遺伝性高コレステロール血症ウサギ

(1)

遺伝性高コレステロール血症ウサギ WHHL-MI の動脈硬化性プラーク進展に対する DPP-4 阻害薬

リナグリプチンの効果

‐血管内エコー法を用いた経時的検討‐

日本大学大学院医学研究科博士課程内科系循環器内科学専攻

黒澤毅文

修了年 2018 年

指導教員平山篤志

(2)

① 概要・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・1

② 緒言・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・4

③ 目的・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・14

④ 方法・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・15

⑤ 結果・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・24

⑥ 考察・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・26

⑦ 結論・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・35

⑧ 謝辞・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・36

⑨ 表・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・37

⑩ 図・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・41

⑪ 図説・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・54

⑫ 引用文献・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・59

⑬ 研究業績・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・69

(3)

1 概要

目的：DPP-4 (Dipeptidyl peptidase 4) 阻害薬はインクレチン分解を阻害し内因性の活性型インクレチンホルモンであるグルカゴン様ペプチド-1（GLP-1）を増加させ、

グルコース濃度依存的に膵β細胞からインスリン分泌を促進させ血糖降下作用を示

す。 DPP-4 阻害薬にはインクレチン作用増強以外に、動脈硬化の進展抑制である抗ア

テローム効果や心血管保護の可能性がある。本研究の目的は、ヒトの動脈硬化病変に

類似の所見を示す遺伝性高コレステロール血症ウサギ (Watanabe heritable hyperlipidemic - myocardial infarction rabbit, WHHL-MI ウサギ)において、DPP-4 阻害薬（リナグリプチン）を投与した群とコントロール群の 2 群において、血管内エコー（intravascular ultrasound, IVUS）法を投与前後に観察し、プラークの量ならびに組織成分の変化について比較検討し、さらに剖検後病理組織学的にも検討した。

方法：10-12 月齢の WHHL-MI ウサギをコントロール群（n=8）とリナグリプチン投与群（DPP-4 阻害薬群）（n=8）の 2 群に分けた。 IVUS で腕頭動脈を観察したのち、

DPP-4 阻害薬群には 16 週間リナグリプチン（10mg/kg/day in 0.5% Natrosol）を胃

チューブにて胃内投与し、コントロール群には同じ容量の 0.5% Natrosol のみを胃内

投与した。リナグリプチンは 0.5% Natrosol を用いて懸濁し経口投与した。16 週間

後、再度 IVUS で腕頭動脈を観察した。IVUS では血管を 0.5mm 間隔で評価し血管

断面積（Vessel area）、血管内腔面積（Lumen area）、血管内膜プラーク面積（Plaque

area= Vessel area - Lumen area）を求め、さらに計測した血管の長軸長から Vessel

(4)

2 volume、 Lumen volume、Plaque volume を求めた。IVUS ではプラーク体積を示すグレースケール画像と、組織成分を表示したカラー画像（iMAP

^TM

）で検討した。

Baseline と 16 週間後で血管の観察距離を完全に一致させることは難しいため、観察

した距離の中央値を用いて補正をした。

結果： IVUS における検討では、 Baseline の各測定値において両群に差はなかった。

16 週間後の血管体積(Vessel volume) （コントロール群 n=8 vs. リナグリプチン群 n=8、

44.61± 3.67mm

³

vs. 41.11 ± 3.46mm

³

, p=0.50）、プラーク体積（Plaque volume）

（21.96 ± 1.38mm

³

vs. 19.19 ± 1.18mm

³

, p=0.15）、%Plaque volume（Baseline から 16 週間後の Plaque volume の変化率）は 2 群間において同等であった（50.06 ± 2.75%

vs. 47.77± 2.87%, p=0.57）。一方、Baseline と 16 週間後の変化量を比較すると⊿

Plaque volume（16 週間後 – Baseline の差分量）、⊿Vessel volume はリナグリプチン群においてのみ有意に減少を認めた（⊿Plaque volume, 1.02 ± 0.96mm

³

vs. -3.59

± 0.92mm

³

, p=0.004; ⊿ Vessel volume, -1.22 ± 2.36mm

³

vs. -8.66 ± 2.33mm

³

, p=0.04）。また%change of plaque volume(Baseline に対する 16 週間後の plaque

volume の変化量 )はリナグリプチン群においてのみ有意に減少を認めた (6.90 ±

5.62% vs. -15.06 ± 3.29%, p=0.005)。 iMAP 解析では Plaque volume における Fibrotic、

Lipidic、 Necrotic、 Calcified の各体積成分は 16 週間後の時点でリナグリプチン群に

おいて Fibrotic が有意な減少を認めた（17.84 ± 0.96mm

³

vs. 14.11 ± 0.90mm

³

,

p=0.01）。また、リナグリプチン群は Baseline から 16 週後までの変化量をコントロ

(5)

3 ール群と比較すると Fibrotic volume、 Lipidic volume、Necrotic volume に有意な減少を認めた (⊿Fibrotic volume, 0.56 ± 1.27mm

³

vs. -5.57 ± 1.46mm

³

, p=0.04; ⊿ Lipidic volume, 0.24 ± 0.24mm

³

vs. -0.42 ± 0.16mm

³

, p=0.04; ⊿Necrotic volume, 0.76 ± 0.54mm

³

vs. -0.84 ± 0.25mm

³

, p=0.02)。病理組織による検討では、リナグリプチン群はコントロール群と比較し%平滑筋細胞（Smooth muscle cell, SMC）area

（6.49±0.73% vs. 6.24±1.63%, p=0.89）および%Fibrotic area（53.60±5.18% vs.

62.68±6.44%, p=0.29）は両群間で有意差はなかったが、 %Macrophage area （12.03

±1.51% vs. 7.21±1.65%, p<0.05）はリナグリプチン群で小さかった。IVUS 上で

Plaque 量が減少したが、線維成分である Fibrotic が増加しなかった理由として

Fibrotic のプラーク内の空間的分布が変化した可能性がある。プラークの安定化に線

維成分の量的変化より空間的分布変化が重要と報告もある。病理組織は、血管を

0.5mm 間隔で薄切し評価したため、体積評価している IVUS データと完全に一致さ

せることは不可能だが、リナグリプチン群では%Fibrotic area に有意差がなく、炎症の主体となる%Macrophage area は減少していた。

結論：遺伝性高コレステロール血症ウサギ WHHL-MI に対して 10mg/kg/day のリナ

グリプチン投与を 16 週間行い、その投与前後を IVUS で観察した結果、リナグリプ

チン群にはプラークの増殖を抑制し、さらにプラーク性状を安定化させる可能性が示

された。

(6)

4 緒言

粥状動脈硬化症に起因する虚血性心疾患は近年日本人の死因の上位を占めいている。その理由として高エネルギー・高脂肪食に伴う食生活の欧米化により、高血圧、

糖尿病や高脂血症といった生活習慣病を有する患者総数が、年々増加傾向であること

があげられる

^{1, 2}

。生活習慣病は全身の動脈硬化進展を促し、心疾患の発症に起因し

ている。厚生労働省発表の平成 26 年患者調査の概況では、心疾患の年間患者数は 172 万 9 千人にのぼり

³

、平成 28 年人口動態統計では死因としては「がん」についで心疾患が死因第 2 位となっている。また心疾患による年間死亡者数も 19 万 3 千人にものぼっている

