灘 一1灘耀 讐総繋1:難

別 紙 様 式1(修 士 申請 者 用)

修 士 学 位 論 文

曇ムロ冊 文 題 名

ミオ シ ンH阻 害 薬(2,3‑Butanedionemonoxime)が モ ル モ ッ ト盲 腸 紐 平 滑 筋 ス キ ン ド標 本 弛 緩 過 程 に 及 ぼ す 影 響

EffectofmyosinHinhi㌃)itors(2β 一Butanedionemonoxi翅 しe)onthe relaxationprocessofskinnedtaeniacecumsmoothmusclef蜜omguineapig

(西 暦)2016年1.月8日 提 出

首都 大 学 東 京 大 学 院

人 間健 康 科 学 研 究 科 博 士 前 期 課 程 人 間健 康 科 学 専 攻 フ ロ ンテ ィアヘ ル ス サイ エ ンス学 域 学 修番 号:14898602

氏 名:河 田 晋 一

(指導 教 員 名:渡 辺 賢

)

別紙様式3(修 士 申請者用)

(西暦)2015年 度 博 士前 期 課程 学 位 論 文 要 旨

学 位 論 文 題 名(注 学位論文題名が英語 の場合は和訳をつけること)

ミ オ シ ンII阻 害 薬(2,3‑Butanedioneエnonoxime)が モ ル モ ッ ト盲 腸 紐 平 滑 筋 ス

キン ド標本 弛緩過程 に及 ぼす影響

学 位 の 種 類:修 士(健 康 科 学) 首 都 大 学 東 京 大 学 院

人 間 健 康 科 学 研 究 科 博 士 前 期 課 程 人 間 健 康 科 学 専 攻

フ ロ ン テ ィア ヘ ル ス サ イ エ ン ス 学 域 学 修 番 号14898602

氏 名:河 田 晋 一

(指 導 教 員 名:渡 辺 賢)

注:1ペ ー ジ あ た り1,000字 程 度(英 語 の 場 合300ワ ー ド程 度)で 、 本 様 式1〜2ペ ー ジ(A4 版)程 度 と す る 。

2,3‑Butanedionemonoxime(BDM)は 、 ミ オ シ ンH阻 害 薬 と し て ミ オ シ ン ・ア ク チ ン 相 互 作 用 を 直 接 的 に 阻 害 す る こ と に よ り 、 骨 格 筋 収 縮 を 可 逆 的 に 抑 制 す る こ と が 知 ら れ て い る 。 ま た 、BDMは 平 滑 筋 収 縮 も 阻 害 す る が 、 そ の 作 用 機 序 は 、 ミ オ シ ン ・ア ク チ ン 相 互 作 用 阻 害 に 起 因 す る と い う よ り は 、 細 胞 内Ca2膿 度 上 昇 の 抑 制 に よ る も の と 考 え ら れ て き た (LangRJ,PaulRJ:JPhysiol,433:1‑24,1991.)。 最 近 、別 の ミ オ シ ンH阻 害 薬blebbistatin が 、 ミ オ シ ン ・ア ク チ ン 相 互 作 用 を 直 接 的 に 阻 害 す る こ と で 、 平 滑 筋 収 縮 抑 制 お よ び 弛 緩 促 進 を 惹 起 す る こ と が 報 告 さ れ た(Watanabe:JPhysiolSci,62:S160,2012.)。 本 研 究 で は 、 平 滑 筋 の ミ オ シ ン ・ア ク チ ン 相 互 作 用 に 対 す るBDMの 影 響 の 詳 細 を 明 ら か に す る 目 的 で 、 細 胞 膜 を 化 学 的 に 破 壊 し た モ ル モ ッ ト 盲 腸 紐 平 滑 筋 ス キ ン ド標 本 を 用 い て 、 そ の 弛 緩 過 程 に 対 す るBDMの 影 響 を2つ の 温 度 条 件 で 検 討 し た 。BDMは 、10mM以 下 で は 平 滑 筋 弛 緩 過 程 に 影 響 を 及 ぼ さ な か っ た が 、30mMで 弛 緩 を 促 進 さ せ た 。 弛 緩 時 間 過 程 の 解 析 か ら 、BDM

は 速 い 活 性 化 ク ロ ス ブ リ ッ ジ の 解 離 を 促 進 さ せ る こ と で 、 弛 緩 を 促 進 さ せ る こ と が 示 唆 さ れ た 。

2,3・Butanedionem◎noxime(BDM)isknownasamyosinIIinhibitor,reversibly

suppressingskeletalmusclecontractionbydirectinhibitionofmyosin・actininteraction.

