遺 伝 点突然 変 異 瘍 け 本人 甲状腺腫

金沢 大 学十 全 医 学 会雑 誌 第

1 0

4巻 第

1

号

1 卜 2 5

(

1 9 9 5

)

日本 人^の甲状 腺 腫瘍^にお ける

r α ∫

遺伝子点突 然変異

一 穿 刺吸引細 胞を用

^い

た検 討 ^‑

金 沢 大 学 医学 部 内 科 学第 ^一講 座 ( 主 任^: 小林 健 ^一教授)

早 川 哲 雄

1 5

欧 米 人の甲状 腺 腫 瘍

で は

, r α ∫遺伝 子の変 異

^が

腫瘍 形 成^の初期 段 階

^で

生

じ て

い

る

^こ

と が

報 告

^さ

れ

て

い

る

.

し か し

, こ の こ

と を 日

本 人^の甲状 腺 腫 瘍

^を

対 象

^{と し て}

検 討

した

報 告

は

少

な

い ･ 本研 究

で は

,

4 2

例^の甲状 腺腫 瘍^に

お け る H

‑^,

^K

^‑,

N

^‑r 耶遺 伝 子

そ

れ ぞ

れ

^につい

て

, コ

ド

^ン

1 2 と61

の点 突然 変 異^の有 無

を P C R

法

^と

^スロ ッ ト

プ

^ロ ッ ト^ハ

イ プ

リ

ダイ ゼ

^ー シ ョソ法

を

用^い

て

検 討

し た

^･

21 ゲ

^ー

ジ

針

で

得 ら

れ た

穿 刺

^吸

引 細胞

^を

使^い乳 頭癌

7

例, 未 分化 癌

1

例

か ら

,

ま た

新 鮮手 術 標 本

を 用

^い濾 胞 腺 腫

1 1

乳 腺 腫 様 甲 状腺 腫

⁶

胤 乳 頭 癌

1 5

例, 濾 胞 癌

¹

札 未 分 化 癌

1

例

か ら D N A を

抽 出

^{し た}

^. 抽 出

し た D N A を

,

H

‑^.

^K

^‑,

^N

^{‑r a S コ}

^ド

^ン

1 2 と 61

に関

し

て

P C R

法

に よ り

増 幅

し

, コ

ド

ン

1 2 で は 正

常 型 以外^に

8

穫 猟 ^コ

^ド

^ン

6 1 で ほ 8

種類^の点 突 然 変異 特 異 的

^プ

^{ロ ー}

^ブ を 用

^いよ ス ロ ッ ト

ブ

^ロ ッ ト^ハ

イ プ

リ

ダ イ

ゼ ^ー シ ョ ソ法

で

変 異r α∫遺伝 子

を

検 出

し た

■ 手術 標 本^の良 性 腫 瘍で

ほ

, 濾 胸 腺 慮

1

例

と

腺 踵 様 甲状 腺 慮

1

例

で

点 突 然 変 異

を

認

め た

^･

ま た

手術 標 本 甲 悪性 腫 瘍

^{で は}

^, 濾 胞 癌

¹

例

で

点 突 然変 異

が

検 出

さ

れ

た が

, 乳 頭 痛, 未 分化 癌

で ほ

変 異

は

認

め な か

っ

た

･

一 方 穿 刺 吸 引細 胞

で ほ

▲ 乳 頭 痛, 未 分化 癌

と

も, r α∫遺伝

子

^の変 異

^ほ

検 出

さ れ

な

か

っ

た

･ 穿 刺 吸 引細 胞

と

新 鮮 手 術標 本の結 果

を

合

わ

せ

る と

, 良性 腫 瘍

^{で は}

濾胞 腺 腰

^{1 1}

例 中

1

例(

^{9 %}

=^こ, 腺 腫 様 甲 状腺 腫

6

例 中

1

例

(1 7 %

) ^に点 突 然 変 異

を

認

め た

･

しか し

, 悪 性腫 瘍

^{で は 2 5}

例 中濾 胞 痛^の

1

例に点 突然 変 異

を

認

め た

の

み で

, 乳 頭 胤 未 分 化 癌

^で ほ

r α∫遺 伝 子^の変 異

^は

検 出

さ れ な か

っ

た

^･

ま た

, 変 異r α∫遺伝 子

を

認

め た

濾 胸 腺 鼠 腺 腰様 甲 状腺 魔^の症 例

は

, 変 異

を

認

め

な

か

っ

た

症 例

と

比^べ

て

臨 床像^に特 異

な

点

ほ な か

っ

た

･ 以

上 よ り

, r α∫遺 伝 子^の変 異

は 日

本

人

の甲 状腺 腫 瘍^で

ほ

欧米

人

^のもの に比

べ

る と

少

な

く, 限

られ た

^一 部^の症 例^{で の}

^み

腫 瘍 形 成^に関 与

し

て い

る 可

能 性

が

考

え ら れ た

^.

ま た

. 穿 刺

^吸

引細 胞

を 用

^い

た

^{化 ∫}遺 伝 子変 異^の解 析

^ほ

, 術 前遺 伝

子

診 断

と し

て施 行

可

能

で

あ

る が そ

の有

用

性

^{に は}

限 界

^が

あ

^る

も^の

と

思

わ れ た

^.

