神経変性疾患に対する新規治療薬開発を目的とした

(1)

神経変性疾患に対する新規治療薬開発を目的とした

レチノイン酸受容体アゴニストおよびムスカリン M

1

受容体ポジティブアロステリックモジュレーターに関する研究

2019

栗本恵実

(2)

Study on retinoic acid receptor agonists and muscarinic M

1

receptor positive allosteric modulators as novel therapeutic approaches

for neurodegenerative diseases Emi Kurimoto

Neurodegenerative disorders are characterized by chronic and progressive neuronal dysfunction and the loss of neurons in the specified regions of brain and/or spinal cord. Alzheimer disease (AD) and Parkinson disease (PD) are the most common age-related neurodegenerative disorders, affecting several millions of aged people worldwide. Both genetic susceptibility and environmental factors are believed to be responsible for these diseases. Although symptomatic treatments for both AD and PD are currently available, unfortunately, there are neither treatments that slow the neurodegenerative process nor sufficient treatments without severe side effects. A better understanding on the molecular mechanisms of these neurodegenerative diseases will help us to obtain effective drugs for treatment of AD and PD in future. Thus, the strategy for the development of potential neuroprotective drugs and effective drugs for symptomatic relief without severe adverse effects in patients with PD and AD, offers great challenge for basic science and clinical development. In this study, I investigated the following three issues to develop fundamental treatments for PD and beneficial treatments for AD.

1. Neuroprotective effects of retinoic acid receptor agonist on midbrain dopaminergic neurons as a potential therapeutic approach for treatment of PD.

Retinoids are reported to inhibit inflammatory responses in activated microglia, which is associated with the pathogenic processes of PD, although the roles of retinoic acid receptor (RAR) in regulation of dopaminergic neuronal death have not been investigated. In this study, I examined the effects of RAR agonists against interferon-γ/lipopolysaccharide (LPS)-induced dopaminergic neuronal death in midbrain slice culture. An RAR agonist Am80 protected dopaminergic neurons from microglia-mediated injury without affecting microglial activity. In addition, oral administration of Am80 could suppress LPS-induced degeneration of nigral dopaminergic neurons in mice. Next, I investigated the mechanisms of the neuroprotective effect of RAR agonist, and found that the neuroprotective effect of Am80 was mediated by up-regulation of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and its downstream signaling. These results suggest that activation of RAR is a promising approach to prevent dopaminergic neuronal death mediated by inflammatory responses.

2. An approach to discovering novel muscarinic M1 receptor positive allosteric modulators (M1

PAMs) with minimized gastrointestinal (GI) dysfunction as promising therapeutic agents for the treatment of AD.

Activation of muscarinic M1 receptor (M1R) is a promising approach for improving cognitive

(3)

impairment in AD. However, a selective M1 PAM, benzyl quinolone carboxylic acid (BQCA), induced diarrhea in mice via M1R activation. Moreover, BQCA augmented electric field stimulation-induced ileum contraction in an in vitro Magnus assay. Thus, I established a drug screening strategy to discover novel M1 PAMs producing potent cognitive improvement with minimized GI side effects. I assessed several PAM parameters of various M1 PAMs by using in vitro binding and functional analyses, and evaluated these M1 PAMs in the Magnus assay. The combined results revealed a significant correlation between augmentation of ileum contraction and their α-value, a PAM parameter associated with the binding cooperativity between acetylcholine and M1R. Indeed, in evaluations of in vivo profiles of two M1 PAMs with high and low α-value, the M1 PAM with low α-value showed wider safety margin between cognitive efficacy and diarrhea induction than the high α-value M1 PAM. These results suggest that fine adjustment of the α-value could be a key for discovering M1 PAMs yeilding potent cognitive improvement with a lower risk of GI side effects.

3. Exploration of translational biomarker for a novel M1 PAM TAK-071 in clinical development for the treatment of AD.

Based on the novel screening strategy for M1 PAMs, TAK-071 with low α-value was identified as a clinical candidate. In this study, I explored changes in quantitative electroencephalogram (qEEG) power bands, with scopolamine challenge, as a non-invasive translational biomarker for the effect of TAK-071 in cynomolgus monkeys. In line with clinical observations, scopolamine increased theta and delta power bands in a dose-dependent manner. Next, the effects of TAK-071 on scopolamine-induced qEEG spectral changes were examined. TAK-071 suppressed the scopolamine-induced increases in alpha, theta, and delta power bands. These results suggest that changes in theta and delta power bands in the context of scopolamine challenge could be used as translational biomarkers for the evaluation of TAK-071 in clinical studies.

In the current study, I demonstrated that RAR agonist Am80 showed prominent neuroprotective effects against dopaminergic neuronal death via recruitment of BDNF signaling in rat midbrain slice cultures. The neuroprotection by Am80 was also confirmed in a dopaminergic neurodegeneration model in mice in vivo. Thus, RAR agonists including Am80 could be novel and fundamental therapeutics for PD. Moreover, in the present study, I revealed a novel screening strategy for M1 PAMs with minimized GI dysfunction, leading to identification of TAK-071 as a clinical candidate. In addition, I determined the utility of qEEG analysis under the scopolamine challenge paradigm as a translational biomarker for TAK-071 efficacy in non-human primate. Overall, our findings suggest a safer M1 PAM is a valuable approach to treat AD, and would support the clinical development of M1

PAMs as effective drugs for symptomatic relief of AD without severe adverse effects.

(4)

緒言

神経変性疾患は慢性進行性の神経機能不全を呈する疾患であり、特定の脳領域または脊髄における神経細胞の消失を特徴とする。神経変性疾患の例としては、アルツハイマー病やパーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病および多発性硬化症が挙げられる。これらのうち、

アルツハイマー病とパーキンソン病は最も有病率の高い、代表的な加齢性の神経変性疾患であり、

世界的に見て数百万人の高齢者が罹患している

^1,2

。世界的な高齢者人口の増加にともなって、パーキンソン病およびアルツハイマー病は、先進国と新興国のいずれにおいても、医療経済的負担が大きく、公衆衛生上の重大な課題となっている。これら疾患に関して、遺伝学的素因や環境因子など、病因の解明は進められているものの、未だ不明な点は多い。また、現在のパーキンソン病およびアルツハイマー病の治療は対症療法に依存している一方で、既存の治療薬では重篤な副作用や病態進行に伴う有効性の低下が問題視されており、神経変性を遅らせる根本的治療薬はない。将来的には、これら神経変性疾患の原因となる分子メカニズムの解明が、有効な治療薬の開発に繋がると考えられ、神経保護作用を有する治療薬や副作用の少ない症状改善薬の開発が、基礎的研究および臨床開発の両面で非常に注目されている