⁴

。心疾患の中でも原因の第一を占めるのは虚血性心疾患で、特に生命に

かかわる疾患群として、急性冠症候群 (acute coronary syndrome; ACS)が重要であ

る。 ACS は急性心筋梗塞、不安定狭心症など、冠動脈プラークの破綻とそれに続く血栓形成といった共通の病態により発症する疾患を総称したものである。病院に搬送さ

れた ACS 患者の死亡率は初期治療の進歩により急激に減少したものの、病院外の

ACS による心原性心肺停止症例は、本邦において年間約 6 万人と報告され、病院に

搬送されても、予後は不良である

^5,6

。したがって、動脈硬化病変の進展を抑制し ACS

の発症予防は、国民全体の健康を守りさらに医療経済を効率化すための、極めて意義

深い事柄である。

(7)

5 虚血性心疾患

1962 年に WHO は虚血性心疾患を労作性狭心症、心筋梗塞、中間型狭心症、無痛性虚血性心疾患に分類し、中間型狭心症から心筋梗塞へ移行することを示した

⁷

。 1975 年に American Heart Association は狭心症を労作性狭心症と不安定狭心症に分け、

その中で心筋梗塞に移行しやすいものを、不安定狭心症として位置づけた

⁸

。これら

の虚血性心疾患は冠動脈の動脈硬化が原因である。冠動脈においては出生早期より生理的内膜肥厚が形成され、そこに脂質異常症、高血圧症、糖尿病、喫煙などの種々の危険因子が加わることで炎症や脂質蓄積が起き、動脈硬化病変が形成される。その結

果として冠動脈に狭窄が生じ、ひいては心筋虚血が起こるようになる

⁹

。冠動脈の内

腔直径の狭窄度が 75%以上をこえると、特に運動時に血流が低下し始め、 90％以上になると安静時にも血流が低下する

¹⁰

。

ACS の病態

Herrick らは 1912 年に心筋梗塞患者の病理所見より、心筋梗塞は血栓によって冠

動脈が閉塞することによって発症していることを報告した

¹¹

。1990 年代に入ると冠

動脈造影検査が広く施行されるようになった。不安定狭心症や心筋梗塞は、冠動脈壁

が内腔に向かって徐々に肥厚し最終的に冠動脈が高度に狭窄し、閉塞した結果発症す

ると考えられていたが、冠動脈内のアテローム性プラークの破裂とそれに伴う血栓形

成が主因であることが示された

¹²

。また、Falk らによって急性心筋梗塞の 68%が狭

(8)

6 窄度 50%以下の病変から発症することが報告された

¹³

。現在、不安定狭心症、心筋梗

塞ならびに虚血性心臓突然死は、急性冠症候群（Acute Coronary Syndrome: ACS）

と総称されているのは、冠動脈プラークの破綻とそれに伴う血栓形成という一連の共

通した病態が存在すると認識されているためである（図 1）。

冠動脈は内膜・中膜・外膜の 3 層構造を呈し、外膜は疎な結合組織、中膜は平滑筋層、内膜は一層の内皮細胞層からなるが、動脈硬化が進展すると内膜の肥厚性病変が形成され、これをプラークと呼んでいる。プラークの構成は、平滑筋細胞が主体で線維成分に富む線維性プラークから、脂質成分がコア様に沈着し線維性被膜が覆うアテローム性プラーク（アテローマ、粥腫）まで様々な性状を呈する。プラークの中には

破綻しやすいプラークとそうではないプラークが存在しており、特に ACS を発症しやすい破綻しやすいプラークを不安定プラーク（vulnerable plaque）と呼んでいる。

病理学的検討では、不安定プラークの特徴として、①偏心性で陽性リモデリングを伴っている、②線維性被膜の菲薄化がみられる、③脂質コアが発達している、④びらんをきたしやすい、またはきたしている、⑤すでに一部破綻したプラークも含まれる、

⑥プラーク内出血、⑦小結節状石灰化を有している、⑧高度狭窄病変、⑨プラーク内

の炎症細胞浸潤などがあげられる

^14,15

。また、これらの特徴の発現や進展を抑制する

ことが、 ACS 発症予防に繋がるものと考えられるようになった。また、不安定プラー

ク内の組織学的な特徴を逆行させることを「プラークの安定化」と呼び、プラークの

断面積や容量が減少する現象を「プラークの退縮」と呼んでいる。プラークの形成・

(9)

7 進展の危険因子には性別、血圧、肥満、脂質異常症、糖尿病、喫煙、家族歴などが報

告されている

^16-21

。しかし、プラークが不安定化する時期や原因、さらには ACS を発症させる直接の原因についても未知な点が多い。

動脈硬化粥腫の形成過程

動脈硬化粥腫の形成は血管内皮細胞の機能障害や形態傷害に起因すると考えられている。血管内皮細胞が高血圧、高血糖、脂質異常、喫煙などによる酸化ストレスや感染や炎症性疾患による種々の炎症性サイトカインにより傷害を受けると、血管内膜の透過性が亢進し、低比重リポ蛋白（low density lipoprotein, LDL）などのリポ蛋白

が内膜内に侵入する。 LDL-コレステロールが内膜内に取り込まれ、 LDL は酸化され、

酸化 LDL となる。併せて血管内皮に種々の接着因子が発現し、血液中の単球や T リンパ球はその接着因子を介して血管内皮に接着し、内皮下に遊走し，種々の炎症性

サイトカインを放出する。その後単球は，障害された内皮細胞や T リンパ球から放出されるマクロファージ分化・増殖因子によりマクロファージに成熟分化する。また、

一部中膜の平滑筋細胞は表現型を変えて、内膜内に遊走し、マクロファージに分化す

る。このマクロファージが酸化 LDL を貪食すると、泡沫化し泡沫細胞となり種々の炎症性サイトカインを放出して，さらなるリンパ球や単球の侵入を惹起するとともに，

中膜に存在する血管平滑筋細胞を脱分化・増殖促進させ内膜に誘導する。また泡沫細

胞および平滑筋細胞自体からプラークのマトリックスを水解する因子マトリックス

(10)

8 メタロプロテイナーゼ（Matrix metalloproteinase, MMP）を放出させる

^22-26

。泡沫

細胞は内膜内で集積し、やがて壊死ないしアポトーシスにより崩壊して、細胞外マト

リクス内に脂質コアを形成する（図 2）

¹⁴

。また泡沫細胞は T 細胞の活性化に関与し、

活性化した T 細胞やマクロファージはインターフェロン（Interferon, IFN）-γや腫瘍壊死因子（Tumor necrosis factor, TNF）-αなどの炎症性サイトカインや血管内皮

増殖因子（Vascular endothelial growth factor, VEGF）などを産生する。さらに TNF- αなどの炎症性サイトカインは細胞間接着分子（ Intercellular adhesion molecule,

ICAM） -1 などの発現を増強し T 細胞の接着を容易にさせる。血管内皮細胞障害がお

こると、同時に血小板血栓の付着と血小板由来増殖因子（Platelet-derived growth

factor, PDGF）が産生され、中膜から平滑筋細胞が遊走し、コラーゲンを分泌して泡沫細胞を覆うようになり、線維性被膜が形成される。粥腫が大きくなり、内部で脂質コアが肥厚化し、また線維性被膜が菲薄化するとプラークの破綻を起こしやすくなる

vulnerable plaque が形成される。このように動脈硬化粥腫の形成には段階的に多く

の炎症性サイトカインが関与している

^{14, 27-29}

。

動脈硬化と糖尿病薬について

動脈硬化は糖尿病患者において進行が早く、重症化しやすいことが知られている

³⁰

。

これまで 2 型糖尿病患者を対象とした大規模臨床試験（ACCORD 試験、ADVANCE

試験、VADT 試験）において、厳格な血糖管理をしても血管障害を有意に減少させる

(11)