K e

y

^{w o r}

d

s J^a

p

^{anes e}

t

h

_y

r oid n e o

p

la s m , r a S On C O

g

^{en e,}

p

^Oin

t

m u

t

a

t

ion,f in e^‑ne edle a s

p

ira

t

io n ,

P C R

本邦^に

^お

け

る

甲 状腺^の結 節 性 病 変^の有 病 率

ほ

, 検診

で

見^い出

さ れ る

も^の

だ け

^でも 腺 腫 あ

る

^い

ほ

腺 腫 様 甲 状 腺 塵^で

⁰

^.

⁵

^〜

2

^･

4 %

^{l )}, 甲状 腺 癌^で

⁰

^.

^{1 2}

^〜

⁰

^.

^{6 3 %}

^{1 ト 3 )}

と か な り

^の高 頻 度^に認

め ら れ る

^･

ま た

ト踵 瘍 性病 変^に限^っ

て

も 良 性^の濾胞 腺 歴

か ら

予 後 良 好

な

分 化 癌

で

あ

る

乳頭 癌

^や

濾 胞 癌,

予

後^の極 度^に悪^い未 分 化痛

ま

で様^々

な

生 物 学 的悪 性度

を

有 す

る

もの

が

含

ま れ る た め

, 甲状 腺 結 節 性 病 変^の適 確

な

診断

と

適 切

な

治 療 方 針^の決 定

^{ほ 日}

常 診療

上

重 要^であ

^る

^. 今

日

上 座瘍^の術 前 診 断

と し

て穿 刺

吸

引 細 胞 診

が

行

わ れ て お り

, 特^に乳 頭 癌^の診 断^に

ほ

感 度, 特 異 性

^と

も^に高く

そ

の有

用

性

^が

評価

^{さ れ}

^{て い}

^る

^{4 〉.}

^{し か し}

, 濾 胞 腺 歴

と

濾 胞 痛^の 鑑 別

ほ

穿 刺

吸

引細 胞 診^でも

し ば し ば

困 難

で

あ

り

, 腫 瘍 摘 出衝後

に組 織 像

を

詳 細^に検 討

し て

初

^め

^て良 性

^か

悪 性

^{か が}

判 明 す

る

^こ

と が

多^{い こ}

と や

, 腺 腰 様 甲 状 腺 腫 内^に生

じ た

結 節

が

単

な る

過 形成

であ

る か

, 腺 腫 あ

る

^い

ほ

病 歴であ

る

^の

か

につい ても 診 断 困難

な

こ

と が

あ

^る

等, 穿 刺 吸 引 細 胞 診 も完 成

さ れ た

診 断 技 術

^{と は}

言^い 難^{い .}

近 年の分子 生 物 学 的 研 究^の進 歩^に

よ り

, 腫 瘍^の形 成^に

は

少

な

く

と

も

5 な

^い

し 6

種 類 以

上

の癌 遺 伝 子, 癌 抑 制 遺 伝 子^の異 常

が

関 与

し

て い

る

^こ

と が 明 ら か と な り

^{5 )}, 甲 状 腺 腫 瘍^に

^お

^い

^て

も,

r d ∫. m ツ^C,rれ 圧

点

,p

5 3

等^の癌 遺 伝 子^の変 異 あ

る

^い

ほ

発 現 異 常

^が

腫 瘍化

を

も

た ら し

て い

る 可

能 性

^が

推定

^{さ れ}

^{て い}

^る

^6).

そ

^の中で

も^{r α∫}遺 伝 子^の変 異

^は

欧 米

人

^に

お け る

甲 状 腺腫 瘍^で

は

比 較 的 高 頻 度

で

あ

り

,

L

e m oin e

ら

^{T )8 )}

は

濾 胞 癌

1 5

例 中

B

例, 乳 頭 癌

^{1 0}

例 中

2

例^に,

S

u a r e z

ら

^{9 一}

は

乳頭 癌

^{1 3}

例 中

8

例^に,

N

a m

b

a

ら

^{1 0)}

は

乳 頭 癌

1 4

例 中

3

例に 化 ∫遺 伝

子

変 異

を

認

め た と

述^べ

て

^い

る

. こ

れ ら

の報告^で

は

, 濾 胞 腺腫

な ど

^の良 性 腫瘍^でも 変 異

^を

認

^{め る}

場 合

^が

あ

^る

^こ

と よ り

^{r α∫}遺 伝

子

^の点 突 然 変 異

ほ

腫 瘍 形成^の初 期^の段 階

に生ず

る 可

能 性

が 示

唆

さ れ

^{て い}

る

^{8) 1 8 )}.

一 方

で ほ K

a rga

ら

^{1 t)}の

よ う

に, 濾 胞 癌

^{1 4}

例 中遠 隔 転 移

を

認^め

た 2

例^の

み

^{に rα∫}遺伝

子

変 異

を

認

め

,

rd ∫ 遺伝

子

変異

と

生 物 学 的悪 性 度

と

^の相 関

を 示

唆

^し た

報 告 も あ

る

.

