重岡 徹 学 位 の 種 類

氏 名 ^{しげおか とおる}

重岡 徹

学 位 の 種 類

博士（医学）

報 告 番 号

甲第

号

学位授与の日付

令和

年

月

日

学位授与の要件

学位規則第

条第

項該当（課程博士）

学 位 論 文 題 目

Activation of overexpressed GLP-1R attenuates prostate cancer growth by inhibiting cell cycle progression

（GLP-1 受容体の過剰発現は、細胞周期を阻害する事によって前 立腺癌の増殖を抑制する）

論 文 審 査 委 員 （主 査） 福岡大学 教授

川浪 大治

（副 査） 福岡大学 教授

白澤 専二

福岡大学 教授

羽賀 宣博

福岡大学 准教授

四元 房典

内 容 の 要 旨

【目的】

わが国の糖尿病患者死因第一位は癌である。前立腺癌は増加傾向にある癌の一つで、J- DOIT3 の試験期間中 3 番目に多い癌であった。また、糖尿病の既往がある前立腺癌患者の 予後は不良であることから､前立腺癌は糖尿病患者において重要な癌と言える｡我々は､ヒ ト前立腺癌組織に GLP-1 受容体(GLP-1R)が発現している事を検証し、ヒト前立腺癌細胞 株において GLP-1R 作動薬 Exendin-4(Ex-4)が細胞増殖を抑制することを見出し報告した (Diabetes 2014, PLoS ONE 2015)。その後､大規模臨床試験において､GLP-1 受容体作動薬 リラグルチドが、前立腺癌罹患率を有意に低下することが報告され(NEJM 2016)、GLP-1R 作動薬の前立腺癌抑制作用が糖尿病患者でも証明された。そこで今回我々は､前立腺癌に おける GLP-1R 発現のさらなる検証が､癌抑制を目指した糖尿病治療ストラテジーの確立 と、新たな癌治療の発見に貢献し得ると考え本研究を行った｡

【対象と方法】

①前立腺癌悪性度と GLP-1R 発現の関連を検討する為､前立腺癌患者の生検､前立腺摘出術

後の病理組織を Gleason score で 3 群(Gleason 6, Gleason 7, Gleason 8 以上)に分類

し､GLP-1R 発現を蛍光免疫染色で検証した｡②既報において、前立腺癌細胞株によって

GLP-1R 発現レベルが異なり､GLP-1R 発現と Ex-4 の細胞増殖抑制作用は正相関にあった

(Diabetes 2014)。その際､GLP-1R 発現のない前立腺癌細胞株 ALVA-41 細胞は､Ex-4 投与

の細胞増殖抑制作用を認められなかった｡そこで今回我々は､ALVA-41 細胞にレンチウイル

スを用いて GLP-1R を強制発現させ､細胞増殖能への影響を検討した｡

【結果】

①前立腺癌生検､摘出術検体での GLP-1R 発現は､高分化低悪性度群(Gleason 6)では著明 に認められたが､低分化高悪性度群(Gleason 8 以上)では発現がごくわずかであり、GLP- 1R 発現と前立腺癌の病理学的悪性度は逆相関することを認めた｡②レンチウイルスを用い た GLP-1R 発現 ALVA-41 細胞は､通常培養で empty ベクターを導入したコントロール ALVA- 41 細胞と比較し､成長曲線､BrdU アッセイにおいて細胞増殖能の低下が認められ､ウエス タンブロッティング法で細胞周期抑制因子 p27kip1 の上昇､フローサイトメトリーを用い た細胞周期の検討では G1 期の上昇､S 期の低下から G1 アレストの所見を認めた｡また､

GLP-1R 発現 ALVA-41 細胞において､Ex-4 は用量依存性に細胞増殖を抑制し､その作用は GLP-1R 拮抗薬 Ex9-39 や、GLP-R の下流シグナルである PKA 活性を阻害する PKI でキャン セルされた｡Ex-4 投与時､GLP-1R 発現 ALVA-41 細胞は､p27kip1 がさらに上昇し､CyclinD1 の低下､Rb 蛋白リン酸化の低下を認め､細胞周期の G1 アレストは増強された｡非糖尿病ヌ ードマウスに GLP-1R 発現 ALVA-41 細胞とコントロール ALVA-41 細胞をそれぞれ播種さ せ､Ex-4 と PBS を浸透圧ポンプを用いて持続的に投与し､癌腫の増大を検討したところ、

in vitro の結果と同様に GLP-1R 発現 ALVA-41 細胞群は､腫瘍重量､サイズ共にコントロー ル ALVA-41 細胞群と比較し低下を認め､Ex-4 投与により､さらなる腫瘍サイズと重量の低 下を認めた｡