9 ことはできなかった

³¹^～³³

。しかし、インクレチン関連薬（GLP-1 や DPP-4 阻害薬）

の出現により血糖代謝以外に抗動脈硬化作用や心保護作用の可能性が出現した。

DPP-4 阻害薬について

DPP-4 阻害薬は活性型インクレチンの分解速度を遅延させ血中の GLP-1（小腸 L

細胞から分泌されるインクレチンホルモンであるグルカゴン様ペプチド -1, Glucagon-like peptide-1; GLP-1）や GIP（十二指腸 K 細胞から分泌されるインクレチンホルモンであるグルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド , Glucose- dependent insulinotropic polypeptide; GIP）濃度を上昇させる。GIP は胃酸分泌・

胃運動・ガストリンの分泌抑制など腸管での作用が知られていたが、 GIP による膵β 細胞でのインスリン分泌促進作用が明らかにされ，現在は GLP-1 と共に主要なインクレチンのひとつである。GLP-1 はグルコース濃度依存的に膵β細胞からインスリ

ンを分泌させる

^34,35

（図 3）。また、 GLP-1 は膵臓以外にも脳神経系、胃、腎臓、骨格筋、肺、心血管系など多様な臓器に作用を持ち

^36,37

、特に心血管系に対しては血管内

皮機能を改善させることで心保護作用があると報告されている。

リナグリプチンと抗炎症作用について

リナグリプチン（Linagliptin）は DPP-4 阻害薬の一つであり、ドイツのベーリン

ガーインゲルハイム（Boehringer Ingelheim GmbH）で開発された。リナグリプチン

(12)

10 は肝臓ではほとんど代謝されず未変化体のまま胆汁中へ排泄されるため、重度の腎機能障害や肝機能障害においても減量する必要なく使用できる。リナグリプチンは

DPP-8 や DPP-9 などの類縁酵素には影響を与えず、 DPP-4 に対する選択性が非常に

高く、既存の DPP-4 阻害薬の中で IC

50

が最も低い。またリナグリプチンはキサンチン骨格を有し DPP-4 活性をより強力に阻害する構造を最適化させている（図 4）。

動脈硬化症の発症とその進展には酸化ストレスが関係していると報告があるが

38,39

、Kröller-Schön らは敗血症モデルのラットにリナグリプチンを 7 日間投与し、

血管内皮機能改善を認め、さらに大血管への炎症細胞浸潤の減少、 NADPH オキシダーゼや大動脈における炎症性遺伝子発現低下、血管・心臓・血液内の活性酸素種減少

を認めると報告した

⁴⁰

。リナグチプチンには血糖降下作用以外に、抗酸化作用や抗炎

症作用など多面的効果が示唆されている。しかし、動脈硬化がすでに進行した状態において、リナグリプチン投与前後で動脈硬化の原因となるプラーク量と質の変化を血管内イメージングで評価した報告はない。一方で、臨床現場ではリナグリプチンの心血管イベントを評価するために、2 型糖尿病患者にリナグリプチンを投与し心血管死

＋非致死性心筋梗塞＋非致死性脳卒中の 3 ポイント主要心血管イベントおよび不安定狭心症による入院を評価する二重盲検ランダム化比較試験（CARMELINA 試験、

CAROLINA 試験）が現在行われている。

(13)

11 遺伝性高コレステロール血症ウサギについて

WHHL ウサギは Watanabe によって 1973 年に発見された高脂血症を示す日本白

色ウサギに由来し、 1980 年に系統交配させて確立された

⁴¹

。 WHHL ウサギの高脂血症は low density lipoprotein (LDL）受容体の遺伝子異常に基づいて血中の LDL の異化が遅延することが明らかにされた。この高脂血症が原因となり動脈硬化や黄色腫が

自然発症する。その後選抜交配により、 28 月齢における心筋梗塞の累積発生率が 98%

の WHHL ウサギの一群が作られ、WHHL-myocardial infarction (MI)ウサギと命名された

⁴²

。脂質代謝に関連する酵素はヒトとマウスやラットで大きく異なるが、ウサ

ギはヒトに類似している。ヒト血中の主要なリポ蛋白（主にアポタンパクと脂質で形

成される粒子であり、血中で脂質を運搬する役割を担うもの）が LDL であるのに対し、実験動物の代表であるマウスやラットは高比重リポ蛋白（ high density lipoprotein：HDL）であるが、このウサギでは LDL である

⁴³

。その結果、WHHL- MI ウサギではヒトの動脈硬化病変と同様の病変が認められ、病理学的にもヒトに極めて類似しているとされる。実際、心筋梗塞を発症した WHHL-MI ウサギの責任冠動脈では不安定プラーク所見として、薄い線維性被膜に覆われたマクロファージに富む壊死組織の存在が報告されている

⁴²

。

血管内超音波（Intravascular Ultrasound : IVUS）について

IVUS は直径約 1mm (3 French size) のカテーテルの先端に装着した高周波超音

(14)

12 波探触子（20－40MHｚ）を約 1,500-2,000rpm の速度で回転させ、生体で直接血管壁の短軸断層像を描出する方法である。冠動脈や末梢血管に経動脈的に直接挿入す

るため観血的かつ侵襲的な検査である。1988 年に世界で初めて臨床応用され

⁴⁴

、現

在では経皮的冠動脈形成術(percutaneous coronary intervention : PCI)を施行する

約 6 割以上の施設において、PCI のガイド目的にこの IVUS が用いられているのが現状である（図 5）。IVUS の原理は一般的なエコー装置とほぼ同様であり、情報は白黒で得られ grey-scale と呼ばれる画像で構成される。IVUS カテーテルから 2.5 波長程度のパルス波が発せられ、その波が組織の中を進んで行く過程で音響インピーダンスが異なる二つの物質の境界面において一部の波は反射され、プローブに戻ってくる。また一部はその境界面を通過し、さらに奥へ進達する。最終的にさまざまな組織境界面で反射された結果として、超音波信号が一連の信号(時系列信号)となりプローブに戻ってくる。そしてさまざまな組織境界面で反射された結果として、

超音波信号が一連の信号(時系列信号)となり返ってくる。それらの時系列信号を信号

強度に応じて 256 段階のグレースケール画像として表し、各距離に応じて 360 度パノラマ平面に構成し血管の短軸断面を表示したものが IVUS グレースケール画像である。プローブからどれくらいの距離の反射点で反射したかについては、超音波を

発し反射点で反射して返ってくるまでの時間を 2 で割り、あらかじめ定めた生体内での超音波速度を乗じて、プローブまでの距離を算出する

⁴⁵

。

IVUS における超音波の深部到達度は 4~8mm で、それによりプラークの全貌を描

(15)

13 出することができる。図 6 にその 1 例を示す。前述のようにヒトの冠動脈は内膜、中膜、外膜の 3 層からなる筋性動脈である。中膜の構成成分は平滑筋細胞が主体である。