し か し

, 甲 状 腺 腫 瘍^に

お け る

変 異 ^rαJ 遺伝 子^の 検 討

^で

報 告

さ れ た

も^の

は

ほ

と ん ど が

欧 米

人 と

く^に白 人

を

対 象

と した

も^{の で}あ

り

, 本邦^{で の}検 討

ほ

少

な

^い. 甲 状腺 腫 瘍^の発 症 頻 度

^は

各 阻織 型 別^に

^{み た}

場合, 国 あ

る

^い

ほ

地 域 毎に

か な り

異

な

っ

て い

る

^こ

と よ り

, 腫 瘍 化^に

は

環 境

因 子 が

大 き

な

影 響

を

及

ぼ し て

い

る と

考

え ら れ

て い

る

^{1 2)}.

平 成⁶ 年^{1 2}月1 4 日受付, 平 成7 年1 月2 3 日受 理

A b br evia

t

io ns: A r

g

^{, a r}

g

inin e

;

As

_p

, aS

p

^{a r a}

t

ic acid

;

C

y

s, C

y

S

t

ein e ; d U T P, de o x

y

^{u r}idin e 5^,‑

t

ri

_p

ho s

p

ha

t

e

;

E C L, enha n c ed chemi 1u min e s c e n ce

;

F , fe m ale

;

F N A , fine^‑needle as

p

ir a

t

io n

;

G A P, G T Pase ac

t

iv a

t

in

g p

^ro

t

ein

;

G ln,

g

lu

t

a mine

;

G l

y

,

g

l

y

cin e

;

H R P, ho rs

､^eradish

^p

^{e r o xida s e ; L}

^y

^s,1

^y

^sine

^;

^{M , m al e}

1 6

本 研 究

で は

,

日

本 人^の甲状 腺 腫 瘍^に

お

け

る 牲

,

K

^‑,

N

‑^{r α∫}遺 伝 子

そ れ

ぞ

れ

^の変 異^の有 無^{につい て},

P C R

法

^と

^{ス ロ} ッ

ト プ

^ロ ッ

ト

^ハ

イ プ リ ダ イ ゼ

^ー シ ョソ法

を 用

い て検 討

し た

^.

ま た

巨腫 瘍 摘 出手 術 以 前^の遺 伝 子 診 断 法

^{と し て}

^の

^可

能 性

を

調^べ

る 目

的^で, 材 料

と し て

新 鮮 手 術 標 本^に加

え て

穿 刺 吸 引 細 胞

を

用^い

た

検 討 も 行^っ

^た

^.

材 料

お

よび 方 法

Ⅰ

. 対 象

1 9 9 2

年

4

月

か ら1 9 9 4

年

2

月

ま で

に金 沢 大 学 医学 部 附 属 病 院 第

一 内科

^{お よ び}

関連 病 院^に

^て

得

ら

れ

た

甲 状 腺 穿 刺 吸 引 細 胞

8

例

と

, 甲 状腺 腫 瘍

と し て

手 術

さ れ た

新 鮮 手 術 標 本

3 4

例^の合 計

4 2

例

を

対 象

と し た

^. 穿 刺 吸 引 細 胞

は

甲状 腺 腫 瘍

を

超 音波 誘 導 下

で 21 ゲ

^ー

ジ

針

^で

穿 刺

^し

注 射 簡 内^の陰圧^に

^{よ り}

吸 引 す

^る

^こ

^と

^に

^{よ り}

採 取

し

^{1 3 )},

‑

8 0 ℃ で

保 存

し た

^.

ま た

新 鮮 手術 標 本

は

標 本^{の 一} 部

を

‑

8 0 ℃

で保 存

^{し て}

使 用

^した

^. 甲 状腺 腫 瘍^の診 断

^は

甲 状腺 癌取 扱

い規 約^‖) に従っ

た

^. 穿刺 吸 引 細 胞

^は

乳 頭癌

⁷

例, 未 分 化 癌

¹

例

であ

り

, 新 鮮 手 術 標 本

ほ

濾 胞 腺腫

1 1

例, 腺 腫 様 甲 状 腺腫

6

例,

乳 頭癌

1 5

例, 濾 胞 癌

¹

例, 未 分 化 癌

¹

例

^で

あ^っ

^た

( 表

¹

)^.

‡

^. 方 法

1

.

D N A

抽 出

穿刺 吸引 細 胞

か ら

^の

D N A

の抽 出

ほ F

^e

i

n m e s s e r

ら

^{1 5)の}方 法

を 用

^い , 吸 引 物

を 5 00

/^上

l

の溶 解 緩 衝 液 (

^{P C R}

反 応 緩 衝 液

【

^{1 0}

^m

^{M T}

^r

ⁱ

^s‑

^{H C l}

(p

H 8

.

3)

,

5 0

m

M

塩化^カ

^{リ ウ}

^ム,

1

.

5

m

M

塩 化^マ

グ ネ

シ

ウ

^ム,

0

^.

0 0 1

% ゼ ラ チ ^ン】^,

0

^.

4 5 %

ノ ^ニ

デ

ッ

ト P 4 0

(

^B

^{o e}

^h

^r

ⁱ

ⁿge r

M

a n n

h

e

i

m ,

M

a n n

h

e

i

m ,

G

e r m a ny)^,

⁰

^.

