別紙１
論 文 審 査 の 要 旨
報告番号 甲 第
2700
号 氏 名 星野 真理江論文審査担当者
主査 歯科薬理学教授 高見 正道 副査 口腔解剖学教授 中村 雅典 副査 口腔微生物学教授 桑田 啓貴
副査 生体分子薬学講座生物化学部門 教授 板部 洋之
（論文審査の要旨）
学位申請論文「8-Nitroguanosine3’,5’–cyclic monophosphate mediates expansion of growth
plate cartilage in mice
」について，上記4
名が個別に審査を行った．8-Nitro-cGMP
は，NO依存的にニトロ化された環状GMP（cGMP）の代謝物であり，
遺伝子発現や細胞増殖を制御する新たな分子 として知られている．本論文は，
C
型ナト リウム利尿ペプチド（CNP）による軟骨形成において，8-Nitro-cGMP
が細胞増殖や分化 を 調 節 す る 機 能 を 担 っ て い る こ と を 示 し た も の で あ る ．CNP
は 成 長 板 に お け る8-Nitro-cGMP
生成と成長板および脛骨の伸長を誘導したが ，一酸化窒素合成酵素（NOS）
阻 害 剤 は こ れ を 抑 制 し た ． ま た ，
NOS
阻 害 剤 はCNP
に よ る 培 養 軟 骨 細 胞 増 殖 と8-Nitro-cGMP
の生成も 抑制した．さらに，8-Nitro-cGMPは，培養脛骨成長板の伸長と軟 骨細胞の増殖を促進した．以上の結果は，成長板軟骨においてCNP
が8-Nitro-cGMP
の 産生を誘導し ，それが軟骨細胞の増殖を介して 成長板軟骨の伸長を促進することを示唆 する．本論文の審査において，副査の上條委員および美島委員から多くの質問があり，その一 部とそれらに対する回答を以下に示す．
副査 中村委員の質問とそれに対する回答：
1. 軟骨の成長に大きくかかわる要素は何か述べよ．
軟骨組織は，軟骨細胞の増殖と分化に伴い，軟骨基質を分泌することで成長する．軟 骨内部では，軟骨細胞が分裂増殖し ，増殖した軟骨細胞が基質を分泌することで軟骨組 織は大きく成長する．一方，軟骨表面には軟骨膜の扁平な軟骨膜細胞が ，次第に大きく 形を変えながら細胞周囲に軟骨基質を分泌して成長する．
2. 軟骨細胞培養系において， D-NAME
添加群とL-NAME＋CNP
添加群で差がないのはどのような機序が考えられるか考察せよ．
D-NAME
添加群とL-NAME＋CNP
添加群で差がないことから，脛骨の伸長に及ぼす因子が，NOS の活性のみではなく多因子が関与していることが考えられる ．D-NAME＋
CNP
添加群とL-NAME＋ CNP
添加群の軟骨細胞の増殖を比較したところ ，L-NAME＋CNP
添加群では増殖が有意に抑制されていた．このことから，CNPによる脛骨の伸長がNOS
の活性に依存していることが示唆された．副査 桑田委員の質問とそれに対する回答：
1. CNP
を添加した際，成長板軟骨の静止/増殖軟骨細胞層と同様に肥大軟骨細胞層の伸長 も促進されているが，8-nitro-cGMPの成長板軟骨の発現は，静止/増殖軟骨細胞層でしか
認められない．このような成長板軟骨の伸長部位と8-nitro-cGMP
の発現部位の相違は，どのように解釈すればよいか説明せよ．
（主査が記載）
CNP
の軟骨細胞における作用として ，細胞増殖と肥大化分化とマトリクス産生の促進 がすでに知られている．このうちの細胞増殖の促進に8-nitro-cGMP
が関与しているので は な い か と 考 え て い る ． 一 方 ，8-nitro-cGMP
が 生 体 内 で 産 生 さ れ る 硫 化 水 素 に よ っ て8-SH-cGMP
に代謝されるという報告があるが ，8-SH-cGMP
も8-nitro-cGMP
と同様に，cGMP
キナーゼ依存性に生物活性を持つ ．このことから，もう一つの可能性として，検 出されなかった8-SH-cGMP
が肥大軟骨細胞層で発現していることが考えられる．2. 培養した脛骨を µCT
で解析した場合，どのような結果が得られると考えられるか．胎生
16
日齢マウスの脛骨を4
日間培養後に，µCT にて骨密度や骨梁の量を解析しよ うと試みたことがあるが，胎仔の脛骨の大きさが機械に適していなかったため，µCT 像 を得ることができなかった ．今後，骨体部の解析を行 う際は，カルシウム沈着を検出す るVon Kossa
染色や骨組織を検出するVillanueva bone
染色を行うことを考えている ． 副査 板部委員の質問とそれに対する回答：1. 胎仔期の成長における CNP
の役割を説明せよ．
CNP
ノックアウトマウス（Nppc-/-ノックアウトマウス）は出生時から体長が短く ，そ の後の成長も著しく阻害され小人症の表現型を示す．生存率は，出生4
週目には60%，6
週目には
40%にまで低下する．胎生致死には至らないが，胎仔期および出生後の骨格成
長に，CNPの作用は必要であると考えられる．
2. CNP
の骨成長のメカニズムについて説明せよ ．成 長 板 軟 骨 を 構 成 す る 軟 骨 細 胞 の 細 胞 膜 像 に 存 在 す る 線 維 芽 細 胞 増 殖 因 子 受 容 体
3
（FGFR-3）は，STAT-1 経路および
MAPK
経路を介して細胞外マトリクス合成を抑制さ せることによって成長板軟骨細胞の増殖と分化を阻害し，軟骨内骨化の成長を抑制する．一方，CNP は軟骨細胞や血管内皮細胞などで産生される ．軟骨細胞の細胞膜上に，CNP 受容体であるグアニル酸シクラーゼ
B（GC-B）が存在し，CNP
がGC-B
に結合すると，GTP
がcGMP
へ代謝される．この，CNP/GC-B の下流のcGMP/プロテインキナーゼ G-
Ⅱ（PKG-Ⅱ）が
MAPK
経路を阻害することで，軟骨内骨化の成長を促すことが明らかに なっている．三名の副査は，すべての回答が適切で満足できるものと判断した．
主査 高見委員の質問とそれに対する回答：
1. 疾患における 8-Nitro-cGMP
の役割について具体的な例を挙げて説明せよ ．共同研究者の赤池らは，マウスにおいて，心筋梗塞ののち心臓組織には
8-Nitro-cGMP
が過剰に蓄積しており，それがH-Ras
の活性化を介して心筋細胞の 早期老化を促進し心 不全の発症につながることを報告した．さらにマウスやヒト由来の細胞においてサルモ ネラなどの感染により，高濃度の8-Nitro-cGMP
が産生されたことも分かっている．以 上のことから，8-Nitro-cGMPは多様な疾患に関与する重要な分子であると考えられる．2. 本研究の展望および予想される課題と対応策について述べよ．
今後，
8-Nitro-cGMP
が関節炎や歯科領域では変形性顎関節症などの骨軟骨疾患などに 対する新規の治療法になることを期待し，関節炎モデルマウスを用いたin vivo
の実験系 において，投与方法や投与量および予測される副作用等を検討していきたい．主査の高見委員は主査の立場から，三名の副査の質問に対する回答の妥当性を確認する とともに，本論文の主張をさらに確認するために上記の質問をしたところ，明確かつ適 切な回答が得られた．
以上の審査結果から，博士（歯学）の学位授与に値するものと判断した．
（主査が記載）