グレースケール画像で示される IVUS においてこの層は低輝度に描出され、外膜と内膜は比較的高輝度に描出されるために、 IVUS においても血管壁は 3 層構造を呈する。

動脈硬化が進むと、平滑筋層の線維化が進むために、中膜はそれほど低輝度にならず、

内膜と中膜の境界が不明瞭となる。しかし、内腔・内膜境界、中膜・外膜境界は通常

境界が明瞭なことが多い。 IVUS を用いてプラーク面積(Plaque area)を測定する場合は、中膜・外膜境界面積 (中膜と外膜の境界には外弾性板があるために、External Elastic Membrane area：EEM area とも呼ばれる)から、内腔面積(Lumen area)を減じたもの、すなわち内膜・中膜複合体面積(Intima+Media complex area)をもって

代用することが広く一般的とされている

⁴⁶

（図 6）。また、EEM 面積を血管断面積

(Vessel area)として用いている。それぞれ断面積に IVUS により観察した距離を乗じ

ることで体積を算出した。

IVUS カテーテルは撮像時に一定速度で引き抜くことが可能である。そのため一定間隔でプラーク断面積が測定できるので、それを積分することで、任意の範囲でのプラーク体積、内腔、血管の総体積をそれぞれ計算することもできる。このよ

うに IVUS で得られた解剖学的情報は、治療方針の決定や治療デバイスの選択、治

療エンドポイントの決定のために重要な情報であり、治療後のフォローアップにも

用いられる。また、手技も容易で安全性が高いことから、現在最も広く普及してい

(16)

14 る血管内イメージング法といえる。ただしグレースケール画像で、プラークの組織性状をみるには限界があることが示唆された。そのため組織性状を同定するには、

組織固有の音響力学的特性を描出すべく、次に述べるような超音波時系列信号の数学的物理学的解析が必要となり、それに基づいてカラーIVUS が開発されてきた。

動物実験における IVUS の意義

マウスを用いた実験は、均一な条件で比較実験を行うことができるが、現時点では一定期間経過した後に剖検病理で効果をみる横断研究のみが可能であるため、同一のプラークを経時的に変化をみることはできない。個体の小ささや、体力などの限界により、血管内イメージングを継時的に繰り返して施行することが困難なためである。

しかし、最近のデバイスなどの進歩や動物管理システムの進歩により、著者らの施設

では WHHL-MI ウサギに IVUS を薬剤投与前後において 2 回施行できる安全な飼育

がある程度可能となった。そのため、動物実験によりプラークの組織成分の変化を観察することが可能となった。

目的

今回の研究の目的は、進行した動脈硬化病変のプラーク量および性状に対するリナ

グリプチンの影響を WHHL-MI ウサギを用いて検討する。WHHL-MI ウサギをリナ

グリプチン投与した群とコントロールとしてリナグリプチンを懸濁する際に用いた

(17)

15 溶媒 Natrosol を投与した群の 2 群に分け、薬剤投与期間は 16 週間とした。WHHL- MI ウサギの腕頭動脈に対して IVUS をリナグリプチン群および Natrosol 群の投与前後の 2 回観察する。薬剤投与前後で IVUS を施行し血管内イメージング像を評価することで、血管内のプラーク量や組織成分の経時的変化が観察可能となる。さらに安

楽死後に病理標本を作製し、薬剤投与後の血管病理組織を検討した。本実験は、 IVUS による血管内イメージング像からリナグリプチンによる進行した動脈硬化症のプラーク量および組織性状の変化を評価することである。また病理組織に関しては経時的

な変化は評価が困難なため、16 週後の血管病理組織からプラークや Macrophage など炎症性細胞の程度を評価した。

方法

モデル動物と投与薬剤

動脈硬化モデル動物としてオスの WHHL-MI ウサギを用いた。これらはすべて神戸大学医学部付属実験動物施設より提供されたものを使用した。前述のように

WHHL-MI ウサギは、ウサギで世界初の心筋梗塞を自然発症するモデル動物である

42

。10~12 月齢のウサギを神戸大学医学部附属実験動物施設より輸送した後、日本大

学医学研究支援部門ラボラトリーアニマル系動物飼育室ウサギ舎にて飼育した。飼育

室の室温は 22±2℃であり、湿度は 65±5%に維持されている。照明は午前 8 時から

午後 8 時までの 12 時間照射される。ウサギには１頭１日当たり約 100g のウサギ用

(18)

16 普通食（CR-3: 日本クレア株式会社）を与えた。水分の補給には水道水を与えた。16

頭の WHHL-MI ウサギをコントロール群とリナグリプチン群の 2 群に分けた。リナ

グリプチンはベーリンガーインゲルハイム（Boehringer Ingelheim GmbH）より提

供されたものを使用した。コントロール群には懸濁溶液である Natrosol、リナグリプチン 10mg/kg/day in 0.5% Natrosol を投与した。10~12 月齢の WHHL-MI ウサギに対し、IVUS で腕頭動脈を観察したのちウサギを保定し胃チューブを用いて直接、胃

内へ Natrosol およびリナグリプチンを 16 週間投与した。 WHHL-MI ウサギに GLP- 1 受容体作動薬を投薬した先行研究

⁴⁷

では 12 週間投与し効果を認めた。今回、 DPP- 4 阻害薬であるリナグリプチンは GLP-1 受容体作動薬より上流の物質であるため、

効果を確実にするために 16 週間投与を行った。また WHHL-MI ウサギの動脈硬化病変に対するマクロファージの浸潤を評価した研究

⁴⁸

では、16 頭が使用されていた。

本実験においても、進行した動脈硬化病変に対するリナグリプチンの効果をみるため、

必要最低症例数は 16 頭とした。なおこれら動物実験は、日本大学医学部実験指針を遵守し、日本大学動物実験運営内規に準じて行われ、医学部動物実験委員会で認証された(第 AP15M012 号)。

血液検査値について

採血検査については IVUS を行うために必要な動脈シースの挿入時に動脈血を 5ml

採取した。血清を遠心したのち、総コレステロール(Total cholesterol：T-chol)の血中

(19)

17 濃度は試薬 L タイプワコーCHO ・ H （和光純薬工業株式会社）を用いた酵素法で日立 7180 型自動分析装置（日立ハイテクノロジーズ）を用いて測定した。中性脂肪 (Triglyceride：TG)は試薬に L-タイプワコーTG・H（和光純薬工業株式会社）を試薬に用いて、GPO・HDAOS 法、グリセリン消去法で日立 7180 型自動分析装置（日立ハイテクノロジーズ）を用いて測定した。LDL は試薬にコレステスト LDL（積水メディカル株式会社、富士レビオ株式会社製）とオリンパス AU4531（ベックマン・コールター株式会社）を用いて測定した。HDL はコレステスト NHDL（積水メディカル株式会社製、富士レビオ株式会社販売）を試薬に用いて、直接法で Bio Majaesty

（JCA-BM8060）（日本電子株式会社）とオリンパス AU5431（ベックマン・コールター株式会社）を用いて測定した。血糖値はクイックオートネオ GLU-HK （株式会社シノテスト）を試薬に用い、酵素法で日立 7180 型自動分析装置（日立ハイテクノロジーズ）を用いて測定した。