³

。

パーキンソン病は安静時振戦、無動、筋固縮、姿勢反射障害を主症状とする

²

。パーキンソン病の有病率は

65

歳以上で

1%

、

85

歳以上になると

5%

までに上昇することから、病態の進行において加齢の影響が大きいとされている

⁴

。中脳黒質緻密部ドパミンニューロンの選択的な変性・脱落により、その投射先である線条体におけるドパミン遊離量が減少し、運動機能障害を生じることが明らかとなっている

⁵

。このドパミンニューロン死を引き起こす正確な病理学的メカニズムは解明されていないが、炎症性応答やミトコンドリア機能不全、興奮毒性、異常タンパク質の凝集が、パーキンソン病の進行に関わる重要な因子と考えられている。近年、他の脳部位に比べて中脳黒質緻密部にミクログリアが高密度で存在すること、また、パーキンソン病患者の剖検脳において活性化ミクログリアの蓄積が確認されていることから、中脳黒質緻密部に特異的なドパミンニューロン死とミクログリアの活性化による炎症性応答との関連性が示唆されている

^6,7

。現在、

パーキンソン病に対する第一選択はドパミン補充療法で、ドパミンの前駆物質であるレボドパが用いられる。また、ドパミン作動薬であるプラミペキソールやロピニロール、ブロモクリプチンも線条体でのドパミン受容体を活性化する目的で使用される

⁸

。このように、パーキンソン病治療の選択肢が対症療法に限られているため、神経変性を阻止して病態の進行を抑制する神経保護治療薬への期待が高まっている。

レチノイドとは、ビタミン

A

の活性代謝物である

all-trans-retinoic acid

（

ATRA

）や同様の活性をもつ合成化合物の総称であり、核内受容体であるレチノイン酸受容体（

RAR

）またはレチノイド

X

受容体（

RXR

）に結合する。

RAR

および

RXR

には、それぞれ

α

、

β

、

γ

の

3

種類のサブタイプが存在し、標的遺伝子の転写制御を介して細胞の分化・増殖および形態形成に関与することが知られている

⁹

。

RAR

は発生期のみならず、成体の脳内にも発現していることが確認されており、

近年、中枢神経系における記憶学習といった高次脳機能制御にも深く関与することが示唆されて

(6)

いる

¹⁰

。さらに、

ATRA

が、培養ミクログリアの活性化に伴って生じる誘導型一酸化窒素合成酵素や複数の炎症性サイトカインの発現を抑制することが報告され

^11,12

、ミクログリアの機能制御に

RAR

を介したシグナル伝達が寄与すると考えられる。このような背景から、炎症性応答に伴う中脳ドパミンニューロン死に対するレチノイドの作用を検証し、その作用機序を解明することは、

パーキンソン病に対する根本治療をもたらす新規治療薬開発に繋がると考えられる。

アルツハイマー病は認知症の主要因とされ、中核症状である進行性の認知記憶障害と、幻覚や妄想、抑うつ、攻撃的行動、徘徊といった行動・心理症状によって特徴づけられる

¹

。

65

歳以上の高齢者の罹患率は

11%

であり、

85

歳以上の高齢者では

33%

にまで罹患率が上昇することは

¹³

、加齢が本疾患の主なリスク因子であることを浮き彫りにしている。

1970

年代後半からの神経伝達物質の研究により、大脳皮質におけるアセチルコリン（

ACh

）量の低下がアルツハイマー病の主要因であるとするコリン仮説が最も有力な仮説として提唱されている

¹⁴

。これまでにアメリカ食品医薬品局が承認した

5

種の治療薬のうち

4

種が

ACh

の加水分解を抑制するアセチルコリンエステラーゼ阻害薬（

AChE-I

）である

¹⁵

。

AChE-I

によって軽度の症状改善が認められる一方で、吐気や嘔吐、下痢といった副作用を引き起こす。そのため有効性と安全性の高い新規治療薬が求められている。

複数の報告から、

ACh

受容体サブタイプのうちムスカリン

M1

受容体（

M1R

）の活性化がアルツハイマー病における認知機能障害の改善に有効であることが示唆されている

^16,17

。一方、臨床および非臨床試験において

M1R

の

ACh

結合部位に直接作用するオルソステリックアゴニストが顕著な薬効を発揮したが、

M1R

に対する選択性の低さが原因で消化管症状といった重篤な副作用が出現し、これらの薬物はいずれも臨床開発段階で開発中止に至った

^16,17,18

。また、

ACh

結合部位の構造は、ムスカリン受容体の全サブタイプにおいて相同性が高く、

M1R

選択的なオルソステリックアゴニストを創出することは困難である。そこで近年、

M1R

の

ACh

結合部位とは異なるアロステリック部位に結合することで

M1R

への選択性を示す活性化薬、すなわちアロステリックアゴニストおよびポジティブアロステリックモジュレーター（

PAM

）が注目されている。なかでも、

M1R

選択的な

PAM

（

M1 PAM

）はそのメカニズムとして、内因性リガンドである

ACh

が存在する条件下でのみ

M1R

シグナル伝達を増強することから、受容体脱感作の懸念が低いという点でも特に注目されている。このような背景から、選択的な

M1 PAM

の創出が、副作用の少ない新規アルツハイマー病治療薬に繋がると考えられる。

中枢神経系の治療薬開発の前期臨床試験において、開発化合物が脳内の目的とする標的に結合

して期待通りの作用を示すか否かを確認することは、開発の成功確率を上げる上で非常に重要と

なる。その際、非臨床と臨床を繋ぐ非侵襲性の定量的バイオマーカーが必須となる。中枢神経作

用薬については一般的にポジトロン断層法（

PET

）が使用され、脳内におけるリガンドと標的分

子との結合や分布を評価することが可能である。しかしながら

PET

による評価は、標的に対する

最適な放射性リガンドを入手できるか否かで制限され、また化合物と標的の相互作用を検出でき

る一方で、その機能的側面は評価できない。副作用を低減した新規

M1 PAM

を臨床開発に進める

上で非臨床と臨床を繋ぐバイオマーカーが必要となるが、

M1R

のアロステリック部位に結合する

最適な放射性リガンドはなく、

PET

に代わるトランスレーショナルバイオマーカーを探索する必

(7)

要がある。

そこで著者は、これらの背景をもとに、根本治療を目指す新規パーキンソン病治療薬としての

RAR

アゴニストの可能性、および、

M1 PAM

については、臨床開発を見据えた上での副作用を低減した新規アルツハイマー病治療薬としての可能性を明らかにするために研究を進めた結果、以下の新知見を得た。

(1)

インターフェロン

-γ

（

IFN-γ

）

/

リポ多糖（

LPS

）処置により、中脳培養切片内のグリア細胞が活性化され、一酸化窒素（

NO

）産生量の上昇を伴うドパミンニューロン死が惹起された。

RARα/β

アゴニストであるタミバロテン（

Am80

）は

IFN-γ/LPS

によるドパミンニューロン死

に対して、ミクログリアの活性化抑制ではなく、脳由来神経栄養因子（

BDNF

）の発現誘導およびその下流シグナルの活性化を介して神経保護効果を示した。

(2) M1R

への選択性が高い

M1 PAM

であっても、マウスにおいて

M1R

を介して下痢を誘発することが判明した。複数の

M1 PAM

を用いた検証により、マウス単離回腸の収縮作用と

PAM

パラメータの一つ（

ACh

と

M1R

との結合協同性を示す

α

値）との間に強い正の相関性を見出した。

副作用症状を回避した安全域の広い新規

M1 PAM

を見出すためのスクリーニング戦略を構築した。

(3)