BDMalsoinhibitssmoothmusclecontraction,butthemechanismofthefbrce

suppressionhasbeenthoughtt◎interfbrewithintracellularCa2+handlingratherthan thatwithmyosin・a,ctininteraction.Recently,ithasbeenreportedthatblebbistatin, anothermyosinIIinhibit◎r,inducedsuppressi◎nofcontractionandaccelerationof relaxationinsmoothmusclebydirectinhibitionofmyosin‑actininteractioR.To investigatetheeffectsofBDMonthemyosin‑actininteractioninsmoothmusclein detai1,thepresentstudyaimedtoexamineBDMeffectsontherelaxati◎nprocessofcell membranepermeabilized(skinned)taeniacecumfromguineapigundertwodifferent experimenta1(temperature)conditions.BDMdidn◎taffectrelaxationtimecoursesat

10mMorlower,butacceleratedtherelaxationat30mM.ARalysisoftherelaxati◎n timecoursesvtggeststhatBDMaccelerateddiss◎ciationoffast℃ychngc翌oss‑bridge, inducingrapidtensiondecayduringrelaxation.

要 旨

2,3・Butanedionemonoxime(BDM)は 、 ミオ シ ンH阻 害 薬 と して ミオ シ ン ・ア ク チ ン相 互 作 用 を 直 接 的 に 阻 害 す る こ と に よ り、 骨 格 筋 収 縮 を 可 逆 的 に 抑 制 す る こ とが 知 られ て い る。

ま た 、BDMは 平 滑 筋 収 縮 も 阻 害 す る が 、 そ の 作 用 機 序 は 、 ミオ シ ン ・ア ク チ ン相 互 作 用 阻 害 に 起 因 す る と い う よ りは 、 細 胞 内Ca2牽 濃 度 上 昇 の 抑 制 に よ る も の と考 え ら れ て き た (LangRJ,PaulRJ:JPhysiol,433:1‑24,1991.)。 最 近 、別 の ミオ シ ンH阻 害 薬blebbistatin が 、 ミオ シ ン ・ア ク チ ン相 互 作 用 を 直 接 的 に 阻 害 す る こ と で 、 平 滑 筋 収 縮 抑 制 お よ び 弛 緩 促 進 を 惹 起 す る こ とが 報 告 され た くwa綴 総b￡ 凄 難ys嬢S￠1,62:sa60,2◎1幻 。本 研 究 で は 、 平 滑 筋 の ミオ シ ン ・ア ク チ ン相 互 作 用 に 対 す るBDMの 影 響 の 詳 細 を 明 らか に す る 目的 で 、 細 胞 膜 を化 学 的 に破 壊 した モ ル モ ッ ト盲 腸 紐 平 滑 筋 ス キ ン ド標 本 を 用 い て 、 そ の 弛 緩 過 程 に 対 す るBDMの 影 響 を2つ の 温 度 条 件 で 検 討 した。BDMは 、10mM以 下 で は 平 滑 筋 弛 緩 過 程 に影 響 を及 ぼ さ な か っ た が 、30mMで 弛 緩 を促 進 させ た 。弛 緩 時 間 過 程 の解 析 か ら、BDM は 速 い 活 性 化 ク ロ ス ブ リ ッジ の 解 離 を 促 進 させ る こ と で 、 弛 緩 を促 進 させ る こ とが 示 唆 さ れ た 。

2β ・Buね 鍛edi◎ 迎emo捻oxi搬e(BDM)isknownasa通yosi簸IIi簸hibiもo鵯reversibly

supp翌essingskeletalmusclec◎ntracもionbydirectinhibitionofmyosin‑actininもe翌acti◎n .

BDMalsoinhibitssmooth拠usclecontraction,加tthemechanis搬ofthe丑)rce suppressionhasbeenthoughtt◎interferewithintracellularCa2+ha獄dlingratherthan thatwithmyosin‑actininteracti◎n.Recently,ithasbeen翌eportedthatblebbistatin

,

an◎thermyosinIIi曲ibitor,inducedsuppression◎fcontractionandaccelerati◎ 捻of

翌elaxationi益sm.◎ ◎thm,usclel)ydi面ecti盗hibi垣 ◎簸of狙yosi難 一actini簸 もeracti◎ 難.Tb

investigatethee艶ctsofBDMonthemyosin‑actininteractioniぬ 瓢oothmusclein

detail,thepresentstudyaimedtoexamineBDMeffects◎nもherelaxati◎RprocessofeeH

mem,braneper澱eabilized(skinned)taeRia .eecu澱 倉o磁9双 塗eapま9疑 鍛d鍵 むw◎diff()野e滋

experi拠e批al(もempera加.re)c◎nditions.BDMdid餓oもaf艶ctrelaxati()nti】 〔簸ec◎ursesa尤

10搬Mor1◎wer,butaccelevatedtherelaxaもio簸aも30董nM .A数alysisof宅herelaxa宅i◎ 貧

timecoursesuggeststhaも13DMaccele翌ateddissociationof魚st℃yclingcross‑bridge, inducing翌apidtensiondecayduringrelaxati◎n.