IVUS による観察について

IVUS で血管を観察する際には、まず保定したウサギにセボフルラン（丸石製薬株

式会社製）を 3~5%の濃度で吸入させ全身麻酔をし、鎮痛・鎮静処置を施した。その

後ウサギの大腿部を除毛し、 2~4cm の皮膚切開を行い、大腿動脈の分離を行った。動

脈穿刺で動脈を確保し大腿動脈に 4Fr 血管造影用シースイントロデューサー（シー

ス）を挿入した。カテーテルがどの動脈に挿入されているのかの識別は、X 線アンギ

(20)

18 オグラフィーシステム（東芝メディカルシステムズ株式会社）を用いて確認した。続

けてシースよりヒト冠動脈用ガイドワイヤー（Sionblue

^TM

、朝日インテック株式会社）

を逆行性に下行大動脈より腕頭動脈、右総頚動脈へと通過させたのち、IVUS プローブカテーテル（2.5F, 40MHz；Boston Scientific 社）を、このガイドワイヤーに沿っ

て挿入した。右総頚動脈に IVUS プローブカテーテルを挿入後、冠動脈ワイヤーを引き抜き、IVUS プローブカテーテルのみを残した。挿入した IVUS プローブカテーテ

ルを毎秒 0.5mm で機械式プルバックシステムを用いて自動的に引き抜いて撮像した

（オートマティック・プルバック）。このとき IVUS プローブカテーテルに接続された IVUS 記録器 iLAB（Boston Scientific 社）により毎秒 30 フレームで画像を記録した。 IVUS 画像の記録が終わったのち IVUS プローブカテーテルをウサギ血管内より引き抜き、IVUS の観察を終了とした。観察終了後、シース抜去するとともに穿刺部位を縫合し、止血されたことを確認してから、皮膚縫合を行った。再出血が認められないことが確認できた時点で吸入麻酔を中止し、ウサギを覚醒させて初回の実験を終了とした。実験手技中は、心電図、動脈圧を慎重にモニター管理し、術後感染予防

とし、セファゾリン 0.1g を静脈内投与した。また、１6 週後 2 回目の IVUS を用いて腕頭動脈の観察を行った。

IVUS によるプラークの組織性状の鑑別

グレースケール IVUS でも、石灰化は 90%以上の感度、特異度をもって鑑別するこ

(21)

19 とができる。しかしながら線維や脂肪性組織を正確に鑑別することは難しい

^49-52

。こ

のため元々の超音波時系列信号(Radiofrequency 信号：RF 信号)を解析し、各組成分に固有な音響力学的特性を数学的に抽出することで、血管内プラークの組織成分を鑑別する試みがなされている。信号解析にはフーリエ変換を用いるのが一般的である。

フーリエ変換とは、信号を変換して、周波数エネルギースペクトルを求める方法であ

る。解析する信号を x(t)とした場合以下となる。

X(f) = ∫x(t)e

^-2^π^jft

dt t : 時間、 f : 周波数

すなわち関数 x(t)と正弦波関数 e

^-2^π^jft

の積の積分である。∫x(t)y （t） dt の式は、 x(t)

と y(t)の相関性をみる一般式である。つまりフーリエ変換は、解析する信号である x(t)

が種々の周波数をもった正弦波とどれだけ似ているのかを全周波数にわたって調べ

るという方式である。現在 IVUS を用いた組織成分の鑑別のプログラムはいくつか市販されている。それぞれの違いは、このフーリエ変換によって得られたスペクトルから、組織固有の特性値をどう描出するかの数学的方法論の違いによる。この中で本研

究では Spectral similarity analysis と呼ばれる手法で組織性状を同定する装置

（iMap

^TM

；ボストン・サイエンティフィック社)を用いた。これは時系列信号を分割

して各成分の周波数スペクトルを得たのち、あらかじめデータベース化した各組織成

分に特徴的なスペクトルの形とどれだけ似ているか、ニューラルネットワーク学習理

論を利用して組織成分同定を行う最新の方式である

⁵³

（図 7）。

(22)

20 IVUS 組織成分解析

腕頭動脈起始部から右総頚動脈の分岐部までのプラークについて、IVUS の画像デ

ータを echoPlaque

^TM

BSC iMap

^TM

Echo Plaque 4.0（INDEC Medical Systems 社）

を用いてプラークの組織成分ついて解析した。同一個体・同一部位において実験前後

の 2 回の IVUS による観察データに対し、0.5mm ごとの血管断面積（Vessel area）、血管内腔面積（Lumen area）、血管内膜プラーク面積（Plaque area= Vessel area -

Lumen area）を求め、さらに測定距離から Vessel volume、 Lumen volume、 Plaque

volume を求めた。さらにコントロール群およびリナグリプチン群で測定距離を完全

に一致させることは困難なため、実験で測定した WHHLMI ウサギの腕頭動脈距離の中央値を用いて補正を行った

⁵⁴

。 Plaque volume は echoPlaque

^TM

BSC iMap

^TM

Echo Plaque 4.0 組織識別プログラムにより、自動的に Fibrotic：緑色、Lipidic：黄色、

Necrotic ：赤色、 Calcified ：青に自動的に識別される。 Vessel volume における Plaque volume の占有率(%Plaque volume、Plaque volume / Vessel volume)、ならびに同定された各組織成分の体積、ないしプラーク内占有率（各組織成分 volume /Plaque

volume）について、 2 回の IVUS 観察における変化を、コントロール群、リナグリプ

チン群で比較した。この 2 回の観察において、血管分岐部を起点にとり、その基点か

らの距離が等しい短軸断面を同一断面とした。またコントロール群およびリナグリプ

チン群で測定距離を完全に一致させることは困難なため、実験で測定した WHHLMI

ウサギの腕頭動脈距離の中央値を用いて補正を行った。

(23)

21 組織染色・解析

16 週後に IVUS を用いて血管観察を終了した後、IVUS カテーテルを抜いた後にシースは抜かずに、深麻酔下で開胸し右心房を切開し脱血すると同時に、1L の生理食

塩水をウサギの収縮期血圧で約 110mmHg に相当するように約 150 ㎝の高さから灌流させた。完全に脱血させ生理食塩水で灌流させたのち、同様に約 10%ホルマリン水

溶液 500ml を約 150 ㎝の高さよりシースを介して流し、還流固定を行った。灌流固

定が十分となったのを確認したのち、弓部大動脈から腕頭動脈、右総頚動脈を一塊に

して摘出し、 10%ホルマリン水溶液で固定した。 24 時間以上ホルマリンで固定したのち腕頭動脈でパラフィンブロックを作製し、血管の末梢側から中枢側に向かって短軸

方向に 1 区間を 0.5mm 毎に 4μm の厚さで薄切を行い、病理組織切片に対し、

Hematoxylin-eosin （H-E）染色、 Masson trichrome （M-T）染色、 Elastica van Gieson

（EVG）染色を行った。さらにウサギのマクロファージ、平滑筋を識別する為に免疫

染色を行った。 1.2 気圧に加圧し抗原性賦活化し、 5% skim milk でブロッキングを行った後に、一次抗体にモノクローナルマウス抗ウサギマクロファージ抗体 (Clone RAM-11, x50, Dako North America Inc.)およびモノクローナルマウス抗平滑筋アクチン抗体（Clone 1A4, x50, Dako North America Inc.）を用いて 37℃、1 時間反応さ