^{4 5 % ト}

^ウ

^ィ

^ー

ン

2 0

(

B

o e

h

r

i

ng^{e r}

M

a n n

h

e

i

m),

1 0 0

_FLg/ ^m

^{l プ}

^{ロ テ}

^ィ

^{ナ ー ゼ}

^K

(

^B

^{o e}

^h

^r

ⁱ

ⁿge r

M

a n n

h

e

i

m)) ^に

^{5 6 ℃ で 4}

^{時 間 保 温 後,}

^{1 0 0 ℃}

^で

^{1 0}

分 間 加 熱

し

,

3 0

^〜

8 0

/^J

l を P C R

に使

用 し た

^.

ま た

, 新 鮮 手 術標 本^の

D N A

の抽 出

は D ＼A

抽 出

キ

ッ

ト

(

S

tr atage n e,

C

a

lif

o r n

i

a,

しS A

)

を

使

用 し

,

4 0

^〜

2 5 0

mg の標 本

^を

粉 砕

^し

, 蛋 白分 解 酵 素,

R N

a s e で分 解 後,

D N A を

^エ タ ノ ^ー ル

で

沈 殿

し

,

T E

緩 衝 液

(

^{1 0}

^m

^{M T}

^r

ⁱ

^s‑

^{H C l}

^,

⁰

^.

¹

^m

^{M E D T A}

) に溶解

し

,

1

^〜

8 0

F^L

l を P C R

^に 用^い

た

^.

2

^.

P C R

H

‑^,

^K

^‑,

^N

^{‑r a S 遺 伝 子}

^{そ れ}

^ぞ

^れ

^{の コ}

^ド

^ン

⁽

^{c o}

^d

^{o n)}

^{1 2 と}

^コ

^ド

^ン

6 1

に関

し

て

P C R

法^{1 6 j}

を

行^っ

た

^.

プ

ラ

イ

^{マ ー}

ほ

r d ∫

プ

^{ロ ー}

ブ プ

ラ

イ

^{マ ー セ} ッ

ト (

和 光, 大 阪)

^を

使

^{用 し た}

(表

²

)^. 各 標 本

^{よ り}

抽

T

a

bl

e

l

.

H i

sto

l

og

i

c a

l

c

h

a r a cte r

i

st

i

c s o

f

t

h

yr o

i d

n e op

l

a s m s

C

y to

l

o盲y

bi

sto

l

og ァ

N

u m

b

e r o

f

s a mp

l

e s

A

sp

i

r ate

d

c e

ll

s

R

e s e cte

d

tu mo r s

B

e n

i

gn

F

o

lli

c u

l

a r a

d

e n o m a s

A d

e n o m ato u s g^o

i

t_{e r s}

M

a

li

_gn a nt

P

ap

i11

a ry ^{c a r c}

i

n o m a s

F

o

lli

c u

l

a r c a r c

i

n o m a

A

n ap

l

a st

i

c c a r c

i

n o ma s

T

a

bl

e

2

.

P

r

i

m e r s u s e

d

to s c r e e n

f

o r r a s po

i

nt m utat

i

o n s

C

o

d

o n

0 1i

_go n u c

l

e ot

i d

e s

H

^‑r a S

1 2 5

^'

G G A G C G A T G A C G G A A T A T A A 3

^'

3

^'

c T C A C C T C T A T A G T G G G G T C 5

^'

K

^‑r a S

1 2 5

^P

A T G A C T G A A T A T A A A C T T G T 3

^'

3

^'

c T C T A T T G T T G G A T C A T A T T 5

^'

N

r^{r a s}

^{1 2 5}

^'

^A T G A C T G A G T A C A A A C T G G T 3

^■

3

^'

c T C T A T G G T G G G A T C A T A T T 5

^'

H

^‑raS

6 1 5

^'

c c T G C A G G A T T C C T A C C G G A 3

^r

3

^'

T T C A C C T G T A C T G G T G G A T G 5

^'

K

^‑r a S

6 1 5

^'

G A T T C C T A C A G G A A G C A A G T 3

^'

3

^‑

c T A T A A T G G T G A A T A T C T T C 5

^'

N

^‑raS

61 5

^'

G A T T C T T A C A G

^･

A A A A C A A G T 3

^'

3

^'

c T (‡T A G A G G T T A A T A T C C G C 5

^'

日

本人の甲 状 腺腫 瘍^濫

お

け

る

r β ∫遺伝 子 点 突 然変 異

出

^{し た D N A}

^に,

一 対の

プ

ラ

イ

^{マ ー} (

5 0 0

F^Lg/^m

^l

)

2

F^L

l

,

P C R

反 応 緩 衝 液, デ

オ キ

シ

リ ボ

ヌ クレ チ

オ ド

混 合 液 [

d A T P

,

d G T P

,

d C T P

･

d T T P

各

^{5 0 0}

F^L

M

(

^{P h}

a r m a c

i

a,

U

p ps a

l

a,

S

w e

d

e n)],

T

aq

D N A ポ リ

メ ラ ^q ゼ(

P

e r

k i

n^‑

E l

m e r

C

etu s,

N

o r w a

lk

,

U S A

)

²

^.

5

単位

を

加

え

, 滅 菌 蒸 留 水^に

よ り

全 量

^{1 0}

恥

^d

^に調整

し た

^. 加 熱^の 際

に

起 き

る

反 応 液^の蒸発

を

防 く^‑

た め

, 反 応 液^に

5 0

〃

1

の ミ

ネ

ラ ル オ

イ

ル (

S i

gm a,

S

t.