Keywords:平 滑 筋,2,3‑Butanedi◎nemonoxime(BDM),blebbistatin, ミ オ シ ン ・ア ク チ ン 相 互 作 用

緒 言

平 滑 筋 は 、 横 紋 構 造 を 持 た な い 筋 細 胞 の 合 胞 体 か ら な る不 随 意 筋 で あ り、 消 化 管 や 血 管 壁 に 存 在 す る。 平 滑 筋 の 収 縮 弛 緩 の メ カ ニ ズ ム に つ い て は 、Ca2膿 度 お よび 反 応 温 度 に依 存 す る こ とが 知 られ 、 横 紋 筋 と相 同 の 細 胞 内 装 置 を 持 っ て い る が 、 そ の 作 用 制 御 機 構 は か な り異 な っ て お り解 明 途 中 で あ る1)2)3)。 横 紋 筋 との 相 違 点 の 一 つ に 、 平 滑 筋 収 縮 ・弛 緩 は 、 基 本 的 に は ミオ シ ン調 節 軽 鎖 の リ ン酸 化 ・脱 リ ン酸 化 に よ っ て 制 御 され る こ と が 挙 げ られ

る。 ミオ シ ン 軽 鎖 リ ン酸 化 機 構 は 、Ca2材 オ ン の 動 員 に よ り細 胞 内 カ ル モ ジ ュ リ ン(CaM>

と結 合 し、Ca2"‑CaM複 合 体 を形 成 す る 。Ca2"‑CaM複 合 体 が 、 ミオ シ ン 軽 鎖 キ ナ ー ゼ (MLCK)と 結 合 す る と、MLCKが 活 性 化 され 、 ミオ シ ン調 節 軽 鎖19番 目の セ リン の リン酸 化 が 起 こ る。 そ れ に よ っ て 、 ミオ シ ン の ア ク チ ン活 性 化ATI)ase活 性 が 増 加 し、 ア ク チ ン

と ミオ シ ン頭 部 で 形 成 され る ク ロス ブ リ ッ ジ が 回 転 して 、ATPを 消 費 しな が ら収 縮 が は じ ま る。Ca2÷濃 度 が減 少 す る とCa2"‑CaM複 合 体 とMLCKの 結 合 が解 離 し、MLCKが 不 活 性 化 され る。リ ン酸 化 され た ミオ シ ン軽 鎖(MLC)は 、ミオ シ ン軽 鎖 ホ ス フ ァ ター ゼ(MLCP)

に よ っ て 脱 リ ン酸 化 され 、 ア ク チ ン活 性 化ATPase活 性 が 減 少 し、 ミオ シ ン とア ク チ ン が 解 離 して 弛 緩 が 生 じ る 。 筋 型 ミオ シ ン(ミ オ シ ンII)阻 害 薬 で あ る2,3‑Butanediene ヱ難on◎xime(BDM>やblebbistatixは 、 骨 格 筋 、 心 筋 お よ び 平 滑 筋 の 収 縮 を 可 逆 的 に 抑 制 す

る こ とが 知 られ4)10)11)13)、blebbistatinは 、骨 格 筋 ミオ シ ンHATPaseの 活 性 化 を 抑 制 す る こ とで 収 縮 を抑 制 す る こ とが 知 られ て い る11)16)17)22)。 さ らに 最 近Watanabeら は 、 blebbistatinが 平 滑 筋 の 張 力 保 持 メ カ ニ ズ ム(ラ ッチ:ゆ っ く り と して クuス ブ リ ッ ジ 回 転 を 引 き 起 こ す)形 成 を 抑 制 す る こ と で 、弛 緩 を促 進 す る こ と を 見 出 した23)。BDMは 、様 々 な種 類 の 平 滑 筋 に お い て 、2〜10mMで 、膜 電 位 の脱 分 極 に よ っ て 開 口す る 電 位 依 存 性Ca2+