せた

^55,56

。一次抗体の希釈には Dako REAL

^TM

Antibody Diluent（Dako North

America, Inc.）を使用した。二次抗体に HRP 標識抗マウス IgG 抗体（Dako North

America, Inc. ）を用い、室温で 30 分間反応させた。発色には DAB ： 3, 3’-

(24)

22 Diaminobenzidine, tetrahydrochloride（DAB TRIS tablet, pH7.6, 和光純薬工業株式会社）を用いた DAB 法で発色した。顕微鏡（OLYMPUS BX51, DP Controller;

3.2.2.267 オリンパス株式会社）を用いて病理組織切片像をデジタル化したのちに、

画像解析ソフト（Photoshop CC 2017 , Adobe Systems Incorporated 社）を用いて標

的組織の占有面積を同じ色の部分を自動抽出して測定した。また EVG 染色を用いて EEM area、内弾性坂（Internal Elastic Membrane：IEM）area、Lumen area を測定した。Vessel area は EEM area で代用した。Plaque area は IEM area－Lumen area より求めた。Intima+Media area は EEM area－Lumen area より求めた。血管中膜面積(Media area)は EEM area－IEM area より求めた。また、石灰化の占める面積を計測した。 M-T 染色では血管内膜プラークにおける線維成分を示す面積を計測した。線維成分は脂質成分のほとんど認めないコラーゲン線維束と定義した。脂質成分は泡沫細胞や細胞外脂質が分散しコラーゲン成分の少ない部分と定義した。壊死性成分はコラーゲン線維が少なくプラーク成分が乏しく、コレステリン結晶や炎症細

胞に富んでいる範囲と定義した。免疫染色は血管内膜プラーク内の DAB 染色した RAM-11 陽性部位、1A4 陽性部位をそれぞれ計測した。16 週後の Control 群およびリナグリプチン群において、各組織占有率の Fibrotic area、Necrotic+Lipidic area、

Calcified area、Macrophage area、SMC area のそれぞれを Intima+Media area と

の比で検討した。

(25)

23 iMAP-IVUS を指標にした 2 群間における病理組織の比較

IVUS による観察データは血管に対して 0.5mm 間隔で評価されるが、実際の病理所見においても IVUS で観察した部位と同じスライスで病理組織を評価した。

WHHLMI ウサギに対して IVUS と病理組織の相関関係に関してはすでに報告

⁴⁷

さ

れており、本実験においても同様の手法を用いた。病理組織標本は作成過程による短

縮・縮小を考慮し、まず IVUS の撮像断面の位置を腕頭動脈分岐部から次の分岐部までの距離を分母にとった場合の内分比で算出し、組織の各スライスの位置についても

同様の内分比を算出し IVUS 像のそれと最も近い画像を IVUS 像と対応する画像として選出し、計 16 のスライスについて 16 週後のコントロール群とリナグリプチン群で比較した。病理組織は、Vessel area、Lumen area、Intima area、Media area をコントロール群とリナグリプチン群で比較した。さらに免疫染色を行い%Macrophage (Macrophage area / Intima area)、%SMC (SMC area / Intima

area)、%Fibrotic (Fibrotic area / Intima area)、%Calcified area (Calcified area / Intima area)に関してもコントロール群とリナグリプチン群で比較した。

統計処理について

同一個体の血液検査や IVUS データと採血測定値は初回と 16 週間後を比較する際

には、対応のある 2 群間の Student-t テストを用いた。コントロール群とリナグリプ

チン群の比較では対応のない Student-t テストを用いた。各データは各個体より複数

(26)

24 個収集されるが、実験動物の genuine 性を考慮して、全体を合わせて 2 群として比較した。統計解析は Excel 統計パック(Microsoft 社)ならびに統計ソフト Easy R (EZR Version.1.36、自治医大埼玉附属さいたま医療センター)を用いて検定し、p < 0.05 を有意とした。数値は平均値±標準誤差で示した。

結果

体重について

Baseline において体重はコントロール群 2.82±0.08 ㎏、リナグリプチン群 2.80±

0.04 ㎏であり、 2 群間に有意な差は認めなかった。 16 週後の体重はそれぞれ 2.74±0.11kg、3.00±0.06 ㎏であり、2 群間に有意差は認めなかった。

血液検査値について

Baseline において T-chol、 LDL、 HDL、 TG の脂質プロフィールはコントロール群とリナグリプチン群の 2 群間において有意な差は認めなかった。また 16 週間後においても脂質プロフィールは 2 群間に有意な差は認めなかった（表 1）。Baseline の随時血糖はコントロール群において 183.1±11.7mg/dl、リナグリプチン群は 171.0±

5.6mg/dl で 2 群間に有意な差は認めなかった。 16 週間後においてもそれぞれの値は、

192.4±16.5mg/dl、176.3±11.8mg/dl で 2 群間に有意差は認めなかった。

(27)

25 IVUS 解析結果

IVUS による腕頭動脈の観察によりコントロール群、およびリナグリプチン群から得られた各血管 volume について検討した。 Baseline における Vessel volume、 Plaque volume、 Lumen volume、 %Plaque volume はいずれも 2 群間で有意差を認めず、 16 週間後も有意差は認めなかった。 iMAP を用いた組織解析では Baseline で、 Fibrotic volume、Lipidic volume、Necrotic volume、Calcified volume は 2 群間に有意な差は認めなかった。 16 週間後では Fibrotic volume がリナグリプチン群において有意に小さかった。また、 %Fibrotic、 %Lipidic、 %Necrotic、 %Calcified に関して Baseline および 16 週間後に変化が見られなかった（表 2）。

次に 16 週間での変化量について 2 群間で検討した結果、⊿Lumen volume の変化量は二群間で有意差は見られないが、⊿Vessel volume および⊿Plaque volume はリ

ナグリプチン群で有意な減少を認めた（表 3）。⊿%Plaque volume は両群共に有意な差は認めなかったが、Plaque volume の絶対変化量を 2 群間で比較する%change of plaque volume (⊿Plaque volume / Baseline plaque volume×100)ではリナグリプチン群で有意な減少を認めた（図 8）。図 9 には iMAP を用いて Plaque volume の組織成分評価における Baseline と 16 週間後の体積変化量の変化を示した。⊿Fibrotic volume （ 0.56±1.27mm

³

vs. -5.57±1.46mm

³

p=0.04 ）、 ⊿ Lipidic volume

（0.24±0.24mm

³

vs. -0.42±0.16mm

³

p=0.04）、⊿Necrotic volume （0.76±0.54mm

³

vs.

