121 埼玉医科大学雑誌 第44巻 第2号 平成30年3月
学内グラント 報告書
緒 言
担がん生体では，腫瘍組織内にCTLA-4，PD-1を代表と
する様々な免疫チェックポイント（ICP）分子が発現してお
り，これらの腫瘍免疫抑制効果を如何に制御するかが喫緊 の課題となっている．
抗PD-1抗体や抗CTLA-4抗体等のICP阻害薬は，それ自 体は殺腫瘍細胞効果を示さず，担がん生体の免疫反応性を 調整することで間接的に治療効果を発揮する．さらに，古 典的化学療法に不応性の進行がんに対しても治療効果を示
す優れた利点がある．しかし，現時点でのICP阻害薬の奏
功率は，20〜40 %程度であり，決して十分ではない1)．こ の問題を改善するために，最近では，新たな標的分子の探
索や，複数のICP分子を標的とした併用療法の開発が積極
的に進められている．
近年，テキサス大学のAriizumiらは，悪性黒色腫患者末
梢血中に膜タンパク分子DC-HILを高発現した骨髄由来抑
制細胞（MDSC）が高頻度で存在し，T細胞免疫応答を抑
制しており，このT細胞抑制は抗DC-HIL抗体でキャンセ
ルできることを明らかにした2)．このことより，DC-HIL
は，抗腫瘍免疫反応を抑制する新規ICP分子と位置づけら
れる．このDC-HILは様々ながん種の腫瘍細胞表面に発現
していることも知られている3)．
一方，創傷治癒過程においては，DC-HILは間葉系幹細
胞（MSC）上のCD44に結合し，MSCの増殖を促す4)．MSC は多くのがん種の腫瘍組織内に存在し，間質形成をはじめ
とする腫瘍病態形成に重要な役割を担っている5)．従って，
腫瘍組織に発現したDC-HILは，腫瘍免疫を抑制すること
で腫瘍の増殖を支持するだけでなく，MSC増殖を介して
腫瘍病態進展をも促進している可能性が浮上してきた．し
かし，腫瘍病態におけるDC-HILとMSCに関する研究報告
は無い．
本研究ではDC-HILが腫瘍病態形成に及ぼす影響を
精査することを目指し，CRISPR / Cas9システムにより
DC-HILをノックアウト（KO）した悪性黒色腫細胞株を樹 立し，DC-HILがMSC増殖とMDSC分化に及ぼす影響を 検討した．
材料と方法
1. DC-HIL KO細胞の樹立
CRISPR / Cas9に よ りDC-HIL発 現 を ノ ッ ク ア ウ ト す る た め の 候 補 ガ イ ドRNA配 列 は，Webツ ー ル CRISPRdirect（https://crispr.dbcls.jp）を用いて3種類
の配列を設計した．この配列のオリゴDNAをユーロ
フィンジェノミクス社で人工合成し，ORIGENE社
pCas-Guide-EF1a-GFP vectorに組込んだ．作製した各vector を，Lipofectamine LTX（Thermo Fisher Scientific社）に
よりマウス線維芽細胞株NIH3T3に遺伝子導入した．
遺伝子導入4日後に細胞を回収し，各ガイドRNAごと
にCRISPR / Cas9誘導性ミスマッチ変異誘導能を確認
した．変異誘導能の確認は，細胞からDNAを抽出し，
gRNA標的部位をNasted PCRで増幅し，PCR産物をT7
エンドヌクレアーゼで処理し，DNA断片化をアガロー
スゲル電気泳動で確認した．
変異誘導能が確認できたvectorをLipofectamine LTX
によりマウス悪性黒色腫細胞株B16F10に遺伝子導入
し，遺伝子導入4日後にセルソーターでGFP陽性細胞
を分取した．分取した細胞を限界希釈法によりクロー
ニングし，2週間後増殖が見られたクローンを回収
し，DC-HILの発現をフローサイトメトリーにより確認 した．DC-HIL陰性が確認できたクローンはDNAを抽 出し，CRISPR / Cas9誘導性ミスマッチ変異を持つこと を上述の方法で確認した．
2. 間葉系幹細胞増殖にDC-HILが及ぼす影響の検討
gRNAを挿入していないpCas-Guide-EF1a-GFP vector を野生型B16F10細胞に遺伝子導入し，GFPを安定発現 するB16F10細胞を樹立した（B16F10-GFP）．1)で樹立 したDC-HIL発現をKOしたB16F10細胞（ B16F10-DC-HIL KO，GFP陽性）またはB16F10-GFPとマウスMSC