副作用を低減した

M1 PAM

の臨床開発化合物として同定した

TAK-071¹⁹

に対するトランスレーショナルバイオマーカーとして、定量的脳波（

qEEG

）解析に着目した。サルにおいて非選択的ムスカリン受容体アンタゴニストであるスコポラミン存在下での

qEEG

パワースペクトル変化に対する

AChE-I

（ドネペジル）、

M1/M4R

アゴニスト（

xanomeline

）および

TAK-071

の作用を検証したところ、

θ

と

δ

波帯域に対する作用がトランスレーショナルバイオマーカーとして有望であることを明らかにした。

これらの研究成果について、以下に三章に分けて論述する。

なお、本文中および図中で使用した略号は以下の通りである。

ACh; acetylcholine

AChE-I; acetylcholinesterase inhibitor ATRA; all-trans-retinoic acid

Am80; tamibarotene

BDNF; brain-derived neurotrophic factor BQCA; benzyl quinolone carboxylic acid BSA; bovine serum albumin

CHO; Chinese hamster ovary Compound A;

(8)

3-fluoro-2-((2-(4-(1-methyl-1H-pyrazol-4-yl)benzyl)-3-oxo-2,3-dihydro-1H-isoindol-4-yl)oxy)benzonitrile Compound B;

7-(((1S,2S)-2-hydroxycyclohexyl)oxy)-2-(4-(1-methyl-1H-pyrazol-3-yl)benzyl)isoindolin-1-one Compound C;

3-((1S,2S)-2-hydroxycyclohexyl)-6-((6-(1-methyl-1H-pyrazol-4-yl)pyridin-3-yl)methyl)benzo[h]quinazoli n-4(3H)-one

Compound D;

2-(2-fluorophenyl)-5-(4-(1H-pyrazol-1-yl)benzyl)-2,5-dihydro-3H-pyrazolo[4,3-c]quinolin-3-one Compound E; 2-(4-(1-methyl-1H-pyrazol-4-yl)benzyl)-7-(2-(piperidin-1-yl)ethoxy)isoindolin-1-one Compound F; 2-(4-(1-methyl-1H-pyrazol-4-yl)benzyl)-7-(1H-pyrazol-5-yl)isoindolin-1-one

CREB; cAMP-response element binding protein EFS; electric field stimulation

ERK; extracellular signal-regulated kinase GDNF; glial cell line-derived neurotrophic factor GFAP; glial fibrillary acidic protein

IFN-γ; interferon-γ

iNOS; inducible nitric oxide synthase KO; knockout

LPS; lipopolysaccharide

MAP-2; microtubule-associated protein 2 MAPK; mitogen-activated protein kinase M1R; muscarinic M1 receptor

M4R; muscarinic M4 receptor NO; nitric oxide

PAM; positive allosteric modulator PBS; phosphate buffered saline PET; positron emission tomography PI3-kinase; phosphatidylinositol 3-kinase qEEG; quantitative electroencephalogram RAR; retinoic acid receptor

RXR; retinoid X receptor

RT-PCR; reverse transcription-polymerase chain reaction TAK-071;

4-fluoro-2-[(3S,4S)-4-hydroxytetrahydro-2H-pyran-3-yl]-5-methyl-6-[4-(1H-pyrazol-1-yl)benzyl]-2,3-dihy dro-1H-isoindol-1-one

TH; tyrosine hydroxylase WT; wild-type

(9)

第一章

新規パーキンソン病治療薬としての RAR アゴニスト Am80 の可能性 RAR 活性化を介した中脳ドパミンニューロンの保護作用

レチノイン酸受容体（

RARα

、

β

および

γ

）は細胞核内に存在し、

all-trans-retinoic acid

（

ATRA

）や他のレチノイドと結合して活性化する転写因子である。

RAR

はレチノイド

X

受容体（

RXRα

、

β

および

γ

）と呼ばれる別の核内受容体とヘテロ二量体を形成する。中脳黒質ドパミンニューロンにはビタミン

A

を

ATRA

へ変換する酵素が高発現していることから、

ATRA

が黒質線条体経路の神経発生と維持に重要な役割を果たすと考えられる

^9,20

。また、

RARα

および

β

の中脳ドパミンニューロンでの発現も確認されており、

RAR

を介したシグナル伝達がドパミンニューロンにおける遺伝子発現制御に関与することが示唆される

²¹

。加えて、パーキンソン病患者の死後脳解析の結果、中脳黒質内ドパミンニューロンにおいて

ATRA

合成必須酵素であるレチンアルデヒドデヒドロゲナーゼの

mRNA

発現量が顕著に減少していたことからも

²²

、

RAR

がパーキンソン病におけるドパミンニューロン死の制御に深く関与する可能性が示唆される。

パーキンソン病の発症過程において、ミクログリアの活性化を伴う炎症性応答の関与が広く知られており、中脳黒質における活性化ミクログリアの蓄積に伴うドパミンニューロン変性がパーキンソン病患者および動物モデルにおいて確認されている

^7,23,24

。また、中脳でのミクログリアの活性化によってドパミンニューロン特異的に細胞死が引き起こされることが、

in vitro

および

in vivo

試験系の両方で認められている

^25-27

。さらに、活性化ミクログリアに対する

ATRA

の作用も報告されており、

ATRA

による

RARβ

の活性化はミクログリアの活性化状態に依存し、リポ多糖

（

LPS

）による刺激条件下で抗炎症作用を示した

¹¹

。

本章では

RAR

アゴニストによるレチノイドシグナル活性化の炎症性ドパミンニューロン死に対する作用を検証し、新規パーキンソン病治療薬としての可能性を検討する。なお、本研究では

RAR

アゴニストとして

Am80

（タミバロテン）を使用した。

Am80

は、再発または難治性の急性前骨髄球性白血病の治療薬として日本でも上市されており、

RARα

および

β

に選択性を有する合成レチノイドである。

実験方法

試薬

本章で用いた試薬は以下の通りである。

ラット組換え型インターフェロン

-γ

（

IFN-γ

）、ヒト組換え型脳由来神経栄養因子（

BDNF

）およ

びラット組換え型グリア細胞由来神経栄養因子（

GDNF

）は全て

Pepro Tech

（

Rocky Hill, NJ

）より

購入した。

LPS

（

Escherichia coli, serotype 0111; B4

）は

Sigma

（

St. Louis, MO

）より、

K252a

は富士

フィルム和光純薬株式会社（

Osaka, Japan

）よりそれぞれ購入した。

PD98059

および

LY294002

は

Merck Millipore

（

Darmstadt, Germany

）より購入した。抗ヒト

BDNF

ポリクローナル抗体と、その

(10)

対照となる

IgY

は

Promega Corp.