チ ャ ネ ル へ のCa2÷ 流 入 を 阻 害 し12)13)14)15)24)25)26)、 結 果 、平 滑 筋 の 収 縮 を 抑 制 す る こ とが 報 告 され て い る。Watanabeに よれ ば 、20mM以 下 のBDMは ミオ シ ン ・ア クチ ン相 互 作 用 に は ほ とん ど影 響 しな い10)。 しか し更 に 高 濃 度 のBDMは ミオ シ ン ・ア ク チ ン 相 互 作 用 を抑 制 す る 可 能 性 が あ る。 そ こ で 、本 研 究 で は 界 面 活 性 剤 β・escinに よ り細 胞 膜 を破 壊 し、 細 胞 内 環 境 を 人 為 的 に 自 由 に 固 定 ・変 化 す る こ と を 可 能 に す る モ ル モ ッ ト盲 腸 紐 平 滑 筋 ス キ ン ド標 本 を用 い て 、Ca2膿 度 調 節 機 構 に 関 わ りな くBDMがblebbistatinと 同 様 に

ラ ッチ機 構 を抑 制 して 平 滑 筋 弛 緩 過 程 を 促 進 す る か 、 検 討 を 行 っ た。

方 法

本 実 験 は 日本 学 術 会 議 が 策 定 した 働 物 実 験 を適 正 に 行 うた め の ガ イ ドラ イ ン 」に則 り、

首 都 大 学 東 京 南 大 沢 キ ャ ンパ ス研 究 安 全 倫 理 委 員 会 に よ り学 内 動 物 実 験 の 承 認 を 受 け た 動 物 実 験 計 画 を 遵 守 して 実 施 した(A27‑1)。 実 験 動 物 は 、 体 重250gの オ スHartley系 モ ル モ ッ トの 腹 腔 内 に ソ ム ノペ ン チ ル(共 立 製 薬,東 京)を 過 剰 投 与 す る こ とに よ り安 楽 死 させ 、 盲 腸 紐 を摘 出 し、 人 工 細 胞 外 液 に て保 存 した 。

摘 出 し た 盲 腸 紐 は 、 自 由 に 細 胞 内 環 境 を 変 化 、保 持 可 能 な ス キ ン ド標 本 を 作 成 す る た め 、 β・escin(SIGMA,St.Louis,MO,USA)を100μM含 ん だ 標 準 溶 液(下 記 参 照)に30分 間 浸 し、 さ ら に 、10μMCa賜on◎phoreA‑23i87(SIGMA,St.Louis,MO,USA)で 筋 小 胞 体 を10分 間 処 理 し た 後5)、50%glycero1(ナ カ ラ イ テ ス ク,京 都)含 有 弛 緩 液 に 浸 し 、

‑15℃ で 保 存 し た

。 ス キ ン ド標 本 に 付 着 し た 粘 膜 等 の 組 織 を ピ ン セ ッ トで 除 去 した 後 、 3.0‑4.Omm×0.1‑O.2紐 狙の 小 切 片 を 作 成 し 、 絹 糸 で 切 片 の 両 端 を 一 方 に 張 力 測 定 器 が っ い た タ ン グ ス テ ン 製 フ ッ ク に 装 着 し 、 測 定 を 行 っ た 。

張 力 測 定 器(ULA‑10GR;MINEBEAJapaA)に よ り 張 力 の 変 化 を 電 圧 に 変 換 し、 増 幅 器 (AM30;ユ ニ パ ル ス 株 式 会 社 東 京)で 信 号 を 増 幅 し た 後 、A‑D(ア ナmグ ・デ ジ タ ル)変 換 器(PoweyLab2/26;ADInstyumentsJapan,東 京)に よ りデ ジ タ ル 信 号 に 変 換 し た 上 で 、 Labchart(v.7.1;ADInstrumentsJapan,東 京)で パ ソ コ ン 上 に 記 録 し た6)7)。

溶 液 温 度 は 、 恒 温 水 槽(LTB‑125;ア ズ ワ ン 株 式 会 社,大 阪)に よ り30.0±1.0℃ お よ び 25.0±1.O℃ に 維 持 し 、 バ ル ブ プ レ ー一 トシ ス テ ム(9穴 一各0.135ml)を 利 用 し て 切 片 の 移 動 浸 漬 を 行 っ た8)。

人 工 細 胞 内 溶 液

全 て の 溶 液 の イ オ ン 強 度 は 、K(methanesUlfonate)(東 京 化 成,東 京)の 添 加 に よ り200mlM[

を 保 ち 、20mM1,4‑piperazine‑bis(2‑ethanesulph◎nicacid)(PIPES)(同 仁 化 学 研 究 所,熊 本) とKOHに よ り 、25℃ でpH7に 調 整 し た 。 ス キ ン ド盲 腸 紐 の 標 準 溶 液 は 、 通 常 の 盲 腸 紐 に お け るMg2+、MgATPお よ びcreatinephosphate(Crp)(ナ カ ラ イ テ ス ク,京 都)の 濃 度 を も

と にO.85mMMg頭2.1mMMg[methanesulfenate]2)、1mMMgATPNa2(1.35mMt◎tal ATP)(R◎cheDiagn◎stics,Marmheim,Gemmally)、2mMcreatinephesphateNa2(C翌p)(ナ