L

o u

i

s,

U S A

)

を

重 層

し た

^. 反 応に

ほ D N A

ミ^ニ サ

イ

ク ラ ^ー (

^M

J

R

e s e a r c

h

,

M

a s s a c

h

u s etts,

U S A

)

を

使 用

し

, 熱 変性

を9 4 ℃

,

1

分 間, ア^{ニ ー}

リ

ン

グ を5 5 ℃

,

1

分

1 7

間,

D N A

の伸 長

を7 2 ℃

^L,

2

分 間

^{と し}

, これ

を 1

^サ

イ

ク ル

と し て 3 0

サ

イ

ク ル繰

り

返

^した

^. 反 応 終

^了

後, ク^{ロ ロ}

ホ

ル ム

1 0

恥

1 を

加

え

振 逸

し

,

上

層^に増 幅 後^の

D N A

溶 液

^を

得

^た

^.

^{D N A}

溶 液

1 0

p

l を

,

3

% 低 融 点^ア

^ガ

^{ロ ー ス}

^ゲ

^ル(

F M C

,

R

o c

k l

a n

d

,

U S A

) ^に

D N A

分 子 量^{マ ー} カ^ー

9

(和 光)

と

共^に電 気 泳 動

^し

, 紫 外 線 照 射

に

よ り

約

1 0 0

塩基^の長

さ を

持^つ蛍 光^{バ ン}

ドを

確 認

した

^.

3

. ス ロ

ッ

ト プ

^ロ ッ

ト

^ハ

イ プ リ ダ イ

ゼ ^ー ショ ン

増 幅

し た D N A 2

〟

1 を

, ス ロ ッ

ト プ

^ロ _ッ

ト

^ハ

イ プ リ ダ イ

ゼ ^ー シ ョ ン 法^{' 7)} に使

^{用 し た}

^.

^{D N A} を

ナ

イ

^{ロ ン} 膜 (

A

m e r s

h

a m,

T

a

b l

e

3

･

A ll

e

l

e^‑SPe C

ifi

c o

li

_go n u c

l

_{e o}t

id

e pr o

b

e s u s e

d

to s c r e e n

f

o r r a s ge n e p^o

i

nt m ut_at

i

o n s

C

o

d

o n

O li

go n u c

l

e ot

id

e s

A

m

i

n o a c

id

s c o

d

_e

d f

o r

b

y

t

h

e

w i 1d

a n

d

m uta nt c o

d

o n s

廿

r a s

1 2 G T G G G C G C C

旦 旦旦

G G T

T G C A G C C G C G T C G A C G C C K

ィ^α∫

1 2 G T T G G A G C T G G T

N

^‑raS

1 2 G G A G C A G G T

G T G G G Gl

yc

i

n e

C

yste

i

n e

S

e r

i

n?

A

rg

血

^In e

V

a

li

n e

A

spa r a亡

i

c a c

id Al

a n

i

n e

G G C G T A G G T G T

A G T C G T G T T G A T G C で

G G T G T T G G G A A T G T

A G T C G T G T T G A T G C T

H

‑^{r a S}

^{61 A C C} G C C G G C C A G G A G

G A G T A G A A G C T G C G G C C G C A T C A C K

,^raS

^{6 1 A C A} G C A G G T C A A G A G

G A G T A

G l

yc

i

n e

C

_yste

i

n e

S

e r

i

n e

A

rg

i

口

i

n e

V

a

Ii

n e

A

spa r at

i

c a c

id A l

a n

i

n e

G l

yc

i

n e

C

yste

i

n e

S

e r

i

n e

A

rg

i

n

i

n e V_a

li

n e

A

^spa r at

i

c a c

id A l

an

i

n e

G l

uta m

i

n e

G l

uta m

i

c a c

id T

e r m

i

n at

i

o n c o

d

on

L

ys

i

n e

L

e u c

i

n e

A

rg

i

n

i

n e

P

_{r o}

li

n e

H i

st

id i

n e

H i

st

id i

ne

G A G T A G l

uta m

i

n e

T A A T

e r m

i

n ation c o

d

o n

A A A L

ysine

G A A G l

uta m

i

c a ci

d

C T A L

e u c

i

n e

C C A P

r o

li

n e

C G A A

rg

i

n

i

n e

C A T H i

st

idi

ne

C A C H i

st

idi

n e

N

^‑r a ∫

61 A C A G C T G G A

￡ A 皇

G A A G A G T A

G A A T A A A A A C G A C T A C C A C A T C A C

G l

uta m

i

n e

G l

^uta m

i

c a c

id T

e r m

i

n at

i

o n c o

d

o n

L

_ys

i

n e

A

rg

i

n

i

n e

L

eu c

i

n e

p

ro

li

n e

H i

st

id i

n e

H i

st

id i

n e

F

u

ll

s equ e n c e o

f

w

ild

_{t y p}e o

li

go n u c

l

e ot

id

e p^{r o}

b

e s

i

s s

h

o w n^.

L i

ste

d b

e

l

o w t

h

e m a r e C O

d

o n s

w i

t

h

t

h

e ap pr op^r

i

ate s l ng

l

e

b

a s e s u

b

st

i

tut

i

o n s^.

1

畠

B

u c

k i

ng

h

a r n s

h i

r e^.

