUCA1遺伝⼦のモル数の⽐較.

＃60および＃66が相対的に⾼値を⽰した.

図6. 挿⼊されたlssODNのシークエンス分析

（A）WT対⽴遺伝⼦およびKI lssODNおよびプライマーセットの概略図（B

−Fで使⽤. 表1を参照）.

（B, C）図3Fに⽰す⽬的のバンドの配列分析.

（D, E）図4に⽰す産仔＃60のバンドの配列分析.

（F）図3Dに⽰す⽬的のバンドの配列分析.

図7.＃22 KI産仔のダイレクトシークエンス分析

（A）WT対⽴遺伝⼦およびKI lssODNおよびプライマーセットの概略図

（B–Eで使⽤。表1を参照）.

（B, C）5 'および3'側からの図3Bに⽰す3.3 kbバンドのダイレクトシークエンス分析。 F1, R1プライマーを使⽤.

(27)

（D, E）F9、R9プライマーを使⽤した, 5 'および3'側からの図3Bに⽰す3.3 kbバンドのダイレクトシークエンス分析.

表1. PCRおよびシークエンスに使⽤したプライマー

Primer name Forward

(F1) ROSA PAM genotyping5' GGGGAGTGGAGGGAAGGAGCGAGGGCTCAG

mRosa26sF AAGGGAGCTGCAGTGGAGTA

(F2) Rosa5armUPstreamFnew CCAGGCCCACGACCCCGAGGAGAGGGAACGCAGGG

rosa 5arm UPstreamF CCCGGGGCCCGGTCGTGTGGTTCGGTGTCT

(F3) UCA1 genotyping5' AGGCTTCATCCGTTCCTCTGGACCCTCATC

(F4) pcDNA checkLONG3armF TGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCC

pcDNA genotyping5 AATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGC pcDNA genotyping5nested GGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGG

(F5) in-Fusion Rosa 5armF ver2 BsrDI TCAGGGTTATTGTCTCATGAGCAATGCGAGTTAGGCCCAACGCGGCGCCAC

(F6) in-Fusion pcDNA5 CCCCTCTTCCCTCGTTGAGCGGATACATATTTGAATGTAT

(F7) in-Fusion Rosa3’armF for pcDNA3ver2 AAGAACCAGCTGGGGTCTGCAACTCCAGTCTTTCTAGAAG

(F8) in-Fusion pcDNApA5ver2 CTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCTGT

(F9) T7 TTAATACGACTCACTATAGGG

Primer name Reverse

(R1) ROSA PAM genotyping3’ GAGGCGGATCACAAGCAATAATAACCTGTA

ROSA PAM genotyping3’ nested ACCTCGATGGAAAATACTCCGAGGCGGATC

(R2) RosacheckLONG3armR TATCCCACAAGTCTGCAGTTATGGCTCCTCTGTCC

rosa3arm DOWNstreamR GCTACCATATTGGAACAAACACAAAGTATT

(R3) UCA1 genotyping3' CAAAGAGTGAAATGTCCCAAGCCCTCTAAC

(R4) pcDNA genotyping3 ATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTC

pcDNA genotyping3new GACCTCCAACACACAAGCAGGGAGCAGATACTGGC pCAG reverse ATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTA

(R5) in-Fusion 5armR ATATGTATCCGCTCAACGAGGGAAGAGGGGGAAGGGATTC

(R6) in-Fusion pcDNA3 ver2 TCATGAGACAATAACCCTGATAAAT

(R7) in-Fusion Rosa3’armR for pcDNA3ver2 GGATACCCCCTAGAGCATTGCTTATTTAATGTGAATACACTTGTGG

(R8) in-Fusion pcDNApA3ver2 CCCCAGCTGGTTCTTTCCGCCTCAGAAG

(R9) BGHreverse TAGAAGGCACAGTCGAGG

(28)

Primer set PCR size (bp) (F1 - R1) ROSA PAM genotyping5' - ROSA PAM genotyping3’ WT:500, KI:3300

(F2 - R3) Rosa5armUPstreamFnew - UCA1 genotyping3' 3850

(F3 - R2) UCA1 genotyping5' – RosacheckLONG3armR 2480

(F3 - R3) UCA1 genotyping5' – UCA1 genotyping3' 300

(F2 - R4) Rosa5armUPstreamFnew - pcDNA genotyping3new 1900

rosa 5arm UPstreamF - pcDNA genotyping3 1800

(F4 - R2) pcDNA checkLONG3armF - RosacheckLONG3armR 1800

pcDNA genotyping5 - rosa3arm DOWNstreamR 1640

(F1 - R4) ROSA PAM genotyping5' - pcDNA genotyping3new 430

mRosa26sF - pCAG reverse 214

(F4 - R1) pcDNA genotyping5nested - ROSA PAM genotyping3’ nested 320 pcDNA genotyping5 - ROSA PAM genotyping3’ 310

表2−1. PCR条件

Fig. 1 (pups No.)