カ ラ イ テ ス ク,京 都)、IOmMethyleneglyco1"bis(2‑aminoethy1)tetraaceticacid(EGTA)(同

仁 化 学 研 究 所,熊 本)を 用 い て 調 整 し た9)。 ま た 、10'5DMCa2+(10mMt◎tal

Calmethanesulfenate]2)(東 京 化 成,東 京)に1μMb◎vinebraincalmodulin(和 光 純 薬,大 阪)を 添 加 し た も の をCa2熔 液 と し た3)。

実 験 手 順

張 力 測 定 器 に 固 定 し た 標 本 を 標 準 溶 液 中 で 静 止 長 の3‑5%伸 長 し た の ち 、 張 力 が 安 定 す る の を 待 ち(静 止 張 力)、 そ の 後Ca2÷ 溶 液 に 浸 漬 し、 収 縮 を 開 始 さ せ た 。 収 縮 張 力 が 最 大 か っ 定 常 値 ま で 達 し た ら(最 大 収 縮 張 力)、 標 本 を 弛 緩 液 に 浸 漬 し 、 弛 緩 反 応 を15分 聞 記 録 し た(図

1)。BDM(SIGMA,St.LoUis,MO,USA)の ミ オ シ ン 軽 鎖 リ ン 酸 化 、 脱 リ ン 酸 化 へ の 影 響 を 除 外 し ミ オ シ ン ・ア ク チ ン 相 互 作 用 へ の 影 響 の み を 検 討 す る た め 、 弛 緩 に 用 い る 弛 緩 液 のATPを リ ン 酸 化 の 基 質 に は な ら な い が 、 ミ オ シ ンATPaseの 基 質 に な るeytidine tripj◎sphate(CTP)(R◎cheDiagnostics,Mannheim,Germany)に 置 換 し た27)28)。

弛 緩 にお け る デ ー タ の 解 析

ス キ ン ド標 本 の 張 力 測 定 か ら得 られ た デ ー タ は 以 下 の 相 対 値 と して 表 した 。 相 対 張 力=(観 察 され た 張 カ ー 静 止 張 力)/(最 大 収 縮 張 カ ー静 止 張 力)

結 果 は 、平 均 値 ± 標 準 誤 差 で 表 し、統 計 的 処 理 は 、対 比 サ ン プ ル の 平 均 値 をStudentのt 検 定 に よ り、P〈0.05の 場 合 有 意 差 あ り と した 。 ま た 、KaleidaGraph日 本 語 版(v.4.1;

Huhnks,東 京)に よ り回 帰 分 析 を行 っ た 。

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0.16一

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F一 一

最大収縮張力 〆

観察 され た張カ ー静止 張力 相 対張力= 最大収縮 張カー静止張力

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瞥 止張力

† ㎝1

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図1Labchartに よ る 記 録 図 お よ び 相 対 張 力 計 算 式

縦 軸 を 電 圧(相 対 張 力)、 横 軸 を 時 間(秒)と し 、Ca2+溶 液 に よ るCa2+依 存 性 収 縮 が 最 大 と な っ た と こ ろ で 、contorol(OmM)、3mM、10mM、30mMBDM含 有 弛 緩 液 に 標 本 を 移 し 、そ の 弛 緩 過 程 を15分 間 記 録 す る 。記 録 中 の 溶 液 温 度 は 、30.0±1.0℃ お よ び25.0±1.0℃

に 維 持 す る 。

結 果

図2は 、30℃ に お け る モ ル モ ッ ト 盲 腸 紐 平 滑 筋 ス キ ン ド 標 本 弛 緩 に 及 ぼ す 2,3‑Butanedionemonoxime(BDM)の 影 響 に つ い て 、 縦 軸 を 相 対 張 力 、 横 軸 を 時 間 と し て 各 濃 度 のBDM溶 液(●:control(OmM)、 ▲:30mM、 ◆:10mM、 ×:3mM)に 浸 漬 し た 時 の 平 滑 筋 ス キ ン ド標 本 の 弛 緩 力 を 継 時 的 に 示 す 。600秒 以 降 は 相 対 張 力 が 平 坦 化 す る た

め 省 略 した 。30mMBDMに お い て 、10〜70秒 間 で 平 滑 筋 ス キ ン ド標 本 の 弛 緩 過 程 を 促 進 させ る こ と が 示 唆 され た 。10mMBDM以 下 で は 、有 意 な 弛 緩 促 進 効 果 は 認 め ら れ な か っ た 。

幽聞 図2BDMが 平 滑 筋 弛 緩 に及 ぼ す影 響(30。C)