をそれぞれ5×104個ずつ混和して6穴プレートに蒔き，
48時間培養し，Thermo Fisher Scientiic社Click-iT Plus
キットを用いて，GFP陰性MSCのDNA合成をフローサ
イトメトリーで検出した．
3. MDSC分化にDC-HILが及ぼす影響の検討
野 生 型B16F10あ る い はB16F10-DC-HIL KOをT-75
培養フラスコに蒔き，80 % conluentの時点で血清未添
加培地に置き換え，2日間培養後，培地を回収し，腫瘍
コンディション培地（TCM）とした．TCMにMDSC誘
平成
28
年度 学内グラント報告書
新規免疫抑制分子DC-HILの阻害を併用した新しいがん免疫・放射線治療の開発研究
122 堀 内 大 ，他
導用の各種サイトカインと非動化牛胎児血清（最終濃度 10 %）を加え，マウスmyeloid progenitor細胞（MPC）を
培養した．培養開始から7日後に，FITC標識抗CD11c
抗 体，PE標 識 抗Gr1抗 体，PerCP標 識 抗CD11b抗 体， eluor660標識抗DC-HIL抗体で蛍光染色し，CD11b陽 性CD11c陰性Gr1陽性細胞のDC-HILの発現強度をフ ローサイトメトリーにより検討した．
結 果
1. DC-HIL KO細胞の樹立
DC-HIL KO用に設計し作製したvectorをNIH3T3細胞
に導入したところ，3種類中一つのvectorに明らかなミ
スマッチ変異誘導能を確認した（data not shown）．この ベクターをB16F10細胞に導入し，DC-HIL発現をKO したクローンを樹立した（B16F10-DC-HIL KO）．この
クローンのDC-HILの発現は，フローサイトメトリー
のみならず蛍光顕微鏡観察においても全く確認できな かった（data not shown）．B16F10-DC-HIL KOの細胞増
殖能は野生型B16F10細胞と比べて明らかな差を認め
ず，PD-L1やH-2Dbなどの免疫関連分子の発現も野生 型との差異は明らかではなかった（data not shown）．
2. 腫瘍細胞上のDC-HILが間葉系幹細胞の増殖に及ぼす
影響
マ ウ スMSCとB16F10-GFPま た はB16F10-DC-HIL
KOを共培養し，DNA合成を測定することで，腫瘍細
胞上のDC-HILがMSC増殖に与える影響を検討した． B16F10-DC-HIL KOと 共 培 養 し たMSCと 比 較 し て， DC-HILを発現しているB16F10-GFPと共培養したMSC
ではヌクレオシドアナログである5-エチニル-2’-デオ
キシウリジン（EdU）を取り込んだ細胞が多く検出され，
DC-HILシグナルの有無がMSCの増殖に影響を及ぼす ことが示唆された（data not shown）．
3. DC-HILを発現する腫瘍細胞は，MDSCのDC-HIL発
現を増強する．
マウスMPCを，野生型B16F10由来TCMあるいは B16F10-DC-HIL KO由来TCMを用いたところ，いず
れのTCMまたはCMでもマウスMDSCの形質とさ
れるCD11c陰性でCD11bとGr1を発現する細胞を誘
導することができた（data not shown）．
B16F10-DC-HIL KO由来TCMで誘導したMDSC と
比較して，野生型B16F10由来TCMで誘導したMDSC
のDC-HILの平均蛍光強度（MFI）は高い値を示し， DC-HILを発現する腫瘍細胞は，MDSCのDC-HIL発
現を促す因子を細胞外に分泌することが示唆された
（data not shown）． 考 察
今回，DC-HIL KO腫瘍細胞を樹立し，それを利用し
て，腫瘍細胞が発現するDC-HILがMSC増殖やMDSCの
DC-HIL発現に影響を及ぼしていることを示唆する結果を
得た．
腫瘍病態の進展には，腫瘍細胞自身のみならず腫瘍微小 環境を構成する様々な細胞が重要な役割を果たしている
ことが明らかとなっている．間葉系幹細胞MSCは脂肪細
胞，骨細胞，軟骨細胞など様々な細胞に分化する能力を 持った細胞であり，液性因子やcell-cell contactを介して周 囲の細胞の増殖や分化に影響を及ぼす細胞であることも知