【結論】

内因性の GLP-1R 発現を認めない前立腺癌細胞株においても､GLP-1R を強制発現すること により細胞増殖能の低下を認め､ヒト前立腺癌組織の悪性度と GLP-1R 発現は逆相関し た。以上のことより、癌細胞における GLP-1 作用と癌の進行は密接な関係にあり、癌細 胞における GLP-1R の発現及び GLP-1R 作動薬によるその活性化が、癌を抑制するための 糖尿病治療ストラテジーの確立や新たな癌治療法解明の糸口となる可能性が示唆され た。

審査の結果の要旨

本論文は、前立腺癌における GLP-1 受容体の機能を明らかにすることを目的として、

GLP-1 受容体を過剰発現させた前立腺癌細胞および福岡大学病院において摘出された前立 腺癌組織の臨床検体を用いて検討が行われた。これまでの研究で前立腺癌細胞に GLP-1 受容体が発現しており、GLP-1 受容体作動薬を前立腺癌細胞株に投与することにより、

ERK-MAPK のリン酸化が抑制され、細胞増殖抑制が起こる事が報告されている。しかしな

がら、GLP-1 受容体を介した前立腺癌細胞増殖抑制メカニズムの詳細や、GLP-1 受容体発

現レベルと悪性度の関連については明らかにされていなかった。ヒト前立腺癌組織の病

理学的悪性度の指標として Gleason score があり、癌の分化度の違いで悪性度をスコア

リングする指標が臨床で使用されている。申請者らは Gleason score に基づいた悪性度 と GLP-1 受容体発現を蛍光免疫染色で検討したところ、悪性度が低く高分化型前立腺癌 で GLP-1 受容体発現が高発現し、悪性度が高く低分化型前立腺癌で GLP-1 受容体の発現 は低下していることを見出した。また申請者らは、GLP-1 受容体発現のない前立腺癌細胞 株である ALVA-41 細胞にレンチウイルスを用いて GLP-1 受容体を過剰発現させ、 in vitro での検討を行った。その結果、GLP-1 受容体発現させた ALVA-41 細胞はコントロー ル細胞と比較し増殖能の低下を認め、GLP-1 受容体作動薬である Exendin-4 を投与すると skp2 低下、p27kip1 上昇、CyclinD1 低下、pRb 低下から細胞周期の S 期への移行を阻害 し細胞増殖抑制を認めた。これらの結果から、GLP-1 受容体が高発現である程、増殖能が 低下する可能性が示唆され、GLP-1 受容体を介した前立腺癌の増殖抑制機序として細胞周 期抑制が関連している事を初めて明らかにした。本研究は、前立腺癌に対する GLP-1 受 容体作動薬の有用性を示唆するものである。

1. 斬新さ

申請者らは、これまでに GLP-1 受容体作動薬による前立腺癌増殖抑制効果について報 告している。これらの知見に基づいて、申請者らは GLP-1 受容体の発現が高分化型前立 腺癌に多く発現している事と GLP-1 受容体の発現ない前立腺癌細胞株に対して、GLP-1 受 容体を発現させる事で増殖抑制効果が得られる事を新たに報告している。将来の前立腺 癌患者の治療において、高分化型前立腺癌患者の集団が最も GLP-1 受容体作動薬による 抗腫瘍効果を得られる可能性を示した研究であり、斬新さを認める。

2. 重要性

前立腺癌は罹患率が増加し続けている癌であり、本邦においても男性罹患率で最も多い 癌であると報告されている。本研究で前立腺癌増殖抑制効果可能性を示した GLP-1 受容 体作動薬は糖尿病薬であるが、糖尿病患者も増加の一途を辿っている疾患である。増加 傾向である両疾患において、治療薬の可能性を示した本研究は重要である。

3. 研究方法の正確性

適切な統計解析の方法を選択し、研究結果の再現性を確保している。また、本論文は査 読を経て Journal of Diabetes Investigation にすでに掲載されており、研究方法の正 確性は担保されていると認められる。