16

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●contrd(AVE)

▲30mMBDM(AVE)

◆10mMBDM(AVE) 3mMBDM(AVE)

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0 100 200 300 400 500600

時 間(秒)

図2.30℃ に お け る モ ル モ ッ ト盲 腸 紐 平 滑 筋 ス キ ン ド標 本 弛 緩 に 及 ぼ す2,3‑Butanedione monoxime(BDM)の 影 響

縦 軸 を 相 対 張 力 、 横 軸 を 時 間 と し て 各 濃 度 のBDM溶 液(●:control、 ▲:30mM、

◆:10mM、 ×:3mM)に 浸 漬 し た 時 の 平 滑 筋 ス キ ン ド標 本 の 弛 緩 力 を 継 時 的 に 示 し て い る 。600秒 以 降 は 相 対 張 力 が 平 坦 化 す る た め 省 略 し た 。 デ ー タ は 、10回 の 実 験 に よ る 平 均 値 ± 標 準 誤 差 で 示 し て い る 。 ※ 印 は 、contro1と 比 較 してP〈0.05と な り、 有 意 差 が あ る こ

と を 示 し て い る 。

図3は 、25℃ に お け る モ ル モ ッ ト 盲 腸 紐 平 滑 筋 ス キ ン ド 標 本 弛 緩 に 及 ぼ す 2,3‑Butanedionemonoxime(BDM)の 影 響 に つ い て 、 縦 軸 を 相 対 張 力 、 横 軸 を 時 間 と し て 各 濃 度 のBDM溶 液(●:control(OmM)、 ▲:30mM、 ◆:10mM、 ×:3mM)に 浸 漬 し た 時 の 平 滑 筋 ス キ ン ド標 本 の 弛 緩 力 を 継 時 的 に 示 す 。600秒 以 降 は 相 対 張 力 が 平 坦 化 す る た め 省 略 し た 。30mMBDMに お い て10〜120秒 間 で 、10mMBDMに お い て20〜120秒 間 で 平 滑 筋 ス キ ン ド標 本 の 弛 緩 を 促 進 さ せ る こ と が 示 唆 され た 。3mMBDM以 下 で は 、 有 意 な 弛 緩 促 進 効 果 は 認 め られ な か っ た 。

‑ー○ー

1

R題較畢

丁 1●

0.8・ 一一

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▲ 丁

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図3BDMが 平 滑 筋 弛 緩 に 及 ぼ す 影 響(25。C)

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3mMBDM(AVE)

○◆▲

斐 2 ^霊・ 2 象 ^・2

‑O

0 100 200 300 400 500600

時 間(秒)

図3.25℃ に お け る モ ル モ ッ ト盲 腸 紐 平 滑 筋 ス キ ン ド標 本 弛 緩 に 及 ぼ す2,3・Butanedione monoxime(BDM)の 影 響

縦 軸 を 相 対 張 力 、 横 軸 を 時 間 と し て 各 濃 度 のBDM溶 液(●:control、 ▲:30mM、

◆:10mM、 ×:3mM)に 浸 漬 した 時 の 平 滑 筋 ス キ ン ド標 本 の 弛 緩 力 を 継 時 的 に 示 し て い る 。600秒 以 降 は 相 対 張 力 が 平 坦 化 す る た め 省 略 し た 。 デ ー タ は 、8回 の 実 験 に よ る 平 均 値

± 標 準 誤 差 で 示 し て い る 。 ※ 印 は 、controlと 比 較 し てP〈0.05と な り 、 有 意 差 が あ る こ と を 示 し て い る 。

平 滑 筋 弛 緩 に お け る ア ク チ ン ー ミ オ シ ン 間 で 行 わ れ る 結 合 解 離 の 関 係 を モ デ ル 化 し 、 BDMが 平 滑 筋 弛 緩 の ど の 経 過 段 階 で 作 用 し て い る の か を 検 討 した(図4)。 平 滑 筋 弛 緩 の 経 過 は 、 ① ク ロ ス ブ リ ッ ジ の 解 離 期(τfasOを 経 て 、 ② ラ ッ チ ブ リ ッ ジ へ の 移 行 期(τ latch‑attach)、 で 一 度 ア ク チ ン か ら解 離 した ミ オ シ ン が あ る 割 合Aで 再 び ゆ っ く り と ア ク

チ ン と 結 合 す る ラ ッ チ ブ リ ッ ジ を 形 成 し 、 ③ ラ ッ チ ブ リ ッ ジ の 解 離 期(datch‑detatch)

へ と3段 階 に 分 け て 説 明 す る こ と が で き る20)21)。 発 生 し て い る 相 対 張 力(F◎rce(t))は 、 ア ク チ ン と結 合 す る ミオ シ ン 数 に 比 例 す る と 考 え る と 、