られている．MSCは炎症や外傷などにより損傷を受けた
組織に集簇し，組織修復を強く促進する．腫瘍微小環境内
にもMCSの集簇は観察され，細胞増殖に必要な足場形成
や血管新生など腫瘍増殖促進的な微小環境の形成に関与し
ていると考えられている5)．さらに，微小環境内での腫瘍
細胞とMSCとの相互作用の結果，腫瘍細胞の治療抵抗性
や遠隔転移能の亢進が引き起こされることが報告されて
おり6)，以上よりMSCは腫瘍病態進展に深く関与している
と考えられる．本研究の結果より，腫瘍細胞はDC-HIL発
現を通じて，MSCの増殖を促進し，自身が増殖しやすい
微小環境を形成し，さらに増殖したMSCは腫瘍細胞の遠
隔転移能獲得に関与する細胞であることから，腫瘍細胞の DC-HIL発現は腫瘍病態進展に深く関わっているものと考 えられた．
MDSCは，腫瘍や炎症などの病的環境において，腫瘍内や
炎症局所，末梢血などで増加が認められる骨髄由来の細胞 集団で，担がん宿主における重要な免疫抑制細胞の一つで ある7)．近年，Ariizumiらは悪性黒色腫末梢血中にDC-HILを
細胞表面に発現したMDSCが増加し，悪性黒色腫に対する
T細胞免疫応答を抑制していることを報告した2)．本研究代
表者も，テキサス大学留学中にAriizumi博士に師事し，大
腸癌や膵癌，腎癌など悪性黒色腫以外の腫瘍患者末梢血中 にもDC-HIL陽性MDSCが増加していること，また，その
MDSCはT細胞活性化抑制能を持ち，そのT細胞抑制は抗
DC-HIL抗体でキャンセルできることを明らかにし，その
成果を含む研究が2017年米国がん研究会議で発表された8)．
本研究では，DC-HIL発現をKOした腫瘍細胞由来の
TCMで 培 養 さ れ たMDSCと 比 較 し て，DC-HILを 発 現
している腫瘍細胞由来のTCMで培養されたMDSCでは
細胞表面にDC-HILを高発現することが明らかとなり，
DC-HILを発現する腫瘍細胞は，MDSCのDC-HIL発現を 促す因子を細胞外に分泌している可能性が示された．し
かし，この腫瘍が発現するDC-HILとMDSCが発現する
DC-HILの関係は，そのまま担がん生体内に当てはめら れるとは限らない．MDSCのDC-HIL発現はInterferon-γに よって増強されること9)，腫瘍細胞表面のDC-HILはT細胞
の活性化を抑制し，T細胞からのIFN-γ産生を抑えること
が明らかとなっており10)，生体内では，IFN-γ産生を抑制
しないDC-HIL陰性腫瘍の方がMDSC細胞表面のDC-HIL
発現を強く誘導する可能性も考えられる．腫瘍のDC-HIL
発現と担がん宿主細胞のDC-HIL発現の関係を明らかに
するために，今後は移植腫瘍モデルなどin vivoでの詳細な
123 新規免疫抑制分子DC-HILの阻害を併用した新しいがん免疫・放射線治療の開発研究
© 2018 The Medical Society of Saitama Medical University http://www.saitama-med.ac.jp/jsms/
MSCやMDSCをはじめとする骨髄由来細胞は腫瘍独特
の微小環境の重要な構成要素であり，今回の結果より，骨
髄細胞の機能や増殖へのDC-HILの影響を阻害すること
は，免疫抑制的で腫瘍増殖促進的な腫瘍微小環境の形成を
抑制する可能性があると考えられ，以上よりDC-HIL関連
シグナルの阻害は腫瘍の病態進展を阻害する新たな治療標 的となる可能性が示された．
現在，文部科学省新学術領域研究先端モデル動物支援 プラットフォームの支援のもと，本研究により同定した DC-HIL KO用gRNA配列を利用してDC-HILノックアウト
マウスの樹立に取り組んでいる．上述のDC-HIL KOマウ
スと今回確立したDC-HIL KO腫瘍細胞を併用することに
より，腫瘍因子と宿主因子の両側面からDC-HILが腫瘍病
態進展に及ぼす影響を精査し，腫瘍の新規治療法の開発に 繋げたいと考えている．
なお，本研究内容は論文投稿を予定しているため，報告 書への実験データの掲載は控えさせていただいた．
引用文献
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研究成果リスト
論 文