（

Madison, MI

）より購入した。

Am80

、

TAC-101

および

HX630

は

既報

^28-30

の通り合成されたものを、乙卯研究所首藤紘一博士より供与いただいた。

培養中脳切片の調製および維持

生後

2-3

日齢の

Wistar/ST

ラット（日本

SLC

株式会社

, Shizuoka, Japan

）に氷中で低温麻酔をかけた。ハサミで断頭した後、頭蓋内より全脳を取り出し、氷冷した

Hanks

液に浸した。

Hanks

液は、

NaCl

（

137 mM

）、

KCl

（

5.4 mM

）、

Na2HPO4

（

3.4 mM

）、

K2HPO4

（

0.5 mM

）、

D-

グルコース（

5.6 mM

）および

HEPES

（

2.4 mM

）からなる溶液を、

95% O2/5% CO2

に

30

分以上曝気し、

1N NaOH

にて

pH

を

7.2

に調整後、孔径

0.22 μm

のフィルターで濾過滅菌したものである。約

1

分間氷冷した後、全脳を半球に切断し、

tissue slice chopper

（

NARISHIGE

、

Tokyo, Japan

）により厚さ

350 μm

の中脳冠状切片を作製した。培地にはウマ血清含有培地を使用し、その組成は、

50% minimum essential medium/HEPES

（

Thermo Fisher Scientific Japan

、

Tokyo, Japan

）、

25% Hanks balanced salt solution

（

）および

25%

非働化ウマ血清（

）からなり、本混合物に

6.5 mg/mL D-

グルコース、

2 mM L-

グルタミン、

10 U/mL penicillin-G/10 μg/mL streptomycin

（

）を添加したものである。実体顕微鏡下にて中脳黒質および腹側被蓋野を含む切片を分離し、直径

30 mm

の

Millicell-CM insert membrane

（孔径

0.4 μm

、

polytetrafluoroethylene

製

; Milipore

、

Bedford, MA

）上に

6

枚の切片を置き、

34°C

、

5% CO2

環境下で静置界面培養を行なった。培地交換は切片作製の翌日から隔日で行なった。

薬物処置

薬物処置は培養後

16-18

日に、薬物を含む

0.7 mL

の無血清培地で満たされた

6

穴プレートに、

6

枚の切片を含む

insert membrane

自体を移し変える方法で実施した。無血清培地は、

75% minimum essential medium/HEPES

、

25% Hanks balanced salt solution

からなり、本混合物に

6.5 mg/mL D-

グルコース、

2 mM L-

グルタミン、

10 U/mL penicillin-G/10 μg/mL streptomycin

を添加したものである。

免疫組織化学および組織学的評価

薬物処置終了後の培養切片を

4%

パラホルムアルデヒドを用いて固定した。

0.02%

過酸化水素含有メタノールで

30

分間処理することにより、内因性ペルオキシダーゼを失活させた。

0.2%

Triton-X

で

30

分間、膜の可溶化を行ない、

10%

ウシ胎仔血清（

FCS; JRH Bioscience

、

Lenexa, KS

）含有

PBS

で

30

分間ブロッキングを行なった後、

3%

ウシ血清アルブミン（

BSA

）溶液でウサギ由来抗チロシンヒドロキシラーゼ（

TH

）抗体（

Merck-Millipore

、

Darmstadt, Germany

）を

500

倍に希釈した一次抗体反応液中で

4°C

で一晩反応させた。ビオチン標識抗ウサギ抗体（

Vector Laboratories

、

Byrlingame, CA

）を

1% BSA

溶液で

200

倍希釈した二次抗体反応液と室温で

1

時間反応させた後、

アビジンビオチン複合体（

Vectastain Elite ABC kit; Vector Laboratories

）を室温で

1

時間反応させた。

その後、

0.07% 3,3 -diaminobenzidine tetrahydrochloride

および

0.005%

過酸化水素により抗原を可視

化させた。抗

TH

抗体で染色される細胞をドパミンニューロンと同定した。明瞭な輪郭と突起を

有する神経細胞を生存細胞として、顕微鏡観察により単位面積（

520× 670 μm²

）当たりの

TH

陽

性細胞を計数することにより薬物作用を評価した。

(11)

ミクログリアのマーカーである

CD11b

に関する免疫組織化学では、マウス由来抗

CD11b

（

clone OX-42; Serotec Ltd.

、

Oxford, UK

）抗体を

300

倍に希釈した一次抗体反応液と、ビオチン標識抗マウス抗体（

Vector Laboratories

）を

1% BSA

溶液で

200

倍希釈した二次抗体反応液を用いた。

RARα

と

RARβ

の発現確認には特異的な細胞マーカーとの二重蛍光染色法を用いた。ウサギ由来抗

RARα

抗体（

500

倍希釈、

sc-551; Santa Cruz Biotechnology

、

Santa Cruz, CA

）、ウサギ由来抗

RARβ

抗体（

500

倍希釈、）

sc-552; Santa Cruz Biotechnology

）、マウス由来抗

TH

抗体（

1000

倍希釈、

Sigma

）、マウス由来抗

microtubule-associated protein

抗体（

MAP-2; 500

倍希釈、

Sigma

）、マウス由来抗

CD11b

抗体（

500

倍希釈）およびマウス由来抗

glial fibrillary acidic protein

抗体（

GFAP; 1000

倍希釈、

Sigma

）を一次抗体として使用した。

Alexa Fluor 488

標識抗マウス

IgG (H+L)

抗体（

1000

倍希釈、

Molecular Probes

、

Eugene, OR

）を細胞マーカータンパクの検出に使用した。

Alexa Fluor 594

標識抗ウサギ

IgG (H+L)

抗体（

1000

倍希釈、

Molecular Probes

）を

RARα

および

β

の検出に使用した。

TH

とリン酸化

TrkB

および、

TH

とリン酸化

extracellular signal regulated kinase

（

ERK

）の共染色にも二重蛍光染色法を用いた。マウス由来抗

TH

抗体（

1000

倍希釈、

Sigma

）、ウサギ由来抗

TrkB

抗体（

phospho-Y515

、

500

倍希釈、

Abcam, Cambridge, MA

）および、ウサギ由来抗リン酸化

ERK1/2

抗体

[phospho-p44/42 MAP kinase (Thr202/Tyr204)

、

1000

倍希釈、

Cell Signaling Technology, Danvers, MA]

を一次抗体として使用した。

Alexa Fluor 488

標識抗マウス

IgG (H+L)

抗体（

1000

倍希釈、

Molecular Probes

）、および

Alexa Fluor 594

標識抗ウサギ

IgG (H+L)