Ferce(t)=F()rce(0)×[e('t/τfast)+A×(1・e〈"t/τfast))×(1‑e〈'tYτ}atch'attaclD×e('tiτ}atch'detatch)]

と し て 表 す こ と が で き る 。

表1は 、 上 記 の 式 を も と に 得 られ た デ ー タ を 回 帰 解 析 し 、 時 定 数 と し て 示 し た も の で あ る 。 こ れ よ り 、3emMBDMは25℃ に お い て 、 ク ロ ス ブ リ ッ ジ の 解 離 期(τfast)の 値 で 有 意 に 小 さ か っ た こ と か ら 、 速 い 活 性 化 ク ロ ス ブ リ ッ ジ の 解 離 を 促 進 さ せ る こ と が 考 え ら れ る 。

A・M

A十M

A・M

A十M

図4平 滑 筋 弛 緩 に お け る ア ク チ ン ー ミ オ シ ン 間 で 行 わ れ る 結 合 解 離 の 関 係

A:ア ク チ ンM:ミ オ シ ン

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罵隷 蕊壷 纐 嚢 豊講 綴 毒 轄 鰻 寡 三灘 灘 嚢纏 麟 瓢 顕 露 灘 鑓 ・き繕 贋 茎2?講衰 纒 灘 鍵 灘 轟1奪 。購 嚢 繕 鶴 纈 拳膿 擁 難.騰翁 毒 導諺 綴 毅 搬 縫 奪慈 藤i嚢 灘?譲 毅 讐継 彗編 き馨 織 三霧

表lBDMが 平 滑 筋 弛 緩 に及 ぼす 影 響 の 回帰 解 析 結 果

*:有 意 差 あ り

考 察

平 滑 筋 の 収 縮 ・弛 緩 は 、Ca2膿 度 お よび 温 度 に依 存 す る こ とが 知 られ る 。 筋 型 ミオ シ ン (ミ オ シ ンH)の 阻 害 薬 で あ るbiebbistatinやBDMは 、 骨 格 筋 、 心 筋 お よび 平 滑 筋 の収 縮 を 可 逆 的 に抑 制 す る こ とが 知 られ4)10)11)13)、blebbistatinは 、 平 滑 筋 ア ク トミオ シ ン ATPase活 性 を10μM程 度 で 抑 制 す る こ とが 知 られ て い る11)16)17)22)。 最 近Wataftabe

ら は 、blebbistatinは ス キ ン ド盲 腸 紐 平 滑 筋 の収 縮 張 力 を抑 制 して も収 縮 のCa2憾 受 性 や ミオ シ ン軽 鎖 リン 酸 化 レベ ル に は 影 響 を与 え な い こ とを 報 告 して い る17)。 さ らに 、 平 滑 筋 の 張 力 保 持 メ カ ニ ズ ム(ラ ッチ:ゆ っ く り と して ク ロ ス ブ リ ッ ジ 回 転 を 引 き 起 こす)形 成 を 抑 制 す る こ とで 、 弛 緩 を促 進 す る こ と を 見 出 した23)。BDMは 、 様 々 な 種 類 の 平 滑 筋 に お い て 、2〜10mMで 、膜 電 位 の脱 分 極 に よ っ て 開 口す る 電 位 依 存 性Ca2争 チ ャ ネ ル へ のCa2・

流 入 を 阻 害 し12)13)14)15)24)25)26)、 結 果 、 平 滑 筋 の 収 縮 を抑 制 す る こ とが 報 告 され て い る。Watanabeに よれ ば 、20mM以 下 のBDMは ミオ シ ン ・ア クチ ン相 互 作 用 に は ほ とん ど影 響 しな い10)。 しか し更 に 高 濃 度 のBDMは ミオ シ ン ・ア ク チ ン相 互 作 用 を 抑 制 す る可 能 性 が あ る 。そ こで 、本 研 究 で は界 面 活 性 剤 β一escinに よ り細 胞 膜 を 破 壊 し、細 胞 内 環 境 を 人 為 的 に 自由 に 固 定 ・変 化 す る こ と を 可 能 に す るモ ル モ ッ ト盲 腸 紐 平 滑 筋 ス キ ン ド標 本 を 用 い て 、Ca2膿 度 調 節 機 構 に 関 わ りな くBDMがblebbis右a伽 と同 様 に ラ ッチ 機 構 を抑 制