-0.84±0.25mm

³

p=0.02）とリナグリプチン群において有意に減少を認めた（図 10）。

(28)

26 病理学解析結果

コントロール群とリナグリプチン群の病理学的解析結果を示した（表 4）。Vessel area、 Lumen area、 Plaque area、 Media area、 Intima+Media area、 %Intima+Media area については IVUS の結果と同様に 2 群間に差は認めなかった。また各成分について比較すると %Macrophage area はコントロール群において有意に大きかったが、%SMC area、%Fibrotic area、%Calcified area は 2 群間で有意差は見られなかった（図 11）。

考察

本研究では、遺伝性高コレステロール血症ウサギ WHHL-MI に対してリナグチプチンの投与を 16 週間行い、その投与前後における腕頭動脈の動脈硬化病変を IVUS で観察した。その結果、リナグチプチン投与によりプラーク量の増加は抑えられ、コントロール群と比して%change of plaque volume はリナグリプチン投与群で増加を

抑制した。結果、Baseline から 16 週後の変化量を比較すると、リナグリプチン投与

群はコントロール群に比べ Lumen volume は二群間で有意差はないが、Plaque

volume および Vessel volume が減少した。さらに剖検による病理学的検討の結果と

して、リナグリプチン投与群はコントロール群に比しマクロファージの浸潤は少なか

った。このことはリナグリプチン投与により動脈硬化進展抑制ならびにプラークの安

定化作用のメカニズムを示唆する。

(29)

27 DPP-4 阻害薬が及ぼす体重、血糖、脂質プロファイルなどについて

DPP-4 阻害薬を非糖尿病モデルのシロウサギに投与した過去の実験では、DPP-4

阻害薬群は体重、血糖値、インスリン濃度、脂質プロファイルに対し明らかな影響を

示さなかった

⁵⁷

。視床下部と脳幹には GLP-1 受容体が存在し、GLP-1 受容体作動薬を投与すると中枢神経系に作用して、摂食抑制より体重減少を引き起こすと報告されているが、非糖尿病モデルを用いた過去の実験では、GLP-1 受容体作動薬投与群は、

体重、血糖値、インスリン濃度に対し明らかな影響を示さなかった

^58,59,60

。非糖尿病

状態では、DPP-4 阻害薬および DPP-4 阻害薬により増加する内因性インクレチンで

ある GLP-1 の影響が糖代謝に大きく影響を与えないことが推察される。この報告は、

本研究におけるコントロール群とリナグリプチン群において体重や血糖値に差がな

かったという結果を支持するものである。また脂質プロファイルにおける T-cho、 LDL、

HDL、TG はコントロール群とリナグリプチン群で有意差はなく、先に報告した非糖

尿病モデルのシロウサギに DPP-4 阻害薬を投与した実験結果

⁵⁰

を支持するもと言える。

DPP-4 阻害薬の一つであるシタグリプチンを用いた TECOS study

⁶¹

において、シタグリプチンの副作用として急性膵炎を起こす可能性が指摘されている。本実験はリ

ナグリプチンを使用したが、Baseline および 16 週後で血清 AMY および血清リパー

ゼの値は、コントロール群およびリナグリプチン群で有意差はなく、上昇も見られな

かった。また実験中にリナグリプチン群のウサギの体重減少傾向や下痢症状が持続す

(30)

28 ることなく経過した。したがって本研究では、リナグリプチン群において急性膵炎など消化器症状が出現することなく実験を遂行出来たと言える。

Zhou らは、DPP-4 阻害薬を SD マウスに投与し、血圧、心拍数、腎血流量を評価した実験では、腎血流量および心拍数は増加するが血圧は変動しなかったとの報告が

ある

⁶²

。本研究では実験中にモニタリングしていた血圧に関しては、リナグリプチン

群はコントロール群と比較し、血圧の有意な差は認められなかった。したがって本研究においてリナグリプチン群では、血圧変動からのプラークへの影響は小さいと考えられる。

DPP-4 阻害薬による抗動脈硬化作用について

DPP-4 阻害薬はマウスを用いた実験において血管内皮機能改善や動脈硬化巣の減

少やプラーク内のマクロファージ量を減らすことが報告されている

^63,64

。また、 DPP- 4 阻害薬は、大腸炎や喘息や関節リウマチなどの様々な炎症モデル動物に対して抗炎症効果を発揮することが報告されている

^65-67

。リナグリプチンを敗血症モデルラット

に投与することで、血管壁への CD11ｂおよび CD11ｃ陽性細胞の浸潤を抑制し酸化ストレスレベルおよび血管内皮機能改善や単球や顆粒球の血管壁への接着を減らす

と報告がある

⁴⁰

。また敗血症モデルラットに GLP-1 受容体作動薬を投与しても、 DPP-

4 阻害薬投与した場合と類似した効果があると報告されている

⁶⁸

。動脈硬化を惹起す

る強い炎症状態をもつ動物に対して、DPP-4 阻害薬および GLP-1 受容体作動薬はと

(31)

29 もに抗炎症作用を持つことが報告されている。一方で抗動脈硬化作用に関しては、

Apo E 欠損マウスを用いて GLP-1 受容体作動薬の動脈硬化進展抑制や抗炎症作用が

あることが示さている

⁵⁸

が、これらの報告は動脈硬化の少ない初期のものを対象とし

ている。 GLP-1 を介した抗炎症作用として Arakawa らは、大動脈壁における ICAM- 1 と Vascular cell adhesion molecule-1 ( VCAM-1)の発現を抑制し、単球/マクロファージ内におけるアデニル酸を活性化させることで cAMP が産生され、cAMP/Protein kinase A (PKA)経路を介して cAMP が PKA を活性化し、NF-κB p65 を抑えることで、マクロファージの炎症反応を抑えることを示した

⁵⁸

。Steven らの報告

⁶⁹

では、

LPS 誘発性敗血症モデルラットにリナグリプチンを投与し、ラットの大動脈壁から

RNA を抽出し qRT-PCR を行い、発現遺伝子を評価した。リナグリプチン群ではコン

トロール群に比べ iNOS（inducible nitric oxide synthase）の発現増加なく、IL-6、

VCAM-1、 ICAM-1、MCP-1、 CCL-2、 TNF-αの発現は抑制されていた。このような機序により DPP-4 阻害薬も GLP-1 受容体作動薬と同様に抗炎症作用をもち、動脈硬化の進展を予防すると考えられる。しかし、本実験では動脈硬化が著しく進行しており、実臨床で遭遇する病態により類似する実験モデルと考えられる。WHHLMI ウサ

ギに対して GLP-1 受容体作動薬であるリキシセナチドを投与した Sudo らの報告

⁴⁷

では、リキシセナチド群とコントロール群でプラーク面積や%Plaque area は 2 群で

有意差はなかったが、Baseline と 12 週間の変化量を比較すると、コントロール群で

Plaque area の有意な増加を認め、iMAP-IVUS 解析ではリキシセナチド群はコント

(32)

30 ロール群と比較して壊死成分や石灰化成分が低下し、線維成分が増加していた。イメージングで評価した血管部位を病理組織により検討したところ、リキシセナチド群はコントロール群と比較して%SMC area、%Fibrotic area が大きく、%Macrophage

area および%Calcified area は小さいと報告している。我々の実験は WHHLMI ウサギにリナグリプチンを投与し、WHHLMI ウサギの腕頭動脈に iMAP-IVUS を行い Baseline、 16 週間後および Baseline と 16 週後の変化量で比較した。変化量は 16 週

間後から Baseline を引いた値を用いた。WHHLMI ウサギにリキシセナチドを用い

た研究においても、プラークの変化量を投与後から投与前を引いた値で報告

⁴⁷

してお

り、同じインクレチン関連薬であるリナグリプチンを用いた本実験においても変化量は同様の計算方法を採用した。Plaque volume や%Plaque volume ではリナグリプチン群とコントロール群の二群間で有意差が見られなかった。リナグリプチン群は

Lumen volume が保たれたまま Plaque volume および Vessel volume が小さくなったため%plaque volume でコントロール群と比較すると有意差が出なかった可能性が