4. 表現の明確さ

目的、方法、結果は、詳細かつ正確に表現されており、figure を用いて簡潔に表現さ

れている。結果に基づいた考察については、過去の論文を十分に検討し、本研究でヒト

前立腺癌組織の病理組織検討と前立腺癌細胞株 ALVA-41 細胞の GLP-1 受容体作動薬

Exendin-4 の作用を明確に示している。

5. 主な質疑応答

Q:ALVA-41 癌細胞株に GLP-1 受容体をレンチウイルスで導入しているが、FLAG-Tag を付 けていることに問題がある。この FLAG-Tag は GLP-1 受容体の N 末端と C 末端どちらにつ けているか。FLAG-Tag を付けていると、それ自体が様々な作用を発揮する可能性があり 実験系に影響を与えているのではないか。ALVA-41-GLP-1R 細胞の GLP-1 受容体の免蛍光 疫染色において、画像上は細胞膜ではなく細胞質にも発現しているように見える。

A：免疫染色で細胞質に発現とは考えておらず細胞膜への発現と認識して実験を進めた。

指摘の通り細胞質に発現してしまった可能性を否定する為の検討は行っていない（FLAG- tag については、質疑の場では回答保留となったが、N 末端につけていたことを確認し た） 。

Q:In vitro の細胞周期の FACS について、GLP-1 受容体作動薬投与時に S 期低下している が、M 期の低下が顕著である。増殖のターゲットは M 期の抑制も関与している可能性がる が、この点の検討はなされたか。

A:S 期低下に関する蛋白については検討を行ったが、ご指摘通り M 期低下についての関連 蛋白は検討出来ていない。今後の課題とさせて頂きたい。

Q:in vitro の実験と比較し in vivo で効果が出すぎている印象がある。GLP-1 受容体発 現のみで増殖抑制が起こっている点について、どう解釈するか。GLP-1 受容体を介した作 用は局所的なものに留まらないのではないか。

A:マウス由来の GLP-1 によって増殖抑制がかかっている可能性と overexpressed してい るのでリガンドなしにシグナルが入っている可能性を考えている。証明する実験は行っ ていない。

Q: データ全般にわたって mRNA レベルでの発現をみているが、タンパクレベルで発現を 確認すべき。加えて、過剰発現の系でのみ検討しているが loss of function の系でも検 討を行うべき。また、一つの cell line だけでは本論文の結果を結論付けることは出来 ないのではないか。

A: ご指摘の通りであり、今後の課題としたい。

Q:ヒト前立腺癌組織の蛍光免疫染色について、正常前立腺組織や前立腺肥大症には発現

しているか。Gleason score での検討では、scoring において 3+5 の 8 と 5+3 の 8 では scoring は同じでも予後が異なる事が言われているが、その点は検討されたか。

A:正常前立腺にも GLP-1 受容体は発現している。腺腔構造により発現しており間質には 認められないという結果であった。正常組織に発現している事については今回論文では 記載していない。今回出してはいませんが、過形成組織に顕著に発現している結果であ った。前立腺肥大症については候補検体になかった為、検証していないが、発現してい る可能性が高いと考えられる。Gleason score の scoring でよく議論になる同じ grade で 悪性度に差がある点については、今回の研究では考慮していない。高分化型腺癌で発現 が明らかに亢進しているので、本来であれば Gleason score の pattern3、pattern4、

pattern5 で病理分類し GLP-1 受容体発現を確認する事が最適であると考えられる。今後 の課題とさせて頂きたい。

Q:今後臨床で現存の治療と併用する際に注意すべき点があれば教示願いたい。

A:GLP-1 受容体作動薬は、糖尿病治療薬として市販されており、2 型糖尿病合併の前立腺 癌患者で使用する事は可能。しかし、GLP-1 受容体作動薬の副作用にある嘔気や治療効果 としての体重減少については、担癌患者にとってはマイナスに働く可能性があり、投与 には慎重に検討する必要があると考えられる。

以上の質疑を中心に活発な討議が行われ、申請者は適切に回答した。今後の重要な検討

課題が示されたものの、本論文は、GLP-1 受容体作動薬の前立腺癌の細胞増殖抑制効果の

可能性を示したという点で新規性のある研究であり、学位論文に値すると評価された。