U K ) 上

^に

H Y B R I

‑

^{S L O T M}

^{a n}

^if

^o

^{ld ( B R L}

^･

G

a

i

^t

h

e r s

b

u rg^.

しS A

)

^を

使 用

L ブ

^ロ ッテ ィ ン

グ を

行^い,

8 0 ℃

,

2

時 間

^加

熱 固定

し た

^.

汁

^t

K

‑^･

^N

‑^{r d ∫ コ}

^ド

^ン

^{1 2 で は 正}

^{常 型 以 外に}

⁶

種 項^の点 突然 変 異^の

^プ

^{ロ ー}

^{ブ を}

^,

^{ま た}

^コ

^ド

^ン

^{61 で は 8}

種 頼^の点 突 然 変 異^の

プ

^{ロ ー}

ブ を 剛

^､

た

.

プ

ロ ^ー

ブ は

用 ∫

プ

^{ロ ー}

ブ プ

^ラ

イ

マ ^ー セ ッ ト

(

和 光)

^を

使

用 し た (

衰

3 )

^{. ハ}

イ プ

リ

ダ イ

^{ゼ ー シ}ョ ン

は

^{エ ン ハ ン ス}

ド

^{ケ ミル ミ}

ネ

ッ セ ン ス

(

e n

h

a n c e

d

c

h

e

m i 1

u m

i

n e^‑ s c e n c e.

E C L

)

3

^,一^{オ リ ゴ ラ ベ}

^リ

^ン

^グ

^{･ 検 出シ ス テ ム}

^{( A}

^{m e r s}

^h

‑

a m)

を

使^い.

^A

^{m e r s}

^h

^{a m} 社^の

プ

^ロ

ト

^{コ ー} ル に従^い

^プ

^{ロ p}

^ブ

^の

3

^･ 末 端

を

フ ル

オ

^{し セ}

イ

^ン 修 飾

^{デ オ}

^{キ シ}

^ウ

^リ

^ジ

^{ン 三}

^リ

^ン 酸

(d

e o xy^{u r}

idi

n e

5

‑^】tr

ⁱ

^p

^h

^{o sp}

^h

^atel

d t: T P ) で

標 識

^し

, ハ

イ プ リ ダ イ

ゼ ^ー シ ョン

を 4 2 ℃

,

2

時 間 行^っ

^た

^. 洗 浄

は

各

プ

ラ

イ

^{マ ー}

ご と

に

条 件

を

変

え て

行^{い, ホ ー ス ラ}

^デ

^{ィ ッ シ ュ ペ ル}

^オ

^{キ シ}

^ダ

ー ゼ

(h

o r s e r a

di

s

h

pe r o xi

d

a s e.

= R P

) 標 識 抗^{フ ル}

^オ

^レセ

^イ

^ン抗 体

と

検 出試 薬

^を

用^い

て

化 学 発 光

を

発 生

さ せ

,

そ れ を X

線^フィ ル ム

( K

o

d

a

k

^.

N

e w

Y

o r

k

.

U S A

) ^に

^{1 0}

^〜

^{3 0}

分東 光

さ せ て

記 録

^{し た}

^･

N ^{‑ r a ぶ}

c od ^{o n} 1 2

K ^‑ r a C Od o ⁿ

e喜宗^芸もぎ O p^{e rat}io n

O p ^{er at}ぬ^門 戸N Å

成 績

t

.

p C R

産 物

^の

確 認

穿 刺吸 引 細 胞

と

新 鮮 手 術 標 本^の

^{そ れ}

ぞ

れ か ら

得

ら れ た D ＼ A

に対

^{し て P C R を}

行^い,

P C R

産 物

^と

分 子 量^{マ ー カ ー}

^を

^ア

^ガ

^ロ

ス

ゲ

^ルに電 気泳 動

L た (

図

^{1 )}

^. 穿 刺 吸 引細 胞, 新 鮮 手 術 標 本^い ず

れ

の

P C R

産 物 も 同

じ よ

う

に

約

1 0 0

塩 基^の長

さ を

持つ

D ＼ A

断 片

を

認

^め

, 穿 刺

^吸

引 細 胞

^{か ら}

得

ら れ た

微 量^の

^{D N A か ら}

も,

度^の

P C R

で充 分

な

増 幅

^{が か か}

^っ

^て

^い

^る

^こ

^{と が}

確 認

さ れ た

^･

l

.

ス

ロッ ト プ^ロ･ソト^ハ

イ

プ

リ

ダ

イ ゼ

^ー

シ

ョン

1

^. 新 鮮 手 術 標 本

1

) 良性 腫 瘍

(

図

2 )

濾 胞 腺 踵^の

1

例

^で

,

H

‑^{7･d ∫ コ}

^ド

^ン

^{6 1}

^{の検 討に}

^お

^い

^て

^,

^正

^{常 型}

( C A G )

^の

プ

^{ロ ー}

ブ

に

加 え て

点 突 然 変 異

( C G G )

^の

プ

^{ロ ー}

ブ

^へ の

結 合

を

認

^め

,

C A G

^→

C G G ( グ

ル タ ミン ^→ アル

ギ

^{ニ ン}

)

^の点突 然 変異

^が

検 出

さ れ た

^.