抗体（

1000

倍希釈、

Molecular

Probes

）を二次抗体として使用した。

一酸化窒素（

NO

）産生量測定

IFN-γ/LPS

の処置により培養組織から遊離された

NO

量を、

NO

の代謝物である亜硝酸を指標と

してグリース反応により定量化した。薬物処置終了後、培地上清

100 μL

をグリース試薬（

1%

sulfanilamide

、

0.1% N-(1-naphthyl)ethylenediamine dihydrochloride

および

2.5% phosphoric acid

の水溶

液）

100 μL

と

22-25°C

で

10

分間反応させ、ジアゾカップリングにより生成したアゾ化合物の吸光

度を波長

540 nm

で測定した。検量線の作製には亜硝酸ナトリウムを用いた。

半定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（

RT-PCR

）解析

薬物処置後の中脳切片を

400 μL

の

ISOGEN

試薬（株式会社ニッポンジーン、

Tokyo, Japan

）に採取し、氷冷下で組織破砕して全

RNA

を抽出した。

RNA

量は

glyceraldehyde-3-phosphate

dehydrogenase

（

GAPDH

）の

mRNA

を用いて補正した。使用したプライマーを以下に示す。

Bdnf

（

D10938

）

Forward primer, 5 -GTGACAGTATTAGCGAGTGGG-3

産物

: 213bp Reverse primer, 5 -GGGTAGTTCGGCATTGC-3 TrkB

（

M55291

）

Forward primer, 5 -CACCAACCATCACATTTCTC-3

産物

: 265bp Reverse primer, 5 -ATCTGTCTCTCGTCCTTCCC-3

(12)

Gapdh

（

M17701

）

Forward primer, 5 -GCCAAGGTCATCCATGACAAC-3

産物

: 351bp Reverse primer, 5 -AGTGTAGCCCAGGATGCCCTT-3

RT-PCR

には

PrimeScript RT-PCR Kit

（

RR014A; TaKaRa

、

Shiga, Japan

）を用いた。

42°C 30

分、

95°C 5

分および

4°C 5

分の条件で逆転写反応を行なった。また

94°C 30

秒、

54°C 30

秒および

72°C 1.5

分を

30

サイクル実施して、

Bdnf

と

TrkB

の

PCR

反応を行なった。

Gapdh

の

PCR

反応には

94°C 30

秒、

60°C 30

秒および

72°C 1.5

分を

20

サイクル実施した。

PCR

産物は

1.5%

アガロースゲル電気泳動に供して検出した。

In vivo

実験

これまでに報告されている手順にしたがって

³¹

、

8-10

週齢の

C57BL/6

マウスの片側の中脳黒質に

LPS

を微量注入した。ペントバルビタール（

45 mg/kg

）の腹腔内投与によってマウスに麻酔をかけ、リン酸緩衝食塩水（

PBS

）に溶解させた

1 μg/μL LPS

を片側脳の定位座標に注入した。注入部位の座標は、

bregma

から

2.8 mm

後方、正中線から

1.3 mm

外側、硬膜表面から

4.5 mm

腹側の位置とした。

LPS

注入側の反対側には同量の

PBS

を注入した。注入部位の同定には

1%

phthalocyanine blue

溶液（

Sigma

）を用いた。

30

ゲージの針を用いて溶液

1 μL

を

1

分以上かけて注入し、注入後

3

分間、針を維持した後、引き抜いた。

Am80

は

0.5%

カルボキシメチルセルロース溶液に容量

10 mg/mL

で懸濁し、連続した

5

日間（

1

日一回、午後

4

時）、マウスに

10 mg/kg

で経口投与した。対照群となる動物には溶媒を投与した。動物への

LPS

注入は

Am80

の投与開始

2

日目の午前

9

時から

12

時の間で実施した。

LPS

投与後

7

日目に、ペントバルビタールでマウスに再度麻酔をかけ、

PBS

に続き

4%

パラホルムアルデヒド溶液で経心灌流固定を行なった。脳を単離し、さらに

2

日間

4%

パラホルムアルデヒド溶液で固定した後、

4°C

で一晩

20%

スクロース溶液に浸漬した。凍結後、中脳冠状切片を

厚さ

30 μm

で作製し、

120 μm

ごとに注入部位付近の

5

枚を選び、スライドに封入した。培養中脳

切片で使用した

TH

抗体を用いて免疫組織化学を行なった。一次抗体と二次抗体の希釈倍率は、

それぞれ

500

倍と

300

倍であった。免疫反応性は

Vectastatin Elite ABC Kit

により可視化した。中脳黒質内の外側部分における

TH

陽性細胞数を各切片で計数し、各脳半球について

5

枚の切片の平均値をデータ化した。

統計解析

実験結果は平均値±標準誤差（

SEM

）で表記した。統計学的有意性は

one-way ANOVA

での検

定を行なった後、

Student-Newman-Keuls test

によって評価した。有意確率が

5%

未満の場合を統計

学的に有意であるとした。

(13)

実験結果

第一節炎症性応答によるドパミンニューロン死に対するレチノイドの作用

培養中脳切片における炎症性ドパミンニューロン死に対する

RAR

アゴニスト

Am80

の作用これまでの報告と一致して

³²

、培養中脳切片への

IFN-γ

（

50 ng/mL

）の

24

時間処置と、それに続く

LPS

（

10 μg/mL

）の

72

時間処置により、

TH

陽性ドパミンニューロン数の有意な減少が観察された（図

1-1B

および

C

）。残存した

TH

陽性細胞は神経突起が萎縮しており、対照群に比べて状態が悪化していた（図

1-1B

左）。

CD11b

に対する免疫組織化学の結果から、

IFN-γ/LPS

処置により、ミクログリアの形態も円〜楕円状の活性化型へと変化している様子が観察された（図

1-1B

右）。

RAR

アゴニストの

Am80

（

30-300 nM

）を

LPS

と

72

時間共処置すると、

IFN-γ/LPS

誘発性ドパミンニューロン死は

Am80

の濃度依存的に抑制された（図

1-1C

）。なお本研究の予備的検討において、

Am80

単独の

72

時間処置の場合

10 μM

まで濃度を上げても

TH

陽性細胞数に影響がないことを確認している。

Am80

によるドパミンニューロンの保護作用は、

TH

陽性生存細胞数が増加することに加えて、

TH

陽性の樹状突起の形状が良好に維持されていることからも示された（図

1-1B

および

1C

）。以後の試験では、ドパミンニューロンに対して明らかな保護作用を示した濃度

である

300 nM

を

Am80

の処置濃度として使用した。

これまでに、

IFN-γ/LPS

によるドパミンニューロン死の誘導は、活性化ミクログリアに発現する誘導型一酸化窒素合成酵素による

NO

の産生に依存することが報告されている

^26,32

。本研究の実験条件においても、

IFN-γ/LPS

処置によって培地上清中の亜硝酸塩濃度が上昇したことから、

NO

産生量が増加していることが示唆された（図

1-1D

）。しかし、

Am80

は

IFN-γ/LPS

の誘発する

NO

産生量の上昇には何ら影響を及ぼさず（図

1-1D

）、またミクログリアの活性化型への形態変化

に対しても著明な効果を及ぼさなかった（図

1-1B

）。したがって、

Am80

のドパミンニューロン保

護作用はミクログリアからの

NO

産生の抑制によるものではないことが示唆された。

(14)