して 平 滑 筋 弛 緩 過 程 を促 進 す る か 、 検 討 を行 っ た 。

今 回我 々 は 、BDMの ミオ シ ン 軽 鎖 リ ン酸 化 、脱 リン 酸 化 へ の 影 響 を 除 外 しア ク チ ン ・ミ オ シ ン相 互 作 用 へ の影 響 の み を検 討 す る た め 、 弛 緩 に 用 い る 弛 緩 液 のATPを リン 酸 化 の 基 質 に は な らな い が 、 ミオ シ ンATPaseの 基 質 に な るcytidinetripjosphate(CTP)(Roche Diagn◎stics,Marmheim,Germany)に 置 換 して 実 験 を行 っ た27)28)。

こ の 実 験 条 件 で 、BDMは 、盲 腸 紐 平 滑 筋 ス キ ン ド標 本 の 弛 緩 過 程 に お い て 溶 液 温 度25℃

で は10mM以 上 で 、30℃で は30mM以 上 で 弛 緩 を 促 進 させ た。回 帰 解 析 の結 果 で は 、25℃ 、 30mMで 、ク ロ ス ブ リ ッジ の解 離 期(τfast)の 値 が 有 意 に小 さか っ た こ とか ら、速 い 活 性 化 ク ロ ス ブ リ ッ ジ の解 離 を促 進 させ 、 そ の 効 果 に は 温 度 依 存 性 が み られ た 。 温 度 効 果 に つ い て 、 以 前 か ら報 告 され て い る 骨 格 筋 や 心 筋 の デ ー タ と 同 様 の 傾 向 が み られ た こ とか ら 4)8)13)、 こ の速 い 活 性 化 ク ロ ス ブ リ ッ ジ 解 離 促 進 の メ カ ニ ズ ム は 横 紋 筋 と本 質 的 に は 同 様 で あ る こ とが 示 唆 され た。 こ れ ま で の 研 究 で は 、 ミオ シ ン ■ATPase阻 害 薬 は 、一 度 ア ク チ ン か ら解 離 した ミオ シ ン が あ る割 合Aで 再 び ゆ っ く り とア ク チ ン と結 合 す る ラ ッチ ブ リ ッ ジ の 形 成 を 阻 害 し、 ラ ッチ ブ リ ッ ジ の 解 離(datch‑detatch)を 促 進 させ る こ とで 、 盲 腸 紐 平 滑 筋 ス キ ン ド標 本 の 弛 緩 を促 進 す る こ とが 示 唆 され て き た 。 しか し、 本 研 究 の 結 果 よ

り、BDMとblebbistatinで は 、 同 じ ミオ シ ンH阻 害 薬 で は あ るが 、平 滑 筋 弛 緩 過 程 に お け る ア ク チ ン ー ミオ シ ン 問 で 行 わ れ る結 合 解 離 の 作 用 部 位 が 異 な る こ とが 考 え られ る 。

参 考 文 献

1)伊 藤 猛 雄,鈴 木 聡:平 滑 筋 収 縮 弛 緩 と 細 胞 内 カ ル シ ウ ム 動 態.蛋 白 質 核 酸 酵 素/共

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様 式2(第5条 関 係)

研究倫 理審査通知書(動 物) 渡辺 賢 殿

平 成27年3月30日

首都大学東京 学長 原島 文雄 下記 実験計画の審査結 果を通知 します 。

受理番号 ^A27‑1

区分 所 属(職 名) 氏名 連絡先

人間健康科学研究科

動物実験責任者 _教授 ^{渡辺 賢} 03‑3819‑7352

昭和引年より現在まで、本務校の東京慈恵会医科大学、東京医科大学(平 成 動物実験の経験及び教 ^{12‑22年)お} よ びSPri轟9‑8(平 成17年 一)にお い て 動 物 実 験 に 従 事 平 成18年 お

申 育訓練 の経 歴 よび 平 成22年 に 東 京 医 科 大 学 で 、平 成26年 に 首 都 大 学 東 京 で開 催 され た 教

請 ^{育訓練を受講}

者

動物実験実施者(分担

者) 渡辺 賢

研究課題 平滑筋 における化学 ・力学 変換過程変調 の生理的意義

平 滑筋標 本の筋収縮タンパク質構造変化 と化学 ・力学変換過程を、経時 的 ・定 量 的 に 測 定 し、筋 構 造 ・機 能 連 関 を解 明 す る 。な お 、本 研 究 の 一 部 研 究 目的 は(財)高 輝 度 光 科 学 研 究 セ ン ター(Sphng‑8)で 実 施 を 計 画 して お り、研

究課 題受理後 に当該施設での動物実験実施 の承認を受ける予定でい

る ◎ 唖

南大沢キャンパス研究 安全 承 認す べ き

倫 理委員会から学長への助

量_獄

平 成27年3月25日

理 由又は勧 告 な し

申請 に対する決定

承認