し か し

, 他^{の コ}

^ド

^ンで

^は

変 異 型^の

プ

^{ロ ー}

ブ

守

10 0 b p

F i

g^.

1

^･

A

_ga r o s e ge

l

e

l

e ctr op

h

r e s

i

s o

f P C R

‑^{a m p}

^lifi

^e

^{d D N A}

^･

^{F N A}

^･

^fi

^{n e}‑^{n e e}

^{d l}

^{e a sp}

ⁱ

^{r atio n･}

T

a

bl

e

4

^.

P

r e v

a l

e n c e o

f

r a s po

i

nt m utat

i

o n s

i

n t

h

y^{r o}

id

n e op

l

a s m s

H i

sto

l

og y

N

u m

b

e r o

f

c a s e s e x a m

i

n e

d B

e n

i

gn

F

o

lli

c u

l

a r a

d

e n o m a s

A d

e n o mato u s g^o

i

te r s

M

a

li

gn a nt

P

ap

ill

a ry c a r c

i

n o m a s

F

o

11i

c u

l

a r c a r c

i

n o m a

A

n ap

l

a st

i

c c a r c

i

n o m a s

N

u m

b

e r (

%

) o

f

c a s e s

w i

t

h

m utat

i

o n s

日

本 人^の甲状 腺 腫 瘍^に

^お

け

^る

^{用 ∫}遺 伝 子 点 突然 変 異

W ild

C A G A ÅG

靴 淵 恕 漉紺 蝕蝕廟知憾

Åd

e rl 臼 m a

モ

O Li S

⊆ヨ

⁰

主短

r

3

り

4 ^､‑ 5

6 ^‑‑‑㍉

7 ^{榔 ン}

執 ^∴∵ヰ 詣∴ ■攣 1 0 ^ぶ′･

朋

瑠 ^触醸

2 ^疇●

3 4

5 ^瑚姉

$ ^､■■

1

9

F i

_g^.

2

^▲

S

equ e n c e^‑SP^{e C}

ifi

c o

li

go n u c

l

e ot

id

e

h

y

b

r

i di

z at

i

o n o

f P C R

‑^{a m} P

lifi

e

d D N A f

r o m s u rg

i

c a

ll

y‑^{r e S e Cte}

^{d b}

^{e n}

ⁱ

gn n e op

l

a s m s to p^{r o}

b

e s

f

o r

H

‑^{raS C O}

^d

^{o n}

⁶¹

^{a n}

^{d K}

‑^{ra S C O}

^d

^{o n}

^{1 2}

^･

^{T h}

^{e m u t a nt pr o}

^b

^e

^f

^{o r}

^H

T^{ra S C O}

^d

^{o n}

⁶

¹

⁽

^{a rg}

ⁱ

ⁿ

ⁱ

^{n e･}

^A

^rg

^{) h}

^y

^b

^r

^{id i}

^{z e}

^d

^{t o}

^{D N A f}

^{r o m}

c a s e

5

0

f f

o

11i

c u

l

a r a

d

e n o m a, a n

d

t

h

e m u t a n t pr o

b

e

f

^{o r}

K

‑^{r a S C O}

^d

^{o n}

^{1 2 (}

^{a spa r a t}

ⁱ

^{c a c}

^id

^,

^A

^sp

^{) h}

^y

^b

^r

^{id i}

^{z e}

^d

^{t o}

^{D N A f}

^{r o m c a s e}

²

⁰

^f

a

d

e n o m ato u s go

i

t e r^.

G l

n^, g

l

uta m

i

n e ;

L

ys^.

1

ys

i

n e ;

G l

y^,g

l

yc

i

_{n e :}

C

ys,CyS t e

i

n e･

T

a

bl

e

5

.

P

at

i

e nts a s s o c

i

ate

d

w

i

t

h

ras m utat

i

o n s

P

at

i

e nt

A

_ge

S

e x

H i

sto

l

og y

T

u mo r siz e

M

eta st_{a s}

i

^sL}

n u m

b

e r b^{Te a r S}) (^{c m})

M

utat

i

o n

S i

^te

C

odo n

1 7 3 F F

o

lli

c u

l

a r a

d

e n o m a

3

^.

5

×

2

^.

5

2 6 2 F A d

e n o m ato u s go

i

te r

2

×

1

.

4

3 4 3 M F

o

lli

c u

l

a T C arC

i

n o ma

4

^×

2

.

5

H

^‑r aS C O

d

o n

61

,

C A G

^→

C G G

(

^{G l}

^{n →}

^A

^rg)^b)

K

^‑r a ∫ C O

d

o n

1 2

,

G G T

^→

G A T

(

^{G l}

y ^→

A

sp)^b)

H

^‑ra S C O

d

o n

61

^.

C A G

^→

C G G

(

^{G h}

^→

^A

^rg)^{b )}

F

,

f

e m a

l

e;

M

, m a

l

e;

G l

n, g

l

uta m

i

n e;

A

rg^, a rg

i

_n

i

n e;

G l

y^,g

l

_yc

i

n e;

A

sp^{, a S}Pa r at

i

c a c

id

･

1l ‑

, n O m eta Sta S

i

s.

b)

A

m

i

n o a c

i d

s c o

d

e

d f

o r

b

y t

h

e w

ild

a n

d

m uta nt c o

d

^{o n s a r e s}

h

o w n

i

n

b

r a c

k

ets･

2 0

へ の結 合

は

認

め

ず ‥点突 然 変 異

は

検 出

さ

れ

な か

っ

た

^{. 一} 方 腺 腫 様 甲 状腺 踵^で

^は

.