図

1-1

ラット培養中脳切片における

IFN-γ/LPS

誘発性ドパミンニューロン死に対する

Am80

の作用

（A）Am80 の化学構造式。（B）培養中脳切片における

TH（左）およびCD11b（右）に対する免疫組織化学の典

型画像。対照群の切片（最上段）、

IFN-γ

（

50 ng/mL

）の

24

時間処置に続き、

72

時間

LPS

（

10 μg/mL

）処置した切片（中段）および

IFN-γ

の

24

時間処置後に、72 時間

LPS

と同時に

Am80（300 nM）処置した切片（下段）

。画像中のスケールバーは

100 μm

。（

C

および

D

）

IFN-γ/LPS

処置によるドパミンニューロン生存細胞数（

C

）および培地中の亜硝酸濃度（

D

）の変化に対する

Am80

の作用。

Am80

は、

IFN-γ

（

50 ng/mL

）の

24

時間処置後の切片に、

72

時間

LPS

（

10 μg/mL

）と共処置した。各群で検討された切片数は

16-20

枚。亜硝酸濃度には

4-5

サンプル分の値を使用し、独立した

4

回の試験を実施した。P < 0.01、*P < 0.001（vs. 対照群）。#P < 0.05、##P < 0.01、###P

< 0.001

（

vs. IFN-γ/LPS

処置群）。

(15)

培養中脳切片における炎症性ドパミンニューロン死に対する

RAR

アゴニスト

TAC-101

および

RXR

アゴニスト

HX630

の作用

Am80

と同様に選択的

RAR

アゴニスト活性を有する

TAC-101

（

Am555S

）の作用を検討した

^29,33

。

TAC-101

は

Am80

とは異なる置換基を有する化学構造を特徴とする（図

1-2A

）。

TAC-101

（

0.3-3 μM

）の処置は、

IFN-γ/LPS

による生存ドパミンニューロンの減少を有意に抑制した（図

1-2B

）。一方で、

TAC-101

は

IFN-γ/LPS

による培地中の亜硝酸濃度の上昇には影響しなかった（図

1-2C

）。

核内受容体である

RAR

は、一般に

RXR

とヘテロ二量体を形成して標的遺伝子の発現を調節することから

⁹

、

RXR

アゴニストも

RAR

アゴニストと同様のドパミンニューロン保護効果を示す可能性が考えられた。そこで、

RXR

アゴニストとして

HX630

を使用し

³⁴

、同様の検討を行なった

（図

1-2D

）。

HX630 (1-10 μM)

は、

IFN-γ/LPS

により誘発される生存ドパミンニューロン数の減少および亜硝酸濃度の上昇のいずれに対しても顕著な作用を示さなかった（図

1-2E

および

2F

）。

図

1-2

ラット培養中脳切片における

IFN-γ/LPS

誘発性ドパミンニューロン死に対する

RAR

アゴニスト（

TAC-101

）および

RXR

アゴニスト（

HX630

）の作用

（

A

）

TAC-101

の化学構造式。（

B

および

C

）

IFN-γ/LPS

処置によるドパミンニューロン生存細胞数（

B

）および培地中の亜硝酸濃度（C）の変化に対する

TAC-101

の作用。TAC-101 は、IFN-γ（50 ng/mL）の

24

時間処置後の切片に、

72

時間

LPS

（

10 μg/mL

）と共処置した。各群で検討された切片数は

15-38

枚。亜硝酸濃度には

5-9

サンプル分の値を使用し、独立した

3

回の試験を実施した。（

D

）

HX630

の化学構造式。（

E

および

F

）

IFN-γ/LPS

処置によるドパミンニューロン生存細胞数（

E

）および培地中の亜硝酸濃度（

F

）の変化に対する

HX630

の作用。

HX630

は、

IFN-γ（50 ng/mL）の24

時間処置後の切片に、72 時間

LPS（10 μg/mL）と共処置した。各群で検討された切片数

は

14-19

枚。亜硝酸濃度には

3-4

サンプル分の値を使用し、独立した

3

回の試験を実施した。

*P < 0.05

、

**P < 0.01

、

***P < 0.001（vs.

対照群）。##P < 0.01、###P < 0.001（vs. IFN-γ/LPS 処置群）。

(16)

培養中脳切片における炎症性ドパミンニューロン死に対する

RAR

アゴニスト（

Am80

）と

RXR

アゴニスト（

HX630

）の共処置の効果

先述の通り、

RAR

の作用に関する古典的メカニズムでは、

RAR

は

RXR

とヘテロ二量体を形成することにより標的遺伝子のレチノイン酸応答配列上で転写調節因子として機能すると考えられている

⁹

。そこで

RAR

と

RXR

の協調性の観点から、

HX630

が

Am80

のドパミンニューロン保護作用に対して相乗効果を発揮するか検討した。

Am80

（

30 nM

）を

IFN-γ

処置時から併用し、

HX630

（

3

および

10 μM

）を

Am80

および

LPS

と

72

時間共処置した条件下では、

Am80

によるドパミン

ニューロン保護作用が有意に阻害され、予想とは逆の結果が得られた（図

1-3A

）。また、これまでの結果と同様に、培地中の亜硝酸濃度には変化が認められなかった（図

1-3B

）。

図

1-3

ラット培養中脳切片における

IFN-γ/LPS

誘発性ドパミンニューロン死に対する

RAR

アゴニスト（

Am80

）と

RXR

アゴニスト（

HX630

）の共処置による作用

（

A

および

B

）

IFN-γ/LPS

処置によるドパミンニューロン生存細胞数（

B

）および培地中の亜硝酸濃度（

C

）の変化

に対する

Am80

と

HX630

共処置時の作用。Am80（30 nM）は、IFN-γ（50 ng/mL）の

24

時間処置時から

72

時間の

LPS

（

10 μg/mL

）処置時も含めて計

96

時間処置した。

HX630

（

1-10 μM

）は

IFN-γ

と

Am80

での

24

時間処置後の

切片に、

72

時間の

LPS

および

Am80

と共に処置した。各群で検討された切片数は

17-35

枚。亜硝酸濃度には

5-8

サンプル分の値を使用し、独立した

3

回の試験を実施した。

***P < 0.001

（

vs.

