抗体部位特異的修飾技術による多様な抗体医薬開発
著者 岸本 聡
ファイル（説明） 博士論文全文 博士論文要旨
最終試験結果の要旨 論文審査の要旨
学位授与番号 17701甲理工研第464号
URL http://hdl.handle.net/10232/00030487
抗体部位特異的修飾技術による 多様な抗体医薬開発
2019 年 3 月
鹿 児 島 大 学 理 工 学 研 究 科 博 士 後 期 課 程 総 合 理 工 学 専 攻
岸本 聡
目 次
要 旨………..1
第 １ 章 研 究 背 景……….4
1-1 抗 体 の 機 能………..4
1-2 抗 体 医 薬 品……….10
1-3 抗 体 医 薬 品 へ の 分 子 修 飾………...11
1-4 フ ァ ー ジ デ ィ ス プ レ イ 技 術 と VHH抗 体………14
第 ２ 章 IgG結 合 ペ プ チ ド を 用 い た 抗 体 修 飾（CCAP 法 ）……….19
2-1 緒 言………..20
2-2 材 料 と 方 法……….21
2-3 結 果………..25
・IgG 結 合 ペ プ チ ド の X 線 結 晶 構 造 解 析………25
・IgG 結 合 ペ プ チ ド の 結 合 親 和 性 解 析………26
・ 抗 体 と ペ プ チ ド 間 で の 部 位 特 異 的 共 有 結 合 の 形 成……….28
・ ペ プ チ ド マ ッ ピ ン グ に よ る CCAP 法 の 部 位 特 異 性 を 評 価………30
2-4 ま と め と 考 察……….39
第 ３ 章 CCAP法 に よ る 抗 体 修 飾 が 抗 体 機 能 へ 与 え る 影 響………...40
3-1 緒 言………..41
3-2 材 料 と 方 法……….42
3-3 結 果………..4 4 ・Fc 受 容 体 に 対 す る 結 合 能 へ の 影 響………..44
・ ア ミ ン カ ッ プ リ ン グ 法 と の 抗 体 結 合 活 性 比 較………..47
3-4 ま と め と 考 察……….51
第 ４ 章 CCAP 法 に よ る 機 能 性 分 子 の 修 飾 と 機 能 評 価………52
4-1 緒 言………..53
4-2 材 料 と 方 法……….56
4-3 結 果………..7 2 ・CCAP 法 を 用 い た ADC の 作 製………72
・フ ァ ー ジ デ ィ ス プ レ イ 技 術 を 用 い た 抗 FcαR VHH の 単 離………73
・CCAP 法 を 用 い た 二 重 特 異 性 抗 体 の 作 製……….81
4-4 ま と め と 考 察……….89
第 ５ 章 総 括 と 今 後 の 課 題……….91
引 用 文 献………..94
業 績 目 録………..104
謝 辞………..110
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要 旨
近 年 、 抗 体 薬 物 複 合 体 （ADC） な ど 抗 体 へ 機 能 性 分 子 を 修 飾 し た も の が 利 用 さ れ 始 め て い る 。 し か し 、 従 来 の ア ミ ン カ ッ プ リ ン グ 法 な ど の 修 飾 法 は 修 飾 部 位 を 特 定 で き ず 、 抗 体 の 結 合 能 に 悪 影 響 を 及 ぼ し て お り 、 抗 体 部 位 特 的 修 飾 技 術 の 開 発 が 求 め ら れ て い た 。 こ れ ま で に 抗 体 側 の ア ミ ノ 酸 改 変 に よ る シ ス テ イ ン や 非 天 然 ア ミ ノ 酸 の 導 入 に よ る 部 位 特 異 的 修 飾 技 術 が 開 発 さ れ て き た が 、 こ れ ら の 方 法 で は 、 抗 体 の 遺 伝 子 改 変 や 発 現 系 の 構 築 が 煩 雑 で あ る と い っ た 問 題 点 が あ っ た 。
そ こ で 、本 研 究 で は T7 ラ ン ダ ム ペ プ チ ド ラ イ ブ ラ リ か ら 単 離 さ れ た ヒ ト IgG 抗 体 の Fc 部 位 特 異 的 な ペ プ チ ド を 介 し た 、IgG-Fc へ の ア ミ ド 結 合 に よ る 部 位 特 異 的 な 修 飾 法 CCAP（Chemical conjugation by affinity peptide）法 を 開 発 し た 。 こ の 修 飾 反 応 は 、ペ プ チ ド の Lys 残 基 と 、抗 体 と ペ プ チ ド の 複 合 体 中 で 近 接 す る 抗 体 Fc 上 の 特 異 的 Lys 残 基 （Lys248） 間 を DSG リ ン カ ー に よ っ て 架 橋 す る こ と で 成 立 す る 。 ペ プ チ ド の 親 和 性 を 利 用 す る た め 、 部 位 特 異 的 な 修 飾 を 行 う こ と が で き 、ペ プ チ ド 側 に 機 能 性 分 子 を あ ら か じ め 導 入 し て お く こ と で 、IgG 抗 体 へ 部 位 特 異 的 に こ れ ら の 分 子 を 修 飾 す る こ と が 可 能 と な る 。 本 研 究 で は 、 CCAP 法 に よ る 修 飾 反 応 が IgG 部 位 特 異 的 で あ る こ と を ペ プ チ ド マ ッ ピ ン グ に よ っ て 明 ら か に し た だ け で な く 、CCAP 法 に よ る 修 飾 が 抗 体 機 能 に 与 え る 影 響 を 解 析 し た 結 果 、 抗 原 結 合 能 に は 影 響 が な く 、FcγR と の 結 合 も 維 持 さ れ 、 FcγRIIIa へ の 結 合 親 和 性 は む し ろ 向 上 す る こ と が わ か っ た 。
CCAP 法 を 分 子 修 飾 抗 体 医 薬 品 開 発 へ 応 用 す る た め 、 最 初 に 抗 体 薬 物 複 合 体 の 作 製 に つ い て 検 討 を 行 っ た 。抗 ガ ン 剤 で あ る DM1（emtansine）を あ ら か じ め 修 飾 し た ペ プ チ ド を 用 い て 、 乳 が ん 細 胞 を 標 的 と し た 抗 体 医 薬 品 で あ る Trasutuzumab へ の コ ン ジ ュ ゲ ー ト を 作 製 し た 。 結 果 と し て 、Biacore T200 に よ る 解 析 で 、CCAP法 に よ っ て 作 製 し た 抗 体 薬 物 複 合 体 は Trasutuzumab の 抗 原 で あ る Her2 へ の 結 合 能 を 維 持 し て お り 、Her2 発 現 細 胞 で あ る SK-BR3 細 胞 と Her2 非 発 現 細 胞 で あ る C6 細 胞 を 用 い た 細 胞 ア ッ セ イ で は Trastuzumab に DM1 を 従 来 法 で コ ン ジ ュ ゲ ー ト し た 医 薬 品 で あ る T-DM1 と 同 様 に SK-BR3 特 異 的 な 細 胞 毒 性 を 発 揮 し た 。
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次 に 、CCAP 法 を 用 い て VHH を IgG抗 体 へ コ ン ジ ュ ゲ ー ト す る こ と で 新 規 の 二 重 特 異 性 抗 体 フ ォ ー マ ッ ト を 構 築 で き る と 考 え た 。 二 重 特 異 性 抗 体 を 作 製 す る こ と で 、本 来 IgG 抗 体 が 有 し て い な か っ た 結 合 能 、機 能 を 新 た に 付 加 す る こ と が で き る 。 そ こ で 、 が ん 標 的 抗 体 医 薬 品 へ 好 中 球 が 有 す る IgA 抗 体 受 容 体 で あ る FcαR を 標 的 と す る VHH を コ ン ジ ュ ゲ ー ト し 、IgG 抗 体 が 本 来 有 す る NK 細 胞 を 介 し た 細 胞 傷 害 活 性 の 他 に 、 好 中 球 を 介 し た 細 胞 傷 害 活 性 と い っ た 新 た な 機 能 を 付 加 し 、 好 中 球 と NK 細 胞 両 方 を エ フ ェ ク タ ー 細 胞 と し て 利 用 で き る 高 活 性 、高 機 能 型 の 二 重 ADCC 抗 体 を 創 製 す る こ と を 目 的 と し た 二 重 特 異 性 抗 体 の 作 製 を 行 っ た 。結 果 、作 製 し た IgG-VHH コ ン ジ ュ ゲ ー ト 体 は IgG 側 、VHH 側 双 方 の 親 和 性 を 維 持 し て お り 、 細 胞 上 標 的 抗 原 な ら び に FcαR へ 結 合 活 性 を 示 し た 。
以 上 の こ と か ら 、 本 研 究 に お い て 開 発 し た CCAP 法 は 優 れ た 分 子 修 飾 技 術 と し て 抗 体 開 発 研 究 を 進 展 さ せ 、 抗 体 薬 物 複 合 体 、 放 射 性 標 識 抗 体 、 二 重 特 異 性 抗 体 な ど 様 々 な フ ォ ー マ ッ ト の 抗 体 医 薬 品 開 発 を 促 進 さ せ る こ と が 期 待 さ れ る 。
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第１章
研究背景
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第 1章 研 究 背 景
1-1 抗 体 の 機 能
抗 体 は 自 己 防 御 機 構 で あ る 免 疫 系 に お け る 重 要 な タ ン パ ク 質 で あ り 、 体 外 か ら 侵 入 し た 異 物 （ 抗 原 ） を 認 識 し 、 特 異 的 に 結 合 す る こ と で 異 物 の 排 除 に 関 わ っ て い る 。 抗 体 の 構 造 は 、 重 鎖 （H 鎖 ） お よ び 軽 鎖 （L 鎖 ） と 呼 ば れ る 2 種 の ポ リ ペ プ チ ド 鎖 に よ っ て 構 成 さ れ て い る 。重 鎖 お よ び 軽 鎖 の N 末 端 側 の 領 域 に は 多 様 性 に 富 ん だ ア ミ ノ 酸 配 列 を 有 す る 領 域 が 存 在 し 、特 に 可 変 領 域（VH、VL） と 呼 ば れ て い る 。VH お よ び VLに は 、特 に 多 様 性 を 持 つ 領 域 が 存 在 し 、超 可 変 領 域 ま た は 、 相 補 性 決 定 領 域 （complementarity determining region : CDR） と 呼 ば れ 、VH と VL に そ れ ぞ れ 3 つ ず つ 存 在 す る 。CDR は 抗 体 の 抗 原 認 識 に 関 わ る 部 位 で あ り 、 こ れ ら の 多 様 性 が 抗 体 の 様 々 な 抗 原 に 対 す る 多 様 性 を 構 成 し て い る 。ま た 、可 変 領 域 以 外 の 領 域 は 定 常 領 域 ま た は フ レ ー ム ワ ー ク （FR）領 域 と 呼 ば れ 、 構 成 す る ア ミ ノ 酸 配 列 の 違 い か ら IgA、IgG、 IgD、IgE、IgM と い っ た ク ラ ス に 分 類 さ れ 、 そ れ ぞ れ 異 な る エ フ ェ ク タ ー 機 能 を 有 し て い る 。IgG 抗 体 は 血 液 中 で 最 も 多 く 存 在 す る 抗 体 で あ り 、定 常 領 域 の 違 い に よ り IgG1、IgG2、 IgG3、IgG4と 4 つ の サ ブ ク ラ ス に 分 け ら れ る 。 免 疫 応 答 に お い て は 、 ウ イ ル ス な ど の 病 原 体 に 結 合 し 細 胞 へ の 感 染 を 阻 害 す る 中 和 活 性 や 、 マ ク ロ フ ァ ー ジ な ど の 貪 食 細 胞 に 標 的 を 認 識 さ せ る た め の オ プ ソ ニ ン 化 、 ナ チ ュ ラ ル キ ラ ー 細 胞