ある。しかし、リナグリプチン群およびコントロール群それぞれの Baseline から 16

週後までの変化量を比べると、リナグリプチン群は Plaque volume および Vessel

volume が減少したが Lumen volume に変化がなかった。また iMAP-IVUS で Plaque

の組織成分を Baseline から 16 週後までの変化量で比べると、リナグリプチン群はコ

ントロール群に比べて Fibrotic volume、Lipidic volume、Necrotic volume は減少し

ていた。 Fibortic volume まで減少した結果に関しては、リナグリプチン群では Plaque

(33)

31 volume が減少し、Vessel volume も減少したが Lumen volume は変化がないため、

Baseline に比べ 16 週後の Plaque volume の絶対変化量が大きく、血管内腔は保たれたが血管径自体が小さくなった状態と考えられる。この状態で iMAP-IVUS を評価したため、 Fibrotic volume が減少した結果になった可能性がある（図 12）。我々は iMAP- IVUS で観察した腕頭動脈の病理組織も評価検討したが、炎症を示唆する%Macrophage area はコントロール群に比してリナグリプチン群では有意に小さ

かったが、%Fibrotic area は二群間で有意差はなかった。16 週後の iMAP-IVUS においてリナグリプチン群は fibrotic volume がコントロール群に比べて低下したが、

病理組織においてリナグリプチン群は%fibrotic area がコントロール群と比較して有

意差はなかった。これは iMAP-IVUS は体積を評価し、病理組織は面積で評価しているため、一概に比較することは出来ない。しかし、病理所見は iMAP-IVUS で観察した部位と同じスライスで組織切片を作成し評価しており、リナグリプチン群によるプラークの組織性状にどのような変化をもたらしたか観察・評価することは可能と考え

る。本研究において IVUS の観察結果から、リナグリプチンはプラークを縮小させることが困難であったが、病理組織学的、iMAP-IVUS の両アプローチからプラークの増殖を抑制し、さらにプラーク性状を安定化させる可能性が示された。

マウスにリナグリプチンを投与した実験では血管に対する抗炎症効果は示されて

いるが、本実験から動脈硬化が進行した血管に対しても抗炎症効果があることを

IVUS による血管内イメージと病理組織で示せたことは新たな発見である。近年 DPP-

(34)

32 4 阻害薬には GLP-1 を介さない抗炎症作用も報告

⁴⁰

されており、DPP-4 阻害薬であるリナグリプチンの GLP-1 に依存しないプラーク抑制メカニズムについては、現在実験中である。また、リナグリプチンによるプラーク増殖抑制やプラーク性状に変化をもたらす機序に関して今後の検討する必要がある。

本研究の限界

本研究においていくつかの限界がある。1 つ目に、iMAP による組織成分解析は画

像転送技術の制約上 0.5mm 毎でしか行えなかった。2 つ目に Baseline と 16 週間後の組織成分の変化をみるに当たっては、血管分岐点やそれからの距離を参考にして観察部位のマッチングを図ったが、この撮像上の制約や、各撮像時のカテーテルの挿入角度の違いから、完全に同一の断面を見ているとは限らない。3 つ目に、石灰化については、超音波の性質上後方に音響陰影を引くため、石灰化そのもの、ならびにその後方の組織成分についての定量における正確性が損なわれる。幸いなことに本実験では石灰化はプラークの表層ではなく、深層に認めたため、影響は少ないと考える。4

つ目に、本研究では 2 群とも Baseline のカテーテル検査時の造影および IVUS によるストレスや自然発生の心筋梗塞による死亡のため、結果として両群 8 頭ずつで行った検討した。必要最低症例のため十分なデータ数を確保できなかった可能性がある。

5 つ目にウサギの冠動脈は IVUS で観察するには小さく、大動脈ではヒト冠状動脈よ

り大きく、IVUS で十分な観察が困難であり、ヒト冠動脈の血管径に近く繰り返し観

(35)

33 察可能な腕頭動脈を選択した。 6 つ目にリナグリプチンを 16 週投与後の iMAP-IVUS データと病理組織に関して以下に記す。iMAP-IVUS で評価したリナグリプチン群の

fibrotic volume がコントロール群に比べて有意に低下したが、病理組織で評価したリ

ナグリプチン群の%fibrotic area がコントロール群と比較して有意差はなかった。

iMAP-IVUS 結果と病理結果で差があった理由として、iMAP-IVUS は体積評価、病

理組織は面積評価であり、評価している点が異なる。仮に iMAP-IVUS で評価した血管をすべて薄切し組織標本にして fibrotic を評価するため Masson Trichrome 染色を全ての標本に行い集積し、病理組織から fibrotic volume を算出すれば、iMAP-IVUS の fibrotic volume データと近似する可能性はあるが、プラークの評価には%Macrophage area や％SMC area や％Calcified area などを評価する必要があり、

全ての標本を Masson Trichrome 染色することは出来ない。本実験において、病理組

織は iMAP-IVUS で観察した部位と同じスライスで観察したが、すべての切片を連続

して薄切したわけではなく 0.5mm 間隔で評価したため、iMAP-IVUS で評価した体積結果と病理結果で評価した面積評価は分けて考えなければならない点は本研究の

限界点である。7 つ目に DPP-4 阻害薬の ACS 発症予防に関する検討について以下に記す。IVUS データにおいて、リナグリプチン投与によりプラーク量は減少したが、

その中の線維成分も減少していた。その理由として、より強い抗動脈硬化作用をもつ

スタチンの先行研究がある。スタチンを用いた臨床研究では、スタチン投与により

IVUS 上でプラーク量が減少するが線維成分の増加は見られなかった。その理由とし

(36)

34 て線維成分は量的変化よりもプラーク内の空間的分布が変化することがプラークの

安定性に寄与すると報告

⁷⁰

されている。本研究の IVUS 上でみられた線維成分の減少はプラーク抑制作用が認められているスタチンと同様の空間分布になったかは検討できなかった。また病理組織では、リナグリプチン投与により線維成分の空間的分布変化により、薄い線維性被膜の下に大きなプラークが存在する不安定プラークが減少したかは検討できなかったが、動脈硬化の病態で炎症の主体となるマクロファージの割合を評価した%Macrophage は減少を認めた。リナグリプチン群はコントロール群に比べプラークの安定化は断定できないが、プラーク形成の重要な要素となるマクロファージの割合は減少しており安定化につながる可能性は示唆される。つまり、ヒ

トでの臨床研究で見られるような Plaque 退縮や線維成分の増加が本実験では見られなかった。その理由として、本実験はウサギの冠動脈ではなく腕頭動脈を使用しており血管構造や血行動態が異なるため、プラークの性状や進展・退縮過程に関してヒト冠状動脈と同様な病態でないことが関係した可能性がある。腕頭動脈や冠動脈は血管構造や血行動態は異なるが、リナグリプチンにより抗炎症作用は示されており、長期にリナグリプチンを使用することで、ヒト冠動脈で見られるようなプラークの安定化所見が得られる可能性はある。

結論

(37)

35 遺伝性高コレステロール血症ウサギに対して 10mg/kg/日のリナグリプチン投与を 16 週間行い、腕頭動脈を IVUS で観察した結果、プラーク量の進展を抑制し、プラークの安定化にも寄与している可能性が示唆された。リナグリプチンは、慢性炎症状態にある動脈硬化症に対して抗炎症作用および抗動脈化作用を示した。

謝辞

(38)