対照群）。

###P < 0.001

（

vs. IFN-γ/LPS

処置群）。+P < 0.05。

(17)

In vivo

でのドパミンニューロン変性に対する

Am80

の作用

雄性

C57BL/6

マウスの片側中脳黒質内に

LPS

（

1 μg

）を注入し、ドパミンニューロン変性を惹

起した。

LPS

注入後

7

日目において注入側における

TH

陽性細胞数は反対側に比べて有意に減少した（図

1-4A

および

4B

）。

LPS

注入の前日から

Am80

（

10 mg/kg

）を連続

5

日間経口投与したところ、ドパミンニューロン数の減少は有意に抑制された（図

1-4A

および

4B

）。

Am80

（

10 mg/kg

）の経口投与による全身性の副作用は確認されなかった。

図

1-4 Am80

の

in vivo

でのドパミンニューロン保護作用

（A）中脳上方に

LPS（PBS 1 μL

中に

1 μg）を注入した7

日後におけるマウス中脳切片（矢頭は黒質を示す）の

典型画像（左）。反対側には同量の

PBS

を注入した（右）。マウスに溶媒または

Am80

（

10 mg/kg

）を

LPS

注入前

日から連続して

5

日間経口投与した。画像中のスケールバーは

500 μm。

（B）LPS 誘発中脳黒質ドパミンニューロ

ン数の減少に対する

Am80

の作用を

TH

陽性細胞数で評価した。溶媒投与群は

10

例、

Am80

投与群は

8

例。

*P < 0.05

。

(18)

第二節炎症性応答によるドパミンニューロン死に対する Am80 の保護作用機序

培養中脳切片における

RARα

および

RARβ

タンパク質発現

Am80

が標的とする細胞種を同定するため、培養中脳切片において

RARα

および

RARβ

と細胞種特異的マーカーとの免疫組織化学を実施した。

RARα

の免疫反応は

TH

陽性細胞の大多数で検出され、全般的なニューロンのマーカーである

MAP-2

陽性細胞とも共局在した（図

1-5A

）。一方で、

CD11b

で同定されたミクログリアの一部において

RARα

の発現が検出されたものの、大部分のミ

クログリアでは

RARα

の発現は認められなかった。また、

GFAP

陽性細胞であるアストロサイトにも

RARα

の発現は観察されなかった。

RARβ

についても同様の発現が確認され、

TH

陽性ドパミンニューロン、

MAP-2

陽性ニューロン、および

CD11b

陽性ミクログリアの一部に検出されたが、

GFAP

陽性アストロサイトでの発現は観察されなかった（図

1-5B

）。加えて、各

RAR

アイソフォ

ームの細胞内局在を検討したところ、

RARα

が細胞質に顕著に発現していたのに対し、

RARβ

は細

胞質および核内の両方に発現が認められた。発現細胞種に関する同様の結果は、

Am80

（

300 nM

）

を

72

時間処置した後の切片についても得られた。ただし

Am80

処置後の組織では、ドパミンニュ

ーロンを含む神経細胞の神経突起において

RARα

および

RARβ

の発現が著明に増加していた（図

1-5C

および

5D

）。

(19)

図

1-5

ラット培養中脳切片における

RAR

発現細胞種の同定

RARα

および

RARβ

に対する免疫反応は細胞種特異的なマーカーに対する免疫反応と共に検出した。ドパミンニューロンマーカーとして

TH

、全般的なニューロンのマーカーとして

MAP-2

、ミクログリアのマーカーとして

CD11b、およびアストロサイトのマーカーとしてGFAP

を使用した。（A）二重免疫蛍光組織化学における共焦点

画像では、未処置の培養中脳切片における各細胞種マーカー（左）、

RARα

（中央）、マージ画像を示す。（

B

）二重

免疫蛍光組織化学における共焦点画像では、未処置の培養中脳切片における各細胞種マーカー（左）、

RARβ

（中

央）、マージ画像を示す。矢頭はいずれの抗体にも陽性であった細胞の典型例を示す。（

C

および

D

）

300 nM

の

Am80

を

72

時間処置した際の培養中脳切片における

RARα（C）およびRARβ（D）の典型画像。矢頭はRAR

陽性

の神経突起を示す。画像中のスケールバーは

50 μm

。

(20)

Am80

の神経保護作用への神経栄養因子の関与

レチノイドの中枢神経系に対する作用の一部に、神経栄養因子やそれらの受容体をコードする複数の遺伝子の発現制御が関わることが報告されている

³⁵

。

Am80

のドパミンニューロン保護作用における神経栄養因子シグナルの関与を検討するため、

IFN-γ/LPS

誘発性ドパミンニューロン死に対する代表的な神経栄養因子の作用を検証した。その結果、ニューロトロフィンファミリーの一つである

BDNF

（

3-30 ng/mL

）がドパミンニューロンに対して濃度依存的かつ有意な保護作用を示すことを見出した（図

1-6A

）。次に、生理的条件下および病態時にドパミンニューロンの生存に主要な役割を果たすとされる神経栄養因子である

GDNF

の作用を検討した

³⁶

。

GDNF

（

3-30

ng/mL

）は

IFN-γ/LPS

誘発性ドパミンニューロン死に対して有意な効果を示さなかった（図

1-6B

）。

Am80

の神経保護作用における

BDNF

およびその高親和性受容体である

TrkB

の

mRNA

発現量への影響を検討した。半定量的

RT-PCR

解

析から、

Am80

（

300 nM

）の処置により培養中脳切片における

BDNF mRNA

発現量が時間依存的

に増加することが示された（図

1-6C

）。それに対し、同濃度の

Am80

は最長

48

時間の処置を行な

っても

TrkB mRNA

発現量には何ら影響を及ぼさなかった（図

1-6D

）。

図

1-6

ラット培養中脳切片における

IFN-γ/LPS

誘発性ドパミンニューロン死に対する神経栄養因子の作用

（A および

B）IFN-γ/LPS

処置によるドパミンニューロン生存細胞数の減少に対する

BDNF

（A）および

GDNF

（B）

の作用。

BDNF

および

GDNF

は、

IFN-γ

（

50 ng/mL

）の

24

時間処置後の切片に、

LPS

（

10 μg/mL

）と共に

72

時間処置した。各群で検討された切片数は

11-21

枚。***P < 0.001（vs. 対照群）。###P < 0.001（vs. IFN-γ/LPS 処置群）。

（

C

および

D

）半定量的

RT-PCR

解析を用いた、

BDNF

（

C

）および

TrkB

（

D

）の

mRNA

発現量に対する

Am80

の

作用。各

mRNA

量は

GAPDH mRNA

量によって補正した。培養中脳切片に

Am80

（

300 nM

）を提示した時間で処

置し、各群には

6

枚のスライスを一つのサンプルとして

RT-PCR

に供した。グラフ上に対応する

mRNA

の典型例

を示した。BDNF および

TrkB

の検討にはそれぞれ各群

5

サンプル用いた。**P < 0.01（vs. 対照群）。

(21)