（NK）を 動 員 し 、ウ イ ル ス 感 染 細 胞 や が ん 細 胞 な ど を 攻 撃 す る 抗 体 依 存 性 細 胞 障 害 活 性 （ADCC：Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity） や 、 補 体 分 子 を 介 し た 補 体 依 存 性 細 胞 障 害 活 性 （CDC：Complement Dependent Cytotoxicity） な ど 様 々 な 働 き を 担 っ て い る 。 ま た 、IgG1、IgG2、IgG4 は FcRn と 呼 ば れ る 抗 体 Fc 領 域 に 結 合 す る 受 容 体 を 介 し た リ サ イ ク リ ン グ 機 能 に よ り 、 約 2 週 間 程 度 の 長 い 血 中 半 減 期 を 有 し て い る 。 特 に 、IgG1 が NK 細 胞 に よ る 高 い ADCC 誘 導 能 力 を 有 し て い る こ と か ら 、 抗 体 医 薬 品 と し て 様 々 な 疾 患 へ 応 用 さ れ て い る 。
抗 体 の Fc 領 域 は 定 常 領 域 と ば れ る 部 分 で あ り 、配 列 の 違 い か ら ヒ ト の 場 合 5 種 類 の ク ラ ス に 分 類 さ れ る 。IgG、IgM、IgA、IgD、IgE の 5 種 類 で あ り 、 そ の う ち B細 胞 表 面 に 存 在 し 、B 細 胞 成 熟 に 関 連 し て は た ら く IgD 以 外 の ク ラ ス に は そ れ ぞ れ 対 応 し た 受 容 体 で あ る FcγR、FcμR、FcαR、FcεR が 存 在 し 、 各 種 免
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疫 細 胞 上 に 発 現 し て い る 。各 ク ラ ス の 抗 体 は 、そ の Fc 領 域 が そ れ ぞ れ 対 応 し た 受 容 体 に 結 合 す る こ と で 、 役 割 の 異 な る 免 疫 応 答 を 誘 導 す る 。IgM 抗 体 は 血 中 で は 5量 体 の 状 態 で 存 在 し 、 免 疫 応 答 の 際 最 初 に 誘 導 さ れ る 抗 体 で あ り 、 感 染 の 初 期 防 御 に お い て 重 要 な 役 割 を 担 っ て い る 1 , 2 , 3。IgMの 受 容 体 で あ る FcμR は B細 胞 上 に 発 現 し て お り 、2009 年 に 遺 伝 子 が 同 定 さ れ た 4。ま た 、FcμR 遺 伝 子 欠 損 マ ウ ス を 用 い た 実 験 で は 、野 生 型 の マ ウ ス と 比 べ 抗 原 の 侵 入 に 対 す る B細 胞 の 応 答 が 阻 害 さ れ 、 抗 体 産 生 誘 導 に IgM と FcμR の 結 合 が 重 要 な 役 割 を 担 っ て い る こ と が 示 さ れ た 。 ま た 、 同 時 に 、 自 己 抗 原 に 対 す る 抗 体 産 生 を 抑 制 し 、 自 己 免 疫 疾 患 の 予 防 と い う 役 割 を 持 つ 可 能 性 も 同 時 に 示 唆 さ れ て い る 5。IgA 抗 体 は 血 中 で 2 量 体 の 状 態 で 存 在 し 、そ の 受 容 体 は FcαR と 呼 ば れ て い る 6。FcαR は 好 中 球 、 単 球 、 マ ク ロ フ ァ ー ジ 上 に 存 在 し 、IgA 抗 体 を 介 し た 免 疫 応 答 に 関 わ っ て い る 7 , 8 , 9。抗 原 と 結 合 し た IgA 抗 体 は 免 疫 細 胞 上 の FcαR と 結 合 し 、免 疫 細 胞 を 活 性 化 、 貪 食 や ADCC 活 性 と 呼 ば れ る 細 胞 傷 害 活 性 を 誘 導 す る 1 0 , 11。 FcαR は 免 疫 細 胞 に よ る killing 活 性 を 誘 導 す る こ と か ら 、 免 疫 細 胞 活 性 化 を 目 的 と し た 医 薬 品 の タ ー ゲ ッ ト と し て も 注 目 さ れ て い る 1 2。IgE 抗 体 は ア レ ル ギ ー へ の 関 与 で 知 ら れ る 抗 体 で あ り 、そ の 受 容 体 FcεR は マ ス ト 細 胞（ 肥 満 細 胞 ） や 好 塩 基 球 、 好 酸 球 上 に 発 現 し て い る 1 3。 ア レ ル ギ ー 反 応 は 、 マ ス ト 細 胞 上 の FcεR に 結 合 し た IgE 抗 体 に 抗 原 で あ る ア レ ル ゲ ン が 結 合 す る こ と で 、細 胞 が 活 性 化 さ れ 、 ヒ ス タ ミ ン な ど の ア レ ル ギ ー 反 応 を 誘 導 す る 物 質 を 放 出 す る こ と に よ っ て 引 き 起 こ さ れ る 1 4 , 1 5。IgG 抗 体 は 血 中 に 最 も 多 く 存 在 す る 抗 体 ク ラ ス で あ り 、液 性 免 疫 に お い て 感 染 防 御 な ど 様 々 な 免 疫 応 答 の 中 核 を 担 う 分 子 で あ る 。 前 述 の 通 り 、IgG を 用 い た 抗 体 医 薬 品 は 副 作 用 が 少 な く 効 果 の 高 い 医 薬 品 と し て 急 速 に 普 及 し て い る 。こ の IgG抗 体 の 受 容 体 は FcγRと 呼 ば れ て お り 、FcγRI、 FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa な ど 様 々 な タ イ プ が 存 在 す る （Table 1-1）1 6。FcγR は 細 胞 膜 タ ン パ ク 質 で あ る が 、 細 胞 内 部 分 に 有 し て い る シ グ ナ ル 伝 達 モ チ ー フ の 違 い に よ っ て 大 き く 2 分 す る こ と が で き る 。 免 疫 受 容 体 活 性 化 チ ロ シ ン モ チ ー フ ITAM（immunoreceptor tyrosine-based activation motif）と 、免 疫 受 容 体 抑 制 性 チ ロ シ ン モ チ ー フ ITIM（immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif） で あ る 。ITAM は 細 胞 を 活 性 化 す る シ グ ナ ル 伝 達 に 関 与 し 、逆 に ITIMは 細 胞 を 抑 制 す る シ グ ナ ル 伝 達 に 関 与 し て い る 。FcγR で は 唯 一 FcγRIIbの み が 抑 制 性 の ITIM
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を 有 す る 受 容 体 で あ る 。ITAMを 有 す る FcγR に 抗 体 が 結 合 す る と 、細 胞 膜 上 で FcγRが 集 合 し 、細 胞 内 Srcフ ァ ミ リ ー の チ ロ シ ン キ ナ ー ゼ が 活 性 化 さ れ 、ITAM 中 の チ ロ シ ン 残 基 が リ ン 酸 化 さ れ る 。 こ れ が 引 き 金 と な り 、 細 胞 内 に シ グ ナ ル 伝 達 が 起 こ る 1 7。 マ ク ロ フ ァ ー ジ や 樹 状 細 胞 、 好 中 球 な ど の 細 胞 で FcγR が 活 性 化 さ れ た 場 合 、こ れ ら の 細 胞 は 貪 食 に よ っ て IgG 抗 体 が 認 識 し た 抗 原 を 取 り 込 む 、取 り 込 ま れ た 抗 原 は 分 解 さ れ 、抗 原 ペ プ チ ド と し て 細 胞 へ 提 示 さ れ 、T細 胞 の 活 性 化 に 関 与 す る 1 8。NK 細 胞 で 発 現 し て い る FcγRIIIa は IgG 抗 体 に よ っ て 活 性 化 さ れ 、ADCC 活 性 （Antibody Dependent Cell Cytotoxicity） と 呼 ば れ る 細 胞 傷 害 活 性 を 誘 導 す る 1 9 , 2 0。 こ れ は NK 細 胞 の 細 胞 質 顆 粒 か ら 放 出 さ れ た パ ー フ ォ リ ン 2 1や グ ラ ン ザ イ ム 2 2と い っ た 酵 素 に よ っ て 引 き 起 こ さ れ 、パ ー フ ォ リ ン は 細 胞 膜 に 孔 を 空 け 、プ ロ テ ア ー ゼ で あ る グ ラ ン ザ イ ム が 細 胞 内 に 侵 入 し 、 ア ポ ト ー シ ス を 誘 導 す る 2 3。一 方 、ITIMを 有 す る FcγRIIb は B 細 胞 上 に 発 現 し て お り 、 抗 体 の 産 生 を 負 に 調 節 す る 機 能 を 有 し て い る 。 こ れ は 免 疫 反 応 が 過 剰 に 起 こ る こ と を 防 ぐ た め の メ カ ニ ズ ム で あ る 2 4。こ れ は 、FcγRIIb 欠 損 マ ウ ス に お い て 自 己 免 疫 疾 患 が 容 易 に 誘 導 さ れ る こ と に よ り 証 明 さ れ て い る 2 5 , 2 6。
Table 1-1 各 FcγR の 発 現 分 布 と シ グ ナ ル 伝 達 モ チ ー フ
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抗 体 医 薬 品 の 効 果 に お い て も Fc 受 容 体 と の 結 合 能 は 大 い に 関 係 し て お り 、 が ん を 標 的 と し た 抗 体 医 薬 品 で は 、 多 く の 場 合 、FcγRIIIa を 介 し た NK 細 胞 の ADCC 活 性 が 抗 体 医 薬 品 の 医 薬 品 と し て の 効 果 に 関 連 し て い る 。IgG 抗 体 医 薬 品 と FcγRIIIa の 結 合 能 力 が 治 療 効 果 に 影 響 を 与 え る 例 と し て 、IgG 抗 体 Fc と の 親 和 性 が 高 い FcγRIIIa の ア ロ タ イ プ の 患 者 （FcγRIIIa-158Val） と 親 和 性 の 低 い 患 者 （FcγRIIIa-158Val） を 比 較 し た 場 合 、 前 者 の 方 が 抗 体 医 薬 品 に よ る 高 い 治 療 効 果 が 得 ら れ る と い っ た 知 見 が 報 告 さ れ て い る 2 7 , 2 8。こ れ ら の 知 見 を 基 に 、 IgG 抗 体 の Fc 領 域 へ の ア ミ ノ 酸 変 異 や 、 糖 鎖 を 改 変 す る こ と で FcγRIIIa と の 結 合 親 和 性 を 増 強 す る こ と で 治 療 効 果 を 向 上 さ せ る 試 み が 行 わ れ て き た 。 ア ミ ノ 酸 改 変 技 術 を 用 い た 手 法 と し て 、 ジ ェ ネ ン テ ッ ク （Genentech） 社 は Fc 受 容 体 と の 結 合 に 関 連 す る ア ミ ノ 酸 配 列 に 変 異 を 導 入 し 、 各 Fc 受 容 体 へ の 親 和 性 を 増 減 さ せ る ア ミ ノ 酸 部 位 を 同 定 し て い る 2 9。 こ の 報 告 で は 、S298A、E333A、