Primer set DNA purification DNA Polymerase

Dilution of template DNA

Sonication PCR cycle

B (#22, #23)

(F1 - R1) Phenol/Chloroform extraction

Tks Gflex DNA Polymerase (Takara Bio)

10X dilution 20 sec sonication 3-step cycle Predenaturation: 94°C, 1min.

35cycles of 98°C, 10sec.

55°C, 15sec.

68°C, 3 min.

Additional extension:68°C, 10 min.

(#60) (F1 - R1) Phenol/Chloroform extraction

Tks Gflex DNA Polymerase

35cycles of 98°C, 10 sec.

55°C, 15 sec.

68°C, 3 min.

C

(#22, #23, #60) (F2 - R3)

(F3 - R2) Phenol/Chloroform

extraction Tks Gflex

DNA Polymerase

55°C, 15 sec.

68°C, 2 min.30 sec.

Additional extension:68°C, 10min.

D

(#22, #23, #60) (F3 - R3) PCR products of Fig. 1C Quick Taq HS DyeMix (TOYOBO, Osaka, Japan)

5X dilution No sonication 3-step cycle

Predenaturation: 94°C, 2min.

55°C, 30 sec.

68°C, 30 sec.

E (#22, #23)

(F2 - R4) (F4 - R2)

Phenol/Chloroform extraction

Tks Gflex DNA Polymerase

55°C, 15 sec.

68°C, 2 min.

F (#22, #23)

(F1 - R4) (F4 - R1)

PCR products of Fig. 1E Quick Taq HS DyeMix

5X dilution No sonication 3-step cycle

Predenaturation: 94°C, 2min.

55°C, 30 sec.

68°C, 30 sec.

(29)

G (#60)

(F2 - R4) DNeasy Kit Tks Gflex

DNA Polymerase

#60-5:

Undiluted solution

#60-6:

10X dilution

#60-5:

No sonication

#60-6:

20 sec sonication

3-step cycle Predenaturation: 94°C, 1 min.

55°C, 15 sec.

68°C, 2 min.

(F4 - R2) DNeasy Kit KOD One

PCR Master Mix (TOYOBO, Osaka, Japan)

#60-5:

Undiluted solution

#60-6:

10X dilution

#60-5:

No sonication

#60-6:

20 sec sonication

3-step cycle 30cycles of 98°C, 10 sec.

62°C, 5 sec.

68°C, 7 sec.

表2−2. PCR条件

Supplementary Fig. 2 (pups No.)

Primer set DNA purification DNA Polymerase

Dilution of template DNA

sonication PCR cycle conditions

A (#60)

(F1 - R4) DNeasy Kit Quick Taq HS

DyeMix (TOYOBO, Osaka, Japan)

10X dilution 20 sec sonication 3-step cycle Predenaturation: 94°C, 2 min.

55°C, 30sec.

68°C, 30sec.

B

(#60) (F4 - R1) DNeasy Kit Quick Taq HS

DyeMix 10X dilution 20 sec sonication 3-step cycle

Predenaturation: 94°C, 2 min.

55°C, 30sec.

68°C, 30sec.

表3. dual-labeled Real-time PCRに使⽤したプライマーおよびプローブ

Primer name Sequence (5'-3')

Forward primer Hs_UCA1-F CCCAAGGAACATCTCACCAATTTC Reverse primer Hs_UCA1-R AGGGGCTTCTGAGGCGATC

Probe Hs_UCA1-P CATCAGTCTTCAGCCACTAAGCCGAGGAGA

表4. 本研究におけるKI効率および他の導⼊⽅法との⽐較

導⼊⽅法材料産仔数 KI 数/産仔数

(%)^a

indel 数/産仔数 (%)^b

WT 数/産仔数 (%)^c エレクトロポレーション

(本研究)

Cas9 タンパク質/sgRNA/

lssODN (6kb) 38 3/38

(7.9)

15/38 (39.5)

20/38 (52.6) エレクトロポレーション

(Remy et al., Sci. Rep., 2017)

Cas9 mRNA/sgRNA/

ssODN (100b)

20 (胚または

産仔数)

5/20 (25)

12/20 (60)

3/20 (15) エレクトロポレーション

Cas9 mRNA/sgRNA/

lssODN (4.7kb)

6 (胚の数)

0/6 (0)

3/6 (50)

3/6 (50) マイクロインジェクション

Cas9 mRNA/sgRNA/

ssODN (100b)

82 (胚または

産仔数)

12/82 (14.6)

17/82 (20.7)

53/82 (64.6) マイクロインジェクション

Cas9 mRNA/sgRNA/

dsODN(⼆本鎖 ODN) (4.7kb)

57 (胚の数)

2/57 (3.5)

13/57 (22.8)

42/57 (73.7)

(30)

AAV による送達 (エレクトロポレーションでの

Cas9-RNP 導⼊後) (Mizuno et al., iScience, 2018)

Cas9-RNP (Cas9 タンパク質と sgRNA 複合体)/

⼀本鎖 AAV ベクター (3.8kb)

29 4/29 (13.8)

1/29 (3.4)

24/29 (82.8)

aKI: Knock-in. ^bindel: insertions or deletions. ^cWT: wild type.