K

‑^{r a S コ}

^ド

^ン

^{1 2 で l}

例^の

^み

^,

^正

常 型^の

G G T

の

プ

^{ロ ー}

ブ

に加

え

て点 突 然 変 異^の

G A T

^の

プ

^{ロ ー}

ブ で

も結 合

^を

認

^め

,

G G T

^→

G A T

(

^{グ リ}

^{シ ン → ア ス パ ラ}

^ギ

^ン酸) ^の点 突 然 変 異

が

検 出

さ れ た

^.

し か し

, 他^のコ

ド

^ンで変 異 型^の

^プ

^{ロ ー}

^ブ

^への結 合

^は

認

^{め な か}

^っ

^た

^.

2

) 悪 性 腫 瘍 ( 図

3

)^●

濾 胞癌^の

1

例

で

,

H

≠ 那 ^コ

ド

ン

6 1

の検 討^に

お

い

て

正 常 型^の

C A G

^の

プ

^{ロ ー}

ブ

に加

え て

点 突 然 変 異^の

^{C G G}

^の

^プ

^{ロ ー}

^ブ

^に対

し て

も結 合

を

認

め

,

C A G

^→

C G G

(

グ

^{ル タ ミン → ア ル}

ギ

^{ニ ン}) ^の 点 突 然 変 異

^が

検 出

^{さ れ た}

^.

^{し か し}

, 他^{の コ}

ド

ン

で は

変 異 型^の

プ

ロ ^ー

ブ

^への結 合

は

認

め

な

か

っ

た

^.

ま た

乳 頭 癌

1 5

例, 未 分 化 癌

¹

例^で

^は

全 例 正 常 型^の

^プ

^{ロ ー}

^ブ

^への結 合

し か

認

め

ず, 変 異r α∫遺 伝 子

は

検 出

さ れ

な

か

っ

た

^.

2

. 穿 刺 吸 引細 胞 ( 図

⁴

)

乳 頭 痛

7

例, 未 分化 癌

1

例

と

も,

H

^‑,

K

^‑,

N

･^{r d ∫ コ}

^ド

^ン

^{1 2 と6 1}

で

, 新 鮮 手 術 標 本^の場 合

と

同

じ

く

正

常 型^の

プ

^{ロ ー}

ブ で は

結 合

を

認

め た が

, 変 異型^の

^プ

^{ロ ー}

^{ブ で ほ}

結 合

^を

認 ず 変 異^{r α∫}遺 伝 子

^は

検 出

さ れ な か

っ

た

^.

Ⅲ

.

H

^‑,

K

^‑,

N

^‑r α∫ 遺 伝 子

^の

^コ

^ド

^ン

^{1 2 と6 1 の}

突 然 変 異 ( 表

4

)

穿 刺 吸 引細 胞

^と

新 鮮 手 術 標 本^の結 果

を

合

わ せ る と

, 良性 腫 瘍

で は

濾 胸 腺 踵

1 1

例 中

1

例 (

^{9 %}

) ^に, 腺踵 様 甲状 腺腫

⁶

例 中

¹

例 (

^{1 7 %}

) ^に点突 然 変 異

^を

認

め た

^.

し か し

, 悪 性 腫 瘍

で は

, 濾 胸 痛

1

例

に

点突 然 変 異

を

認

^{め た}

^の

^{み で}

, 乳 頭 癌, 未 分 化 癌

^{で は}

変 異

r α ∫遺伝 子

は

検 出

さ れ な か

^っ

た

^.

Ⅳ

^. 点 突然 変 異

が

認

め

ら れ

^た

症 例

⁽

表

^{5 )}

H

^‑r α∫ ^コ

ド

ン

6 1 に

点 突 然 変 異

を

詠

^{め た}

濾 胞腺 歴

と

,

K

‑^{r α∫ コ}

邑づ6 1 粍領空

W itd

ÅA G C G G G G T T G て

一

G Å1 (^L.y^s) (^Arg) 〈^G 吋) (C y ^s〉 く

^A

^sp〉

F i

g^.

3

^･

H

y

b

r

id i

^{z at}

i

o n o

f P C R

^‑a m p

lifi

e

d D N A f

r o m s u rgl C a

11

y^‑r e S e Cte

d

m a

li

gn a nt n e op

l

a s m s to pr o

b

e s

f

o r

H

‑^{r a S C O}

^d

^{o n}

⁶¹

^{a n}

^{d K}

‑

r a s c o

d

^{o n}

1 2

.

T h

e m uta nt pr o

b

e

f

o r

H

^‑r a S C O

d

o n 6

1

(a rg

i

n

i

n e,

A

rg)

h

y

b

r

idi

z e

d

to

D N A f

r o m c a s e

I

o

f f

o

lli

c u

l

a r c a r c

i

n o ma^･

G l

n, g

l

^{uta m}

i

n e;

L

ys,

1

ys

i

n e;

G l

y,g

l

y^c

i

n e;

C

ys･ CySte

i

n e;

A

sp^, a Spa r at

i

c a c

id

･