K334A な ど の 部 位 の ア ミ ノ 酸 置 換 が FcγRIIIa と の 結 合 親 和 性 を 向 上 さ せ 、 ADCC 活 性 を も 増 強 さ せ る こ と を 実 証 し て い る 。ま た 、協 和 発 酵 キ リ ン 社 は IgG 抗 体 が FcγRIIIa と 結 合 形 成 す る 際 に 必 須 の 因 子 で あ る Asn297 の 糖 鎖 修 飾 を 改 変 し（Fig.1-1）（ 文 献 3 0. 3 1を 参 考 に 改 変 ）、フ コ ー ス を 除 く こ と で FcγRIIIa と の 結 合 親 和 性 が 向 上 し 、ADCC 活 性 を 増 強 す る こ と が 可 能 で あ る と 報 告 し て い る
3 2 , 33。 ポ テ リ ジ ェ ン ト 技 術 と 呼 ば れ る こ の 手 法 は 既 に 抗 体 医 薬 品 開 発 に 応 用 さ
れ て い る が 、 製 造 に は フ コ ー ス 修 飾 を 排 除 す る た め 、 フ コ ー ス の 修 飾 に 関 わ る 酵 素 を ノ ッ ク ア ウ ト し た 細 胞 株 を 用 い る 必 要 が あ る 3 4。
Fig.1-1 IgG 抗 体 の 構 造 と 糖 鎖 修 飾
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抗 体 の Fc 領 域 に 結 合 し 、生 理 機 能 を 発 揮 す る 受 容 体 と し て 、免 疫 細 胞 に 発 現 し 、免 疫 応 答 に 関 わ る Fc受 容 体 の 他 に 、FcRnが 存 在 す る 。FcRnは IgG 抗 体 の 分 解 を 抑 制 し 、 血 中 濃 度 維 持 に 関 わ っ て い る 受 容 体 で あ る 。 こ の FcRn へ 結 合 能 を 持 た な い バ イ オ 医 薬 品 の 血 中 半 減 期 は 1 日 程 度 で あ る の に 対 し 、ヒ ト Fc 領 域 を 有 す る IgG 抗 体 医 薬 品 の 血 中 半 減 期 は 数 日 か ら 数 週 間 と 非 常 に 長 く 、医 薬 品 投 与 頻 度 を 抑 え る こ と が で き る と い っ た 特 筆 す べ き 利 点 を 有 し て い る 。FcRn の 存 在 は 1964 年 に IgG 抗 体 の 代 謝 や 輸 送 に 関 わ る 受 容 体 と し て Brambell ら に よ っ て 提 唱 さ れ 3 5、1989 年 に ラ ッ ト か ら 初 め て ク ロ ー ニ ン グ さ れ た 3 6。そ の 後 ノ ッ ク ア ウ ト マ ウ ス を 用 い た 実 験 で IgG 抗 体 の 半 減 期 を 延 長 し て い る こ と が 実 証 さ れ 3 7 , 3 8 , 3 9、 細 胞 内 酸 性 条 件 下 で は IgG 抗 体 と 結 合 し 、 細 胞 外 中 性 条 件 下 で 解 離 す る こ と で 、エ ン ド サ イ ト ー シ ス で 細 胞 内 へ 取 り 込 ま れ た IgG 抗 体 が FcRn と 結 合 す る こ と で レ ス キ ュ ー さ れ 、 再 度 細 胞 外 へ 放 出 さ れ る こ と で リ サ イ ク リ ン グ さ れ て い る メ カ ニ ズ ム が 解 明 さ れ た 4 0（Fig.1-2）。ま た 、FcRn は 、IgG だ け で な く 血 清 ア ル ブ ミ ン（ ヒ ト の 場 合 HSA）と の 結 合 ド メ イ ン も 有 し て お り 、IgG 結 合 部 位 と は 異 な る 領 域 で あ る た め 、 両 者 は 拮 抗 せ ず に FcRn と 結 合 可 能 で あ る 4 1。
Fig.1-2 FcRn に よ る 抗 体 リ サ イ ク リ ン グ 機 構
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バ イ オ 医 薬 品 開 発 に お い て 、FcRn と の 相 互 作 用 は 血 中 半 減 期 や IgG 抗 体 医 薬 品 の 代 謝 と 密 接 に 関 わ る た め 、 欠 か せ な い テ ー マ で あ り 、 こ れ ま で に 様 々 な 試 み が 行 わ れ て い る 。IgG 抗 体 の Fc 領 域 を 改 変 し 、FcRn と の 結 合 親 和 性 を 向 上 さ せ る 研 究 4 2や 、中 外 製 薬 社 が 開 発 し た ス イ ー ピ ン グ 抗 体 4 3 , 4 4な ど が 挙 げ ら れ る 。ス イ ー ピ ン グ 抗 体 は 中 性 条 件 下 で FcRnと 結 合 可 能 な よ う に Fc 領 域 を 改 変 し た 抗 体 で あ り 、 血 中 抗 原 と 結 合 し た 抗 体 が FcRn と 結 合 し 、 細 胞 内 に 取 り 込 ま れ 、 抗 原 の み が 酸 性 条 件 下 で 解 離 し 、 抗 体 は 再 度 血 中 に 戻 る こ と で 、 標 的 抗 原 の 血 中 か ら の 排 除 を 効 率 化 す る デ ザ イ ン と な っ て い る 。
FcRn は HSA と も 結 合 し 、 そ の 血 中 半 減 期 延 長 に も 貢 献 し て い る こ と か ら 、 HSA へ の 結 合 能 を 利 用 し た バ イ オ 医 薬 品 の 半 減 期 延 長 の 取 り 組 み も 行 わ れ て い る 。2002 年 に Dennis ら（Genentech 社 ）は ラ ン ダ ム ペ プ チ ド 提 示 M13 フ ァ ー ジ ラ イ ブ ラ リ か ら HSA に 結 合 可 能 な ペ プ チ ド を 単 離 し 4 5、抗 体 の Fab の 末 端 に こ の ペ プ チ ド を 融 合 す る こ と で 血 中 半 減 期 を 延 長 可 能 で あ る こ と を 報 告 し て い る 4 6。 同 様 に こ の ペ プ チ ド を ラ ク ダ 科 動 物 由 来 の 重 鎖 抗 体 の 抗 原 結 合 ド メ イ ン で あ る VHHへ 融 合 し 、血 中 半 減 期 を 延 長 し た 報 告 4 7も 存 在 す る 。ま た 、Ablynx 社 は 血 中 サ イ ト カ イ ン を ブ ロ ッ ク す る こ と で 炎 症 を 抑 え る 目 的 で VHH 抗 体 医 薬 品 を 開 発 し て い る が 、抗 原 結 合 ド メ イ ン で あ る VHHは FcRn へ の 結 合 能 を 有 さ ず 、血 中 半 減 期 が 短 い 。こ の 問 題 を 解 決 す る た め 、サ イ ト カ イ ン 特 異 的 な VHH と HSA に 特 異 的 な VHHを 融 合 し た 複 数 （2 ま た は 3） の VHH が 繋 が っ た 医 薬 品 フ ォ ー マ ッ ト を 開 発 し て い る 4 8 , 4 9。
IgG抗 体 に お い て 各 FcγRは CH2 領 域 に 結 合 す る が 、FcRn は CH2、CH3 領 域 の 間 の 領 域 に 結 合 す る 。CCAP 法 で 使 用 し て い る IgG 結 合 ペ プ チ ド は こ の FcRnの エ ピ ト ー プ と 重 な っ て い る こ と か ら 、 ペ プ チ ド 修 飾 に よ る IgG 抗 体 の FcRn 結 合 能 へ の 影 響 は 確 認 す る 必 要 が あ る 。FcRnへ の 結 合 能 が 阻 害 さ れ る 場 合 、血 中 半 減 期 の 低 下 が 予 想 さ れ る た め 、 医 薬 品 フ ォ ー マ ッ ト と し て の 使 用 が 制 限 さ れ る が 、 二 量 体 で あ る Fc の 片 側 の み に ペ プ チ ド が 修 飾 さ れ た 場 合 、 他 方 の Fc が FcRn と 結 合 し 、 親 和 性 な ら び に 血 中 半 減 期 を 維 持 し て い る こ と が 期 待 で き る 。
10 1-2 抗 体 医 薬 品
抗 体 は 生 体 防 御 機 構 で あ る 免 疫 系 に お け る 主 要 な タ ン パ ク 質 で あ り 、 特 定 の 抗 原 に 対 し 、 高 い 特 異 性 お よ び 親 和 性 で 結 合 す る 性 質 を 有 し て い る 。 こ の こ と か ら 、 副 作 用 の 少 な い 医 薬 品 と し て の 利 用 さ れ て い る 。 抗 体 の 利 用 は 、 ハ イ ブ リ ド ー マ 技 術 の 確 立 に よ り 、モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 5 0の 生 産 が 可 能 に な っ た こ と か ら 発 展 し た 。 ま た 、 遺 伝 子 組 み 換 え 技 術 の 発 展 に よ っ て 人 工 的 な 抗 体 の 生 産 が 可 能 と な り 、 現 在 で は 様 々 な 抗 原 に 対 す る 抗 体 が 作 製 さ れ 、 多 岐 に わ た っ て 利 用 さ れ て い る 。抗 体 医 薬 品 の 主 な 作 用 機 序 を 図 で 示 し た（Fig.1-3）。細 胞 上 の 標 的 抗 原 に 結 合 し 、 前 述 の ADCC 活 性 1 9 や 、CDC 活 性 に よ っ て 細 胞 傷 害 活 性 を 誘 導 す る も の は 、 主 に が ん に 対 す る 抗 体 医 薬 品 と し て 利 用 さ れ て い る 。 代 表 例 と し て は 、 非 ホ ジ キ ン リ ン パ 腫 に 使 用 さ れ る 抗 CD20 抗 体 で あ る Rituximab や 乳 が ん に 使 用 さ れ る 抗 Her2 抗 体 で あ る Trastuzumab な ど が 挙 げ ら れ る 。 Trastuzumab の 標 的 で あ る Her2 は が ん 細 胞 の 増 殖 に 関 わ る 受 容 体 で あ り 、 Trastuzumab は そ の 機 能 を 阻 害 す る こ と に よ る 増 殖 抑 制 効 果 も 有 し て い る 。 ま た 、細 胞 上 の 受 容 体 や そ の リ ガ ン ド（ 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン ）に 結 合 す る こ と で 、 効 果 を 発 揮 す る 抗 体 医 薬 品 と し て は 、炎 症 性 サ イ ト カ イ ン TNF-α を 標 的 と す る イ ン フ ル キ シ マ ブ な ど が 挙 げ ら れ る 。
Fig.1-3 抗 体 医 薬 品 の 主 な 作 用 機 序
11 1-3 抗 体 医 薬 品 へ の 分 子 修 飾
従 来 の が ん に 対 す る 抗 体 医 薬 品 の 作 用 機 序 は 、 生 命 が 本 来 有 す る 免 疫 機 構 を 利 用 し た も の 、 す な わ ち 免 疫 細 胞 の 活 性 化 に 伴 う 細 胞 傷 害 活 性 や 、 補 体 の 活 性 化 に 伴 う 細 胞 傷 害 活 性 ま た は 、 が ん 増 殖 に 関 わ る 受 容 体 や リ ガ ン ド と の 結 合 に よ る 増 殖 阻 害 が 中 心 で あ っ た 。 そ の 利 点 は 前 述 の 通 り 、 標 的 特 異 性 に 由 来 す る 少 な い 副 作 用 で あ る が 、 免 疫 機 構 に 依 存 し た 活 性 は 、 免 疫 力 の 低 下 な ど の 要 因 に よ り 減 弱 す る 可 能 性 が あ る 。 一 方 、 抗 が ん 剤 療 法 で は 低 分 子 の 薬 剤 が 、 が ん 細 胞 に 到 達 す る こ と が で き れ ば が ん 細 胞 の ア ポ ト ー シ ス を 誘 導 す る こ と が で き 、 免 疫 細 胞 に 依 存 せ ず に 効 果 を 発 揮 す る こ と が で き る 。 し か し 、 そ の 最 大 の 欠 点 は が ん 細 胞 以 外 の 細 胞 に も 働 き 、時 に 重 篤 な 副 作 用 を 伴 う こ と で あ る 。そ こ で 、 が ん 細 胞 特 異 的 な タ ー ゲ テ ィ ン グ が 可 能 な 抗 体 に 抗 が ん 剤 を 結 合 さ せ た 抗 体 薬 物 複 合 体（ADC : Antibody Drug Conjugate）が 開 発 さ れ た 。ADC の 作 用 機 序 は 、 ま ず 抗 体 が 標 的 で あ る が ん 細 胞 表 面 受 容 体 へ 結 合 を 形 成 す る こ と か ら 始 ま る 。 結 合 し た 抗 体 は 受 容 体 の 細 胞 内 部 移 行 に 伴 い 細 胞 内 へ 移 行 し 、 リ ソ ソ ー ム で 分 解 さ れ る 際 に 抗 が ん 剤 を 放 出 す る （Fig.1-4）。 理 想 的 な ADC の 利 点 は 抗 体 が 標 的 と す る 細 胞 内 の み で 抗 体 放 出 が 起 こ る こ と で あ り 、 副 作 用 の 無 い 抗 が ん 剤 輸 送 シ ス テ ム と し て 利 用 す る こ と が で き る 。 し か し 、 前 述 通 り 、 従 来 の 抗 体 修 飾 法 で は 抗 が ん 剤 結 合 部 位 同 定 で き ず 、 結 合 価 数 を コ ン ト ロ ー ル す る こ と も 困 難 で あ る と い っ た 問 題 点 も 有 し て い る 。
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Fig.1-4 抗 体 薬 物 複 合 体 （ADC） の 作 用 機 序
現 在 ま で に 、4 種 類 の ADC が FDA に よ っ て 承 認 さ れ て お り 、 臨 床 開 発 中 の ADC も 多 く 存 在 す る 。4 種 類 の 内 容 は 、2000 年 の Mylotarg® (gemtuzumab ozogamicin)(Pfizer)、2011 年 の Adcetris®(brentuximab vedotin)(Seattle Genetics and Millennium)、2013 年 の Kadcyla®(ado-trastuzumab emtansine)(Genentech and Roche)、2017 年 の Besponsa® (inotuzumab ozogamicin)(Pfizer)で あ る 。Mylotarg®
は 急 性 骨 髄 性 白 血 病 の 治 療 薬 と し て 開 発 さ れ た ADCで あ り 、抗 CD33 抗 体 に 抗 が ん 剤 で あ る オ ゾ ガ マ イ シ ン を 修 飾 し 、 作 製 さ れ た 。 修 飾 方 法 は 抗 体 内 の ラ ン ダ ム な Lys 残 基 に 修 飾 を 行 う ア ミ ン カ ッ プ リ ン グ 法 で あ る 5 1 , 5 2（Fig.1-5）。史 上 初 の ADC で あ っ た が 、 他 抗 が ん 剤 と の 併 用 に お い て 憂 慮 す べ き 事 象 が 発 現 し た こ と （ 死 亡 事 例 ） に よ り 承 認 が 取 り 下 げ ら れ 、 製 造 開 発 メ ー カ ー で あ る フ ァ イ ザ ー は 2010 年 に 市 場 か ら 本 品 を 撤 退 さ せ た 。Adcetris®は ホ ジ キ ン リ ン パ 腫 (HL)、未 分 化 大 細 胞 型 リ ン パ 腫 (ALCL)の 治 療 薬 と し て 開 発 さ れ た ADC で あ り 、 抗 CD30 抗 体 に 抗 が ん 剤 で あ る Monomethyl Auristatin E（MMAE）を 修 飾 し 、作
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製 さ れ た 。修 飾 方 法 は 抗 体 CH1、CL、ヒ ン ジ 領 域 に 存 在 す る Cys 残 基 を 還 元 し 、 マ レ イ ミ ド 基 を 有 す る リ ン カ ー に よ っ て 抗 が ん 剤 修 飾 を 行 う 方 法 で あ る 5 3。 抗 体 内 に 元 々 存 在 す る Cys 残 基 を 用 い た 修 飾 法 で 、 修 飾 部 位 が 決 ま っ て お り 、 抗 原 結 合 能 や 、 体 内 半 減 期 等 抗 体 の 機 能 に 影 響 を 与 え る 部 位 で は な く （Fig1-5）、
修 飾 価 数 が 2～8 の 間 で ラ ン ダ ム で あ り 、 抗 体 内 の ジ ス ル フ ィ ド 結 合 が 失 わ れ る こ と か ら 、 抗 体 の 構 造 的 な 安 定 性 が 失 わ れ る 可 能 性 が あ る 5 4。 本 剤 に 使 用 さ れ て い る 抗 が ん 剤 MMAE は チ ュ ー ブ リ ン 重 合 阻 害 剤 で あ り 、 微 小 管 の 形 成 を 阻 害 す る こ と に よ り 、 強 力 な 抗 が ん 作 用 を 発 揮 す る 。FDA で は 2011 年 に 承 認 さ れ 、2014 年 に は 日 本 で も 承 認 さ れ た 。Kadcyla®は 乳 が ん の 治 療 薬 と し て 開 発 さ れ た ADC で あ り 、 抗 Her2 抗 体 に 抗 が ん 剤 で あ る emtansine（DM1） を 修 飾 し 、 作 製 さ れ た 5 5。 修 飾 方 法 は 、 抗 体 内 の ラ ン ダ ム な Lys 残 基 に 修 飾 を 行 う ア ミ ン カ ッ プ リ ン グ 法 で あ る 。 本 剤 に 使 用 さ れ て い る 抗 が ん 剤 DM1 も MMAE と 同 様 に チ ュ ー ブ リ ン 重 合 阻 害 剤 で あ り 、 微 小 管 の 形 成 を 阻 害 す る こ と に よ り 、 強 力 な 抗 が ん 作 用 を 発 揮 す る 。FDA で は 2013 年 に 承 認 さ れ 、日 本 で も 2013 年 に 承 認 さ れ た 。Besponsa®は 難 治 性 の 前 駆 B 細 胞 性 急 性 リ ン パ 性 白 血 病（ALL） の 治 療 薬 と し て 開 発 さ れ た ADCで あ り 、抗 CD22 抗 体 に 抗 が ん 剤 で あ る オ ゾ ガ マ イ シ ン を 修 飾 し 、 作 製 さ れ た 5 6 , 5 7。 修 飾 方 法 は 、 抗 体 内 の ラ ン ダ ム な Lys 残 基 に 修 飾 を 行 う ア ミ ン カ ッ プ リ ン グ 法 で あ る 。 本 剤 に 使 用 さ れ て い る 抗 が ん 剤 オ ゾ ガ マ イ シ ン は バ ク テ リ ア Micromonospora echinospora に 由 来 す る エ ン ジ イ ン 抗 生 物 質 の 誘 導 体 で あ る 。DNA を 標 的 と し 、DNA 切 断 を 引 き 起 こ す こ と に よ り 、 強 力 な 抗 が ん 作 用 を 発 揮 す る 5 8。
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Fig.1-5 従 来 の ADC作 製 方 法
1-4 フ ァ ー ジ デ ィ ス プ レ イ 技 術 と VHH 抗 体
我 々 の 研 究 室 で は 、 フ ァ ー ジ デ ィ ス プ レ イ 技 術 を 用 い て 、 抗 体 や ペ プ チ ド と い っ た 結 合 性 分 子 の 探 索 を 行 っ て き た 。 フ ァ ー ジ デ ィ ス プ レ イ 技 術 は 、 大 腸 菌 に 感 染 す る こ と で 増 殖 ・ 複 製 を 行 う ウ イ ル ス で あ る フ ァ ー ジ に 外 来 ポ リ ペ プ チ ド 鎖 を コ ー ド す る DNA を 挿 入 す る こ と で 、 フ ァ ー ジ の コ ー ト タ ン パ ク 質 上 に 外 来 性 の ラ ン ダ ム ポ リ ペ プ チ ド を 融 合 さ せ た 形 で の 提 示 さ せ る 技 術 で あ り 、 1985 年 に Smith ら が 繊 維 状 フ ァ ー ジ に 外 来 性 の ラ ン ダ ム ポ リ ペ プ チ ド を 融 合 さ せ た 形 で の 提 示 が 可 能 で あ る こ と を 報 告 し た 5 9, 6 0 , 6 1。 最 も 一 般 的 に 用 い ら れ て い る M13 フ ァ ー ジ で は コ ー ト タ ン パ ク 質 で あ る g3p6 2、g8p6 3、g6p6 4、g7p6 5、 g9p6 6に 外 来 分 子 を 提 示 し た デ ィ ス プ レ イ シ ス テ ム が 確 立 さ れ て い る 。現 在 で は 主 に 大 腸 菌 の F Pilus （F繊 毛 ）と 結 合 し 感 染 の 開 始 に 利 用 さ れ る g3P に 1-5 分 子 の 外 来 分 子 を 提 示 す る シ ス テ ム ま た は 、M13フ ァ ー ジ を 形 成 す る コ ー ト タ ン パ ク 質 の 中 で 最 も 数 の 多 い（ 約 3000 分 子 ）g8p に 提 示 さ せ る シ ス テ ム が 用 い ら れ て お り 、 有 用 な 生 理 活 性 ペ プ チ ド や 抗 体 の 探 索 研 究 な ど 様 々 な 分 野 で 応 用 さ れ て い る 。 フ ァ ー ジ デ ィ ス プ レ イ 技 術 は 、 同 時 に 多 様 な 配 列 を 提 示 し た フ ァ ー ジ を 扱 う こ と が で き る だ け で な く 、 フ ァ ー ジ 上 に 提 示 さ れ て い る ペ プ チ ド ま た は タ ン パ ク 質 分 子 の ア ミ ノ 酸 配 列 と フ ァ ー ジ 内 部 に パ ッ ケ ー ジ ン グ さ れ て い る
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DNA配 列 が 対 応 し て お り 、大 腸 菌 へ 感 染 さ せ る こ と で 遺 伝 子 情 報 を 維 持 し た 状 態 で 容 易 に ク ロ ー ニ ン グ で き る と い っ た 利 点 を 有 し て い る 。
フ ァ ー ジ デ ィ ス プ レ イ 技 術 を 用 い て フ ァ ー ジ 上 に 多 様 な ペ プ チ ド や 抗 体 を 提 示 さ せ た 状 態 を フ ァ ー ジ ラ イ ブ ラ リ と 呼 ん で お り （Fig.1-6）、VHH 抗 体 な ど の 外 来 遺 伝 子 を フ ァ ー ジ ゲ ノ ム 上 に 組 み 込 ん だ ラ イ ブ ラ リ を 構 築 し た 後 は 通 常 、 バ イ オ パ ン ニ ン グ と 呼 ば れ る 手 法 に よ っ て 目 的 と す る 抗 原 に 対 し 結 合 可 能 な 分 子 を 提 示 し た フ ァ ー ジ の 濃 縮 、 単 離 操 作 を 実 施 す る 。 こ の 操 作 の 流 れ は 免 疫 系 で B 細 胞 上 に 提 示 さ れ た 抗 体 が 標 的 と 結 合 す る こ と で 増 殖 し 、高 い 親 和 性 を 有 す る 抗 体 発 現 細 胞 へ と 成 熟 し て い く 過 程 と 類 似 し て お り 、 試 験 管 内 に お い て 生 体 内 部 で 行 わ れ て い る 免 疫 シ ス テ ム を 模 倣 し て い る と い え る 。 通 常 バ イ オ パ ン ニ ン グ は 、 プ ラ ス チ ッ ク プ レ ー ト や チ ュ ー ブ 内 に 固 相 化 し た 抗 原 に 対 し 、 フ ァ ー ジ ラ イ ブ ラ リ を 反 応 さ せ 、 洗 浄 操 作 を 行 っ た 後 に 、 結 合 し た 状 態 で 残 っ て い る フ ァ ー ジ を 回 収 す る と い っ た 操 作 を 何 度 か 繰 り 返 す こ と で 実 施 さ れ る（Fig.1- 7）。 幾 度 か の ラ ウ ン ド を 経 て 回 収 さ れ た フ ァ ー ジ 中 に は 標 的 抗 原 に 対 し 高 い 親 和 性 を 有 す る 分 子 を 提 示 し た フ ァ ー ジ が 含 ま れ て い る こ と が 期 待 さ れ る た め 、 大 腸 菌 へ 感 染 さ せ 、 ク ロ ー ニ ン グ を 実 施 し 、 結 合 能 な ら び に DNA シ ー ク エ ン ス に よ っ て 標 的 特 異 的 分 子 の 配 列 が 単 離 、 同 定 さ れ る 。 近 年 、 次 世 代 シ ー ク エ ン サ ー に 発 達 に よ り 、 同 時 に 多 数 の DNA シ ー ク エ ン ス を 行 う こ と が 可 能 に な っ た こ と か ら 、 バ イ オ パ ン ニ ン グ の 前 後 の フ ァ ー ジ ラ イ ブ ラ リ 中 に 含 ま れ て い た 遺 伝 子 情 報 を 次 世 代 シ ー ク エ ン サ ー で 解 析 す る こ と で 、 パ ン ニ ン グ 後 に 増 幅 し た 標 的 抗 原 に 結 合 可 能 な 配 列 を 網 羅 的 に 同 定 す る こ と が 可 能 と な っ て い る 6 7。
Fig.1-6 VHH 抗 体 提 示 フ ァ ー ジ の 構 造
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Fig.1-7 バ イ オ パ ン ニ ン グ の 流 れ
繊 維 状 M13 フ ァ ー ジ の 他 に 、 溶 菌 性 フ ァ ー ジ で あ る T7 を 用 い た 分 子 提 示 ラ イ ブ ラ リ も 利 用 さ れ て い る 。T7 DNA は 直 鎖 ニ 本 鎖 で あ り 、 成 熟 し た フ ァ ー ジ 粒 子 は 細 胞 溶 解 (溶 菌)に よ っ て 放 出 さ れ る 。繊 維 状 フ ァ ー ジ で の 提 示 と は 異 な り 、T7 上 に 提 示 さ れ る ペ プ チ ド や タ ン パ ク 質 は 細 胞 膜 を 通 し た 分 泌 過 程 を 経 ず 、大 腸 菌 細 胞 質 内 の 還 元 的 条 件 下 で 形 成 さ れ た 状 態 で 放 出 さ れ る こ と に な る 。 そ の た め 、 ペ プ チ ド な ど の 短 い 配 列 で は 放 出 後 に ジ ス ル フ ィ ド 結 合 を 形 成 す る こ と が 可 能 で あ る が 、 タ ン パ ク 質 で は 変 性 し た 状 態 の ま ま 提 示 さ れ る 可 能 性 が あ る 。 一 方 、 フ ァ ー ジ 粒 子 の 形 成 が 大 腸 菌 内 の サ イ ト プ ラ ズ ム で 起 こ る と い う 特 徴 は 、フ ァ ー ジ タ ン パ ク 質-外 来 性 ポ リ ペ プ チ ド 複 合 体 の 提 示 が 、宿 主 細 胞 の タ ン パ ク 質 合 成 系 と そ の 分 泌 系 に 依 存 す る 必 要 が な い こ と を 意 味 し 、 こ れ に よ っ て 繊 維 状 フ ァ ー ジ 提 示 系 と 比 較 し て 、 発 現 さ れ る ペ プ チ ド 配 列 の 偏 り が 少 な い と い う メ リ ッ ト を 有 し て い る 。T7 フ ァ ー ジ ラ イ ブ ラ リ シ ス テ ム は Novagen Inc.に よ っ て 報 告 さ れ 、市 販 化 さ れ て い る 。こ の 市 販 ラ イ ブ ラ リ は 、T7 フ ァ ー ジ へ の 外 来 ペ プ チ ド 提 示 数 の 異 な る い く つ か の バ リ エ ー シ ョ ン が 存 在 す る 。T7 フ ァ ー ジ の 頭 部 を 構 成 す る G10タ ン パ ク 質 す べ て を 利 用 し た 415分 子 の 提 示 系
（T7Select® 415）か ら 、10 分 子（T7Select®10）、1分 子（T7Select®1）と 三 種 類 の 提 示 が 可 能 で あ る 。 提 示 す る ポ リ ペ プ チ ド の 分 子 量 や 親 和 性 に 応 じ て 使 い 分 け が 可 能 と な っ て い る 。
ア ル パ カ を 含 む ラ ク ダ 化 の 動 物 は 通 常 の 抗 体 に 加 え 、 重 鎖 の み で 構 成 さ れ る
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重 鎖 抗 体 を 産 生 す る 。こ れ は 、1993 年 に ベ ル ギ ー の ブ リ ュ ッ セ ル 自 由 大 学（Vrije Universiteit Brussel） の Hamers 教 授 ら の グ ル ー プ に よ っ て 報 告 さ れ た 6 8。 こ の 重 鎖 抗 体 は 、 通 常 の 抗 体 が VH お よ び VL の 組 み 合 わ せ に よ り 抗 原 を 認 識 す る の に 対 し 、 単 一 可 変 ド メ イ ン で あ る VHH の み で 抗 原 と 結 合 す る こ と が で き る
（Fig.1-8）。VHH は 単 一 ド メ イ ン で 抗 原 と 結 合 す る の に も か か わ ら ず 、 通 常 の 抗 体 と 同 等 の 親 和 性 を 有 す る 。ま た 、VHH は 分 子 量 が 小 さ く 構 造 も 単 純 で あ る こ と か ら 工 学 的 改 変 が 容 易 で あ り 、 安 定 性 も 高 い こ と か ら 、 産 業 応 用 が 期 待 さ れ て い る 。 安 定 性 の 高 さ の 具 体 的 な 例 と し て は 、 高 温 条 件 下 に 曝 さ れ た 後 の リ フ ォ ー ル デ ィ ン グ 能 力 の 高 さ が 上 げ ら れ る 。1999 年 に van der Linden ら に よ っ て 報 告 さ れ た 例 6 9 に よ る と 、 通 常 の 抗 体 を 4-90℃ に 曝 し た 後 に 室 温 条 件 に 戻 し 、結 合 活 性 を 測 定 し た と こ ろ 60℃ 以 上 の 温 度 に 曝 さ れ る と 変 性 し 、リ フ ォ ー ル デ ィ ン グ す る こ と が で き な く な る た め 結 合 能 を 失 っ て し ま う 。 し か し 、VHH 抗 体 で あ れ ば 、90℃ ま で 加 熱 し た 後 で も 室 温 条 件 に 戻 す こ と で リ フ ォ ー ル デ ィ ン グ が 可 能 で あ る こ と が 見 出 さ れ た 。 こ れ は VHH 抗 体 が 一 旦 熱 変 成 し た 後 で も 再 度 リ フ ォ ー ル デ ィ ン グ す る こ と が 可 能 で あ る と い っ た こ と を 示 し て い る 。 ま た 、 単 一 の ド メ イ ン で 機 能 す る こ と か ら タ ン パ ク 質 工 学 に よ る エ ン ジ ニ ア リ ン グ も 容 易 で あ り 、 二 量 体 化 や 三 量 体 化 、 他 の タ ン パ ク 質 へ の 組 み 込 み 等 も 可 能 で あ る 。 実 際 に 二 量 体 化 や 三 量 体 化 す る こ と で 、 抗 原 結 合 親 和 性 が 10 倍 、 100 倍 に 増 強 さ れ る と い っ た 報 告 7 0も 存 在 す る 。 そ の た め 、 医 薬 品 を 含 む 様 々 な 分 野 へ の 応 用 が 期 待 さ れ た が 、 前 述 の Hamers 教 授 ら の グ ル ー プ に よ っ て 、 こ の 重 鎖 抗 体 の 抗 原 結 合 ド メ イ ン で あ る VHH（ ナ ノ ボ デ ィ ）の 医 薬 利 用 を 含 め た 、 か な り 広 範 囲 に わ た る 世 界 特 許 、 い わ ゆ る Hamers 特 許 （Immunoglobulins devoid of light chains: WO 1994004678）が 出 さ れ 、こ の 特 許 の 医 薬 へ の 独 占 実 施 権 を 持 つ Ablynxが 、長 く 医 薬 開 発 に お け る 優 位 な 地 位 を 占 め る こ と に な る 。し か し 、2013 年 8 月 に 基 本 特 許 は 期 限 切 れ と な っ た こ と か ら 、近 年 、世 界 的 に も 、 こ の VHH を 使 っ た 新 た な 医 薬 品 開 発 の 機 運 が 高 ま っ て い る 。 我 々 が 研 究 に 用 い て い る ア ル パ カ の 重 鎖 抗 体 に は 、VHH と 定 常 領 域 と つ な ぐ ヒ ン ジ の 長 さ が 異 な る 2種 類 が 存 在 し て お り 、 そ れ ぞ れ IgG2（Long hinge）、IgG3（Short hinge）
と 呼 ば れ る 。ア ル パ カ に お い て は 、血 液 中 に 存 在 す る 抗 体 の 約 50％ が 重 鎖 抗 体 で あ る こ と が 報 告 7 1さ れ て い る 。
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本 研 究 に お い て も こ の 重 鎖 抗 体 由 来 VHH 抗 体 に 着 目 し 、CCAP 法 に よ っ て VHH抗 体 を IgG 抗 体 へ 修 飾 す る こ と で 、二 重 特 異 性 抗 体 フ ォ ー マ ッ ト を 構 築 し た 。 こ れ は 、VHH 抗 体 が 単 一 ド メ イ ン で 結 合 能 を 発 揮 す る 最 小 の 抗 体 で あ り 、 抗 体 工 学 に お け る 材 料 と し て 適 し て い る と 考 え た か ら で あ る 。 本 研 究 で 使 用 し た VHH 抗 体 は 好 中 球 表 面 受 容 体 で あ る FcαR を 標 的 と す る VHH で あ る が 、 ア ル パ カ へ の FcαR 免 疫 を 経 て 、 フ ァ ー ジ デ ィ ス プ レ イ ラ イ ブ ラ リ を 構 築 し 、 ス ク リ ー ニ ン グ に よ っ て 単 離 し た 抗 FcαR VHHク ロ ー ン を 使 用 し た 。
Fig.1-8 ア ル パ カ 重 鎖 抗 体
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第２章
IgG 結合ペプチドを用いた抗体
修飾（ CCAP 法）
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第 2章 IgG 結 合 ペ プ チ ド を 用 い た 抗 体 修 飾 （ CCAP 法 ）
2-1 緒 言
我 々 の 研 究 室 で は 、前 述 の T7 フ ァ ー ジ ラ イ ブ ラ リ シ ス テ ム を 用 い て 、IgG 抗 体 Fc部 位 特 異 的 に 結 合 可 能 な 17 ア ミ ノ 酸 か ら な り 、 内 部 に ジ ス ル フ ィ ド 結 合 を 1 つ 有 す る ペ プ チ ド （GPDCAYHRGELVWCTFH） を 単 離 し て い た 。 こ れ は 、 プ ロ テ イ ンAの 代 替 と し て IgG抗 体 精 製 時 の ア フ ィ ニ テ ィ ー リ ガ ン ド と し て 利 用 す る た め に 開 発 し た も の で あ る 。 こ の ペ プ チ ド は ヒ ト IgG1, IgG2, IgG4 へ 結 合 可 能 で あ り 、実 際 に プ ロ テ イ ン A 同 様 に IgGを 精 製 可 能 で あ る 。一 方 、後 述 の 結 晶 構 造 解 析 よ り 、ペ プ チ ド 8 番 目 の Arg 側 鎖 が IgG-Fc 内 の Lys 残 基 側 鎖 と 相 互 作 用 可 能 な 位 置 関 係 に あ る こ と が 明 ら か と な っ た 。 そ こ で 、 こ の 8 番 目 の Arg側 鎖 を Lys に 置 換 し ク ロ ス リ ン カ ー で あ る DSG（disuccinimidyl glutarate） を あ ら か じ め 修 飾 し た 後 に IgG と 混 合 す る こ と で 、IgG-Fc内 の 特 定 の Lys と ペ プ チ ド Lys 間 を ア ミ ド 結 合 に よ っ て 架 橋 で き る と 考 え た 。同 様 に IgG-Fc 部 位 特 異 的 な 分 子 を 用 い た 架 橋 法 と し て 、プ ロ テ イ ン A の Z ド メ イ ン に ロ ジ ウ ム 金 属 触 媒（ ロ ジ ウ ム（Ⅱ）ア セ タ ー ト ）を 修 飾 し 、ジ ア ゾ を 含 む 化 合 物 と 共 に IgG と イ ン キ ュ ベ ー ト す る こ と で 、IgG の 76 番 目 Asn特 異 的 に ジ ア ゾ 化 合 物 を 修 飾 す る 手 法 が 報 告 さ れ て い る 7 2。 こ の 手 法 で は 、 ロ ジ ウ ム 金 属 触 媒 を 修 飾 し た プ ロ テ イ ン A の Zド メ イ ン は 触 媒 と し て 利 用 さ れ て い る た め 、修 飾 反 応 後 の IgGへ は 残 ら な い 。 し か し 、IgG へ 化 学 結 合 を 形 成 す る 際 の 触 媒 と し て 使 用 さ れ る ロ ジ ウ ム は 重 金 属 で あ り 、 人 体 を 含 む 生 体 に と っ て は 毒 物 で あ る 。 そ の た め 、 生 体 に 投 与 さ れ る 医 薬 品 開 発 に 本 手 法 を 用 い る 場 合 、 ロ ジ ウ ム 金 属 の 除 去 が 課 題 と な る 。 一 方 、 我 々 が 今 回 考 案 し た ペ プ チ ド を 介 し た 抗 体 修 飾 法 は IgG に ペ プ チ ド が 残 存 す る も の の 、17 残 基 の ア ミ ノ 酸 で あ り 、人 体 へ 悪 影 響 を 及 ぼ す 可 能 性 が 低 い と 考 え ら れ る 。 本 章 で は 、IgG 結 合 ペ プ チ ド の 結 晶 構 造 解 析 の 結 果 か ら 、 実 際 に R8K 置 換 ペ プ チ ド を 用 い て IgG 抗 体 Fc 領 域 に 分 子 修 飾 が 可 能 で あ る か 検 証 す る と 共 に 、 修 飾 反 応 が IgG 248 Lys 特 異 的 で あ る こ と を 確 認 す る た ま に ペ プ チ ド マ ッ ピ ン グ に よ る 修 飾 部 位 の 同 定 も 実 施 し た 。
21 2-2 材 料 と 方 法
IgGと ペ プ チ ド の X線 結 晶 構 造 解 析
X 線 結 晶 構 造 解 析 は 量 子 科 学 技 術 研 究 開 発 機 構 の （ 故 ） 黒 木 良 太 博 士 、 安 達 基 泰 博 士 と の 共 同 研 究 と し て 依 頼 分 析 し て 頂 い た 。
Cysお よ び HC（ ホ モ シ ス テ イ ン ）が そ れ ら の 間 で 独 立 し て ジ ス ル フ ィ ド 架 橋 を 形 成 し て い る IgG-BP（G（HC）DCAYHRGELVWCT（HC）H-NH）と trastuzumab (Rosh) を パ パ イ ン 消 化 に よ り 調 製 し た ヒ ト IgG1-Fc を 結 晶 構 造 解 析 に 用 い た 。 Fc と IgG-BP の 非 共 有 結 合 複 合 体 は シ ッ テ ィ ン グ ド ロ ッ プ 蒸 気 拡 散 法 に よ っ て 結 晶 化 し 、 結 晶 化 液 滴 は 、16 mg/mL の 非 共 有 結 合 複 合 体 、20 mM の 2-モ ル ホ リ ノ エ タ ン ス ル ホ ン 酸 （pH 6.0） お よ び 0.1 M の 塩 化 ナ ト リ ウ ム を 含 有 す る 0.3 μL の タ ン パ ク 質 溶 液 と 、20 ％ （w/v） ポ リ エ チ レ ン グ リ コ ー ル 3350 （Sigma Aldrich） お よ び 0.3 μL の 0.2 M ヨ ウ 化 カ リ ウ ム （pH 6.9）(和 光 ケ ミ カ ル ズ ） を 添 加 し た 。 同 様 の 方 法 で 、Fc と IgG-BP-ビ オ チ ン （2 つ の Cys 残 基 が ジ ス ル フ ィ ド 結 合 し て い る biotin-PEG4-RGNCAYHKGQLVWCTYH-NH2）間 の 共 有 結 合 複 合 体 を 、0.1 M CHES（pH 10.0）、20 ％ （w/v）PEG-8000、 お よ び 0.3 M塩 化 ナ ト リ ウ ム を 含 む 溶 液 を 用 い て 、20 ℃で 2 週 間 イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン 後 に 結 晶 を 得 た 。
X 線 回 折 デ ー タ は 、KEK Photon Factory（ 筑 波 ） の BL17A beamline お よ び SPring-8（ 兵 庫 ） の BL38B1 beamline で 得 ら れ た 。 グ リ セ ロ ー ル を 、 凍 結 保 護 剤 と し て 、 沈 殿 剤 溶 液 中 の 最 終 濃 度 20 ％（w/v） で 使 用 し た 。X 線 回 折 デ ー タ は 、HKL-2000 suite of programs を 使 用 し て 統 合 さ れ 、 ス ケ ー ル さ れ た 。Fc ペ プ チ ド 複 合 体（PDB id：1DN2）の 構 造 を 探 索 モ デ ル と し 、PHASER を 用 い た 分 子 置 換 法 に よ り 、Fc複 合 体 の 初 期 相 情 報 を 得 た 。Fc複 合 体 構 造 の 結 晶 学 的 精 密 化 お よ び 手 動 モ デ ル 化 は 、そ れ ぞ れ phenix.refine お よ び XtalView ソ フ ト ウ ェ ア を 有 す る PHENIX ソ フ ト ウ ェ ア に よ っ て 実 施 し た 。結 晶 学 的 デ ー タ お よ び 統 計 デ ー タ は Table 2-1 に ま と め た 。
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Table 2-1 収 集 さ れ た X 線 回 折 デ ー タ お よ び 精 密 化 統 計 の ま と め Non-covalent
complex
Covalent complex
Beam line SPring-8 BL38B1 KEK-PF BL5A
Data collection date Nov.22.2014 Dec.12.2015
Wavelength (Å) 1.00 0.98
Data statistics
Resolution range (Å) 44.2–3.00 44.1–3.00 Outer shell (Å) 3.11–3.00 3.11–3.00
Space group P21 P21
Unit cell dimensions, a,b,c (Å) 66.1, 60.5, 69.5 61.1, 67.0, 78.3 α, β, γ 90.0, 101.3, 90.0 90.0, 106.4, 90.0
Total reflections 40,705 37,934
Unique reflections 10,959 (1,071) 12,253 (1,158)
Redundancy 3.7 (3.7) 3.1 (2.6)
I/I(δ) 9.5 (2.0) 8.4 (1.6)
Completeness (%) 99.9 (99.9) 98.4 (92.9)
R-merge (%) 13.8 (56.4) 15.9 (44.7)
Structure refinement
Software Phenix1.9 Phenix1.9
Resolution range (Å) 44.22–3.00 44.10–3.00
R-factor (%) 19.7 22.8
Free-R (%) 27.2 28.4
RMSD bonds (Å) 0.017 0.015
RMSD angles (deg.) 1.471 1.642
Mean B Value (Å2) 41.0 43.4
Protein chain A, B A, B
No. of protein residue 379, 379 379, 379
No. of water molecules 52 0
23 No. of molecules in an
asymmetrical unit
1 1
PDB ID 6IQG 6IQH
ペ プ チ ド の 合 成
合 成 ペ プ チ ド は Fmoc 固 相 合 成 法 に よ り 合 成 さ れ た 。 す べ て の ペ プ チ ド は C 末 端 側 を ア ミ ド 化 し て い る 。 保 護 基 を 除 去 し た 後 、 穏 や か な 酸 化 条 件 下 で 分 子 内 S-S 結 合 を 形 成 さ せ 、 逆 相 HPLC を 用 い て 分 子 内 S-S 結 合 ペ プ チ ド を 精 製 し た 。 ま た 、N 末 端 の ビ オ チ ン 化 は 、NHS- PEG4-Biotin を 用 い て 合 成 し た 。
表 面 プ ラ ズ モ ン 共 鳴 に よ る IgG-peptide の IgGへ の 親 和 性 解 析
表 面 プ ラ ズ モ ン 共 鳴 （SPR） に よ る 親 和 性 解 析 は Biacore T200(GE Healthcare) を 用 い て 、25℃の 条 件 下 で 実 施 し た 。IgG（Trastuzumab）は CM5 セ ン サ ー チ ッ プ（GE Healthcare）に ア ミ ン カ ッ プ リ ン グ 法 を 用 い た 装 置 プ ロ グ ラ ム を 用 い て 、 そ れ ぞ れ RU = 10000 で 固 定 化 し た 。HBS-EP buffer（pH7.4）(0.01 M HEPES, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005 % tween)中 に 調 製 し た 2000 nM か ら 15.6 nM の 範 囲 内 で 希 釈 し た IgG結 合 ペ プ チ ド を セ ン サ ー チ ッ プ に 3 分 間 、 流 速 50 µL/minで 流 し 、結 合 を 測 定 、10 分 間 HBS-EP buffer（pH 7.4） を 流 し 、解 離 を 測 定 し た 。 得 ら れ た セ ン サ ー グ ラ ム は 、BIA evaluation software の 1:1 binding model を 用 い て 解 析 し 、 親 和 性 解 析 を 行 っ た 。
IgG結 合 ペ プ チ ド へ の DSG コ ン ジ ュ ゲ ー ト と 精 製
20 μLの 20 mM ペ プ チ ド は 2 %ピ リ ジ ン を 含 む DMSO 中 に 調 製 さ れ 、 ア セ ト ニ ト リ ル 中 に 調 製 さ れ た 500 mM DSG 80 μLと 混 合 し た 後 に 50 ℃で 3 時 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し 、DSG を 付 加 し た 。反 応 物 は 250倍 量 の 0.1 % TFA (trifluoroacetic acid) で 希 釈 さ れ 、LC-forte(YMC)に 接 続 さ れ た InertSustain C18 カ ラ ム(5μm 7.6
× 250 mm column, GL Sciences)を 用 い た 逆 走 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー で 分 取 し た 。分 取 時 の 流 速 は 4.0 mL/min で 、グ ラ ジ エ ン ト 条 件 は ア セ ト ニ ト リ ル 13.5 %～72 %
（30 min）で あ る 。分 取 し た 生 成 物 は 遠 心 エ バ ポ レ ー タ ー で 50 分 間 ア セ ト ニ ト リ ル 除 去 操 作 を 行 っ た 後 に 、凍 結 乾 燥 し た 。乾 燥 後 の パ ウ ダ ー は DMSO に 溶 解
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ビ オ チ ン 標 識 ペ プ チ ド に よ っ て 修 飾 さ れ た IgG の SDS-PAGE と ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ ト
1.9 μMの hIgG1 , hIgA1 , HSAを 5 倍 量 の DSG 修 飾 し た ビ オ チ ン 化 IgG 結 合 ペ プ チ ド(NHS-IgG-BP-biotin)と PBS 中 で 反 応 さ せ 、15 分 反 応 さ せ 、1 M Tris- HCl (pH 7.0)を 加 え た 。各 サ ン プ ル を 2-メ ル カ プ ト エ タ ノ ー ル で 還 元 し 、5-20 % Supersep グ ラ ジ エ ン ト ゲ ル (Waco)を 用 い て 、SDS-PAGEし た 。泳 動 後 、タ ン パ ク 質 は ニ ト ロ セ ル ロ ー ス メ ン ブ レ ン に 転 写 し 、0.5 % BSAに て blocking 後 、SA- HRP、 基 質 に Chemi-Lumi One(ナ カ ラ イ テ ス ク)を 用 い て 検 出 し た 。 検 出 な ら び に 撮 影 は ChemiDOc XRS Plus(Bio-Rad)を 用 い て 行 っ た 。
ESI-MSを 用 い た 修 飾 個 数 分 析 と ペ プ チ ド マ ッ ピ ン グ
ESI-MS 分 析 は ACQUITY UPLC I-Class FTN system (Waters) に 接 続 さ れ た Xevo G2-XS QTof spectrometer (Waters) と Mass PREP Micro Desalting Column (2.1 × 5 mm, Waters) を 用 い て Waters株 式 会 社 へ の 依 頼 分 析 に よ っ て 実 施 さ れ た 。ESI-MS 分 析 時 の グ ラ ジ エ ン ト 条 件 は 0.1 %の ギ 酸 を 含 む ア セ ト ニ ト リ ル 5 %～90 %で 行 っ た 。Trastuzumab ま た は trastuzumab-IgG-BP (50 μg in 25 μL of water)へ 25 μL の 0.2% Rapigest SF (Waters)を 混 合 し 、2.6 μL の 100 mM dithiothreitol (DTT, 終 濃 度 5 mM)を 添 加 し 、60 ℃ で 30 分 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。 イ ン キ ュ ベ ー ト 後 、5.8 μL の 150 mM iodoacetamide (終 濃 度 15 mM)を 添 加 し 、 室 温 で 30 分 間 暗 所 に お い て イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。
ペ プ チ ド マ ッ ピ ン グ に 使 用 す る サ ン プ ル は 、12.5 μL の 0.2 μg/μLト リ プ シ ン を 加 え 、37 ℃ で 3.5 時 間 イ ン キ ュ ベ ー ト 後 、7.85 μL の 5% TFA (終 濃 度 0.5%) を 加 え 反 応 停 止 し た 。 遠 心 後 、 サ ン プ ル は ACQUITY UPLC Peptide BEH130 C18 column (1.7 µm, 2.1 × 150 mm, Waters)を 用 い て 質 量 分 析 さ れ た 。 分 析 時 の グ ラ ジ エ ン ト 条 件 は 0.1 %の ギ 酸 を 含 む ア セ ト ニ ト リ ル 0.1 %～90 %で 行 っ た（ カ ラ ム オ ー ブ ン は 60 ℃ ）。
25 2-3 結 果
IgG結 合 ペ プ チ ド の X線 結 晶 構 造 解 析
IgG 結 合 ペ プ チ ド の IgG 結 合 様 式 を 明 ら か に す る た め 、X 線 結 晶 構 造 解 析 を 行 っ た 。そ の 結 果 、こ の ペ プ チ ド は IgG Fc領 域 の CH2, CH3 境 界 領 域 に 結 合 し て い る こ と が 判 明 し た （Fig.2-1）。 ま た 、 こ の ペ プ チ ド は 1 分 子 の Fc あ た り 2 カ 所 結 合 サ イ ト を 有 し て い る 。 興 味 深 い こ と に 、 こ の ペ プ チ ド の 結 合 サ イ ト 近 傍 に は Lys 残 基 が 存 在 し 、 こ れ は ペ プ チ ド 側 の 8 番 目 の ア ル ギ ニ ン と 6.13 Å, の 距 離 に 位 置 し て お り 、相 互 作 用 可 能 な 位 置 関 係 に あ っ た（Fig.2-2）。ま た 、ペ プ チ ド の N 末 端 、C 末 端 領 域 は そ れ ぞ れ Fc 領 域 の 外 側 を 向 い て お り 、 ペ プ チ ド の 末 端 部 位 に 様 々 な 分 子 を 修 飾 可 能 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た 。 実 際 に 、X 線 結 晶 構 造 解 析 の デ ー タ を 基 に 分 子 構 造 モ デ ル 解 析 を 行 っ た と こ ろ 、8 番 目 の ア ル ギ ニ ン を リ ジ ン に 置 換 し た IgG 結 合 ペ プ チ ド（R8K）は DSG 架 橋 剤 を 介 し て 抗 体 Fc248 番 目 の リ ジ ン を 介 し て 共 有 結 合 を 形 成 可 能 で あ る こ と が 判 明 し た
（Fig.2-3）。 こ の こ と は 、IgG 結 合 ペ プ チ ド （R8K） を 抗 体 部 位 特 異 的 な 修 飾 が 可 能 で あ る こ と を 示 唆 し て お り 、 ペ プ チ ド 末 端 部 位 に 機 能 性 分 子 を 修 飾 し た 状 態 で 抗 体 へ 結 合 す る こ と が 可 能 で あ れ ば 、 抗 体 へ の 部 位 特 異 的 分 子 修 飾 架 橋 剤 と し て 利 用 す る こ と が 可 能 と な る 。
Fig.2-1 IgG 結 合 ペ プ チ ド と IgG-Fc 複 合 体 の X 線 結 晶 構 造 解 析
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Fig.2-2. IgG 結 合 ペ プ チ ド 内 Arg残 基 と Fc内 の Lys 残 基 間 の 距 離
Fig.2-3 IgG結 合 ペ プ チ ド(R8K)と Fc-248Lys 間 の DSG 架 橋 モ デ ル
IgG結 合 ペ プ チ ド の 結 合 親 和 性 解 析
IgG 結 合 ペ プ チ ド を 介 し て IgG 抗 体 へ 分 子 を 修 飾 す る た め に は 8 番 目 の Arg を Lysへ 置 換 す る こ と（R8K）、ペ プ チ ド 末 端 に 分 子 を 修 飾 し て お く こ と が 必 要 と な る 。 こ の 2 カ 所 の 改 変 が 、 ペ プ チ ド の 親 和 性 に 与 え る 影 響 を 確 認 す る 必 要 が あ っ た 。 ま た 、 こ の IgG結 合 ペ プ チ ド は 分 子 内 に ジ ス ル フ ィ ド 結 合 を 有 し て い る こ と か ら 、 末 端 に チ オ ー ル 基 を 導 入 す る こ と が 制 限 さ れ て い た 。 こ れ は 分
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子 内 で ジ ス ル フ ィ ド 結 合 の シ ャ ッ フ リ ン グ が 起 こ る 可 能 性 に よ る も の で あ る 。 し か し 、 チ オ ー ル 基 は マ レ イ ミ ド を 介 し た 分 子 修 飾 の 標 的 官 能 基 と し て 非 常 に 簡 便 に 利 用 で き る こ と か ら 、 チ オ ー ル 基 を 導 入 可 能 な ペ プ チ ド デ ザ イ ン と し て 分 子 内 ジ ス ル フ ィ ド 結 合 を ジ ク ロ ロ ア セ ト ン で 不 可 逆 的 に 架 橋 し た デ ザ イ ン を 考 案 し た 。筆 者 は 最 初 に IgG 結 合 ペ プ チ ド な ら び に 分 子 修 飾 IgG結 合 ペ プ チ ド 、 ジ ク ロ ロ ア セ ト ン 架 橋 ペ プ チ ド の IgG へ の 親 和 性 を 解 析 し た 。Biacore T200 を 用 い て 、CM5 セ ン サ ー チ ッ プ へ IgG 抗 体 医 薬 品 で あ る Trasutuzumab を 固 相 化 し 、ア ナ ラ イ ト と し て IgG 結 合 ペ プ チ ド（NH2-PEG4-GPDCAYHRGELVWCTFH- NH2 ） ま た は 、 ジ ク ロ ロ ア セ ト ン 架 橋 ペ プ チ ド （ NH2-PEG4- GPDCAYHRGELVWCTFH -NH2）（Cys 残 基 間 は ジ ク ロ ロ ア セ ト ン 架 橋 ）を 用 い た 。 結 果 と し て 、IgG結 合 ペ プ チ ド （8R） は 15 nM（Fig.2-4 A）、 ジ ク ロ ロ ア セ ト ン 架 橋 IgG結 合 ペ プ チ ド （8R） は 6800 nM（Fig.2-4 B） の 親 和 性 で そ れ ぞ れ IgG 抗 体 と 結 合 可 能 で あ る こ と を 確 認 し た （Fig.2-4）（Table 2-2）。
Fig.2-4 IgG結 合 ペ プ チ ド の 結 合 親 和 性 解 析
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Table 2-2 各 IgG 結 合 ペ プ チ ド の IgG へ の 結 合 親 和 性
抗 体 と ペ プ チ ド 間 で の 部 位 特 異 的 共 有 結 合 の 形 成
我 々 は 、IgG 結 合 ペ プ チ ド の ア ミ ノ 酸 置 換 体（R8K）に 種 々 の 機 能 性 分 子 を 修 飾 し た 上 で 、IgG-Fc 248 と 共 有 結 合 さ せ る こ と で 、抗 体 へ の 部 位 特 異 的 な 修 飾 法 へ と 応 用 す る こ と が で き る と 考 え た（Fig.2-5）。こ の 手 法 の 利 点 と し て 、こ れ ま で は 抗 体 側 の 構 造 変 化 や 、 非 天 然 ア ミ ノ 酸 の 導 入 な ど の 手 法 に 限 ら れ て い た 抗 体 部 位 特 異 的 修 飾 を 抗 体 側 の 改 変 を 伴 う こ と な く 達 成 可 能 と な る こ と 。 ペ プ チ ド 末 端 の デ ザ イ ン が 自 由 に 行 え る こ と か ら 、 様 々 な 官 能 基 を 介 し た 多 様 な 分 子 修 飾 に 対 応 可 能 で あ る こ と が 挙 げ ら れ る 。 我 々 は 最 初 に 抗 体 へ 修 飾 さ れ る 分 子 と し て 代 表 的 な 機 能 性 分 子 で あ る ビ オ チ ン を こ の IgG 結 合 ペ プ チ ド （R8K） の N 末 端 領 域 に 修 飾 し た 状 態 （Fig.2-6A） で IgG-Fc 領 域 と の 間 で DSG を 介 し た 共 有 結 合 が 形 成 さ れ る か ど う か 評 価 を 行 っ た 。hIgG , hIgA , HSA 各 5 µg と ビ オ チ ン 修 飾 IgG結 合 ペ プ チ ド(R8K) 250 ngを5分 間 反 応 さ せ 、Tris-HCl (pH7.0) で 反 応 停 止 し た 後 に 、 各 サ ン プ ル を 2-メ ル カ プ ト エ タ ノ ー ル で 還 元 し SDS- PAGE と ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ を 行 い 、ス ト レ プ ト ア ビ ジ ン-HRP に よ っ て 抗 体 に 共 有 結 合 で コ ン ジ ュ ゲ ー ト さ れ た ペ プ チ ド を 検 出 し た（Fig.2-6B）。結 果 と し て 、こ の ビ オ チ ン 修 飾 IgG 結 合 ペ プ チ ド は IgG 抗 体 と 共 有 結 合 し た 状 態 で 検 出 さ れ た 。 ま た 、 こ の 反 応 は IgA な ら び に HAS に 対 し て は 起 こ っ て お ら ず 、 反 応 の 特 異 性 も 確 認 さ れ た 。 さ ら に 、 こ の 反 応 は IgG 結 合 ペ プ チ ド の 結 合 様 式 か ら 推 測 さ れ る よ う に 1 分 子 の IgG に 対 し 1価 ま た は 2価 の コ ン ジ ュ ゲ ー ト 産 物 を 生 成 す る 。 生 成 物 反 応 物 を 陽 イ オ ン 交 換 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー で 分 析 し た 結 果（Fig.2-7）、得 ら れ た パ タ ー ン か ら 1価 、2価 の 生 成 物 を 容 易 に 分 取 精 製 す る こ と が 可 能 で あ る こ と 、3 価 以 上 の 反 応 物 が 生 じ て い な い こ と も 判 明 し た 。我 々
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は 、こ の IgGペ プ チ ド を 用 い た 新 規 抗 体 部 位 特 異 的 修 飾 法 を CCAP 法（Chemical Conjugation by Affinity Peptide） と 命 名 し た 。
Fig.2-5 IgG 結 合 ペ プ チ ド を 介 し た IgG-Fc 部 位 特 異 的 な 分 子 修 飾
Fig.2-6 IgG-Fc 特 異 的 な ビ オ チ ン 修 飾 を SDS-PAGE と ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ に よ っ て 評 価
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Fig.2-7 陽 イ オ ン 交 換 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に よ る IgG-peptide コ ン ジ ュ ゲ ー ト の 形 成 確 認
ペ プ チ ド マ ッ ピ ン グ に よ る CCAP法 の 部 位 特 異 性 を 評 価
CCAP 法 に よ る ペ プ チ ド 修 飾 の 特 異 性 を 評 価 す る た め に 実 施 し た ESI-MS 分 析 に 際 し 、Trastuzumab へ 修 飾 し た IgG-BP の 構 造 を 示 す（Fig.2-8）。こ の ペ プ チ ド を Trastuzumab へ 2 価 で 修 飾 し た も の を ESI-MS で 分 析 を 行 っ た （Fig.2-9）。
予 想 さ れ た 分 子 量 の 増 加 は ペ プ チ ド 2 分 子 － 水 2 分 子 （2116.36 × 2 － 18.00
×2）で あ り 、増 加 後 の 分 子 量 は 152255.89 と 予 想 さ れ た 。結 果 は 、152255.75 で あ り 、予 測 通 り 、IgG-BP が IgG に 対 し 2 価 で 修 飾 さ れ て い る こ と が 明 ら か と な っ た 。引 き 続 き 、CCAP 法 に よ る 修 飾 が 重 鎖 特 異 的 で あ る こ と を 確 認 す る た め 、 IgG-BP 修 飾 後 の Trastuzumab を 還 元 処 理 し 、 分 析 を 行 っ た 。 還 元 処 理 を 行 っ て い る た め 、修 飾 さ れ た IgG-BP は 還 元 さ れ た 状 態 と な っ て い る（Fig.2-10）。予 想 さ れ た 分 子 量 の 増 加 は 重 鎖 に お い て 、 ペ プ チ ド 1 分 子 － 水 1 分 子 （2118.36 － 18.00）で あ り 、増 加 後 の 分 子 量 は 52693.89 と 予 想 さ れ た 。結 果 は 、52693.76で あ り （Fig.2-11）、 予 測 通 り 、IgG-BP が 重 鎖 1 分 子 に 対 し 対 し 、1 価 で 修 飾 さ れ て い る こ と が 明 ら か と な っ た 。 ま た 、 軽 鎖 の 分 子 量 に 変 化 は な く 、 修 飾 が 重 鎖
31 特 異 的 で あ る こ と を 確 認 で き た 。
ペ プ チ ド マ ッ ピ ン グ 分 析 に 際 し 、ト リ プ シ ン 消 化 に よ っ て 生 じ る Trastuzumab の ペ プ チ ド 断 片 を 下 記 表 に 示 し た（Table 2-3）。 ま た 、Lys248を 含 む IgG-BP 修 飾 前 の 配 列 を と IgG-BP が 修 飾 さ れ た こ と に よ っ て 生 じ る ペ プ チ ド 断 片 の 構 造
（Fig.2-12） と 予 想 分 子 量 を 示 し た （Fig.2-13）。IgG-BP が 修 飾 さ れ た ア ミ ノ 酸 残 基 が Lys248 で あ る こ と を 特 定 す る た め に 、 還 元 後 、 ヨ ー ド ア セ ト ア ミ ド で Cys 残 基 を 修 飾 し 、 ト リ プ シ ン 消 化 し た サ ン プ ル を 用 い て ESI-MS で 分 析 と ペ プ チ ド マ ッ ピ ン グ に よ る 解 析 を 行 っ た （Fig.2-14）。 結 果 と し て Trastuzumab 分 析 時 に 特 有 の ピ ー ク X と Trastuzumab-IgG-BP 分 析 時 特 有 の ピ ー ク Y を 確 認 す る 事 が で き た 。ま た 、ピ ー ク X（2844.46）の 分 子 量 が T20（2845.38）、ピ ー ク Y（5873.83）の 分 子 量 が T20-21-IgG-BP（5876.81）と 同 様 で あ る こ と を 確 認 す る こ と が で き た（Table 2-4）。こ の 結 果 よ り 、結 晶 構 造 解 析 か ら 予 測 さ れ て い た よ う に CCAP 法 に よ る ペ プ チ ド 修 飾 が Lys248 特 異 的 で あ る こ と が 示 さ れ た 。 ま た 、 実 際 に IgG-BP を 修 飾 し た サ ン プ ル を 用 い た 結 晶 構 造 解 析 に よ っ て も 修 飾 位 置 が Lys248で あ る こ と が 確 認 さ れ て い る （Fig.2-15）。
Fig.2-8 修 飾 に 用 い た IgG-BP（