Am80

の神経保護作用に対する

BDNF

シグナル阻害の影響

Am80

の神経保護作用における

BDNF

シグナルの寄与について検討する目的で、

TrkB

の特異的阻害薬である

K252a

を用いた。

K252a

（

0.3-3 μM

）の

Am80

との同時添加により、

Am80

のドパミンニューロン保護作用は濃度依存的に抑制された（図

1-7A

）。次に

TrkB

の下流シグナルにある

phosphatidylinositol 3-kinase

（

PI3-kinase

）の関与を、その阻害薬である

LY294002

を用いて検討した。これまでの報告で

PI3-kinase

は

BDNF

の神経栄養活性に関わる分子とされている

³⁷

。

LY294002

の処置により、

Am80

によるドパミンニューロン生存細胞数の増加が抑制され、

30 μM

で統計学的に有意な抑制作用が認められた（図

1-7B

）。次に

ERK

シグナルの関与を検討するため、

mitogen-activated protein kinase

（

MAPK

）

/ERK kinase

阻害薬として

PD98059

を使用した。

PD98059

（

10-100 μM

）の

Am80

との共処置によっても、

Am80

のドパミンニューロン保護作用が減弱した

（図

1-7C

）。さらに、抗

BDNF

中和抗体の作用を検証した。ドパミンニューロンに対する

Am80

の保護作用は、抗

BDNF

中和抗体の共処置により阻害されたが、対照として使用した

IgY

では明確な作用が認められなかった（図

1-7D

）。

図

1-7

ラット培養中脳切片における

Am80

のドパミンニューロン保護作用に対する

BDNF

シグナルの影響

Am80

によるドパミンニューロン保護作用に対する

TrkB

阻害薬

K252a（A）

、PI3-kinase 阻害薬

LY294002（B）

、

MAPK/ERK

阻害薬

PD98059

の影響。

K252a

、

LY294002

および

PD98059

と

Am80

は、

IFN-γ

（

50 ng/mL

）での

24

時間処置後の切片に、72 時間

LPS（10 μg/mL）と共に処置した。各群で検討された切片数は8-20

枚。***P < 0.001

（

vs.

対照群）。

###P < 0.001

（

vs. IFN-γ/LPS

処置群）。

+P < 0.05

、

++P < 0.01

、

+++P < 0.001

。（

D

）

Am80

によるド

パミンニューロン保護作用に対する抗

BDNF

抗体の影響。抗

BDNF

中和抗体または

IgY

（各

5 μg/mL

）と

Am80

は、

IFN-γ

（

50 ng/mL

）での

24

時間処置後の切片に、

LPS

（

10 μg/mL

）と共に

72

時間処置した。各群で検討され

た切片数は

13-21

枚。***P < 0.001（vs. 対照群）。###P < 0.001（vs. IFN-γ/LPS 処置群）。++P < 0.01。n.s.は有意差

なしを示す。

(22)

Am80

の作用における

TrkB

シグナルの関与をさらに明らかにするため、培養中脳切片のドパミンニューロンにおける

TrkB

のリン酸化レベルの変化について検証した。培養中脳切片に

Am80

（

300 nM

）を

72

時間処置したところ、

TH

陽性細胞におけるリン酸化

TrkB

の免疫反応性が増大

した（図

1-8A

）。また、この

Am80

の作用は抗

BDNF

中和抗体を同時に処置することによって遮断された（図

1-8A

）。

ERK

は

TrkB

の下流の分子として機能するだけでなく、レチノイドの非ゲノミック作用にも関与するため

³⁸

、次に

Am80

による

ERK

の活性化について免疫組織化学で検証した。

Am80

処置開始後

24

および

72

時間の時点でドパミンニューロンにおける

ERK1/2

のリン酸化が増大した（図

1-8B

）。また、抗

BDNF

中和抗体を

Am80

と同時に処置した場合、処置後

24

時間ではリン酸化

ERK1/2

の増加が見られたのに対し、処置後

72

時間の

ERK1/2

リン酸化は抑制された（図

1-8B

）。

図

1-8

ラット培養中脳切片のドパミンニューロンにおける

TrkB

および

ERK1/2

のリン酸化に対する

Am80

の影響

（

A

）抗

BDNF

中和抗体（

5 μg/mL

）の非存在下または存在下において培養中脳切片に

Am80

（

300 nM

）を

72

時間処置し、TH（赤）およびリン酸化型

TrkB（緑）陽性細胞を免疫組織化学で検出した共焦点顕微鏡画像。矢頭は両

抗体に対する陽性細胞を示す。画像中のスケールバーは

50 μm

。（

B

）抗

BDNF

中和抗体（

5 μg/mL

）の非存在下または存在下において培養中脳切片に

Am80

（

300 nM

）を

24

または

72

時間処置し、

TH

（赤）およびリン酸化

ERK1/2

（緑）陽性細胞を免疫組織化学で検出した共焦点顕微鏡画像。矢頭は活性化

ERK1/2

を有する

TH

陽性細胞を示す。

画像中のスケールバーは

50 μm。

(23)

考察

成体の脳内における

RAR

の役割は、発達期に比較するとほとんど明らかにされていないが、

本研究において

RAR

が病態時の神経細胞死を制御する可能性が見出された。本章における検討では、（

1

）

RAR

の活性化がミクログリアによる炎症性障害から中脳黒質ドパミンニューロンを保護する一方で、ミクログリアの活性化自体には影響しない、（

2

）臨床適用可能な

RAR

アゴニストの経口投与によって

in vivo

での中脳黒質ドパミンニューロン変性が抑制される、および（

3

）

RAR

刺激は、

BDNF

シグナルの活性化を介してドパミンニューロン保護作用を発揮する、という

3

つの新たな知見を得た（図

1-9

）。

図

1-9

活性化ミクログリアによるドパミンニューロン死に対する

Am80

の保護作用機序

初代培養細胞等を用いた複数の報告において、レチノイドがミクログリアからの

NO

や炎症性サイトカインの産生を阻害することが示されている

^11,12

。また、パーキンソン病患者の中脳黒質の病理学的特徴の一つとして活性化ミクログリアの蓄積が知られており、

NO

がドパミンニューロン変性に関与する可能性も示唆されている

^6,7,24

。本研究においては、炎症性応答に伴うドパミンニューロン変性を再現するため、培養中脳切片への

IFN-γ/LPS

処置モデルを使用した

³²

。本モデルについては、ドパミンニューロン死の誘導において

NO

が主要な役割を果たすことが明らかにされている

²⁶

。当該モデルを用いて

RAR

アゴニストである

Am80

の作用を検討したところ、

Am80

は

IFN-γ/LPS

の誘導するドパミンニューロン死に対し顕著な抑制作用を示した（図

1-1C

）。

その一方で、

Am80

は

NO

産生に影響しなかったことから（図

1-1D

）、これまでの報告とは異なり、

Am80

の保護効果にはミクログリアの活性化抑制以外のメカニズムが関与することが示唆された。

既報と異なる結果が得られた原因としては、実験系の相違が影響した可能性が考えられる。培養

中脳切片ではミクログリアは脳組織構造中に保持されるため、初代培養とは異なる反応性を示す

可能性がある。また別の相違点としては、使用したレチノイド化合物の違いが挙げられる。

Dheen

神経変性疾患に対する新規治療薬開発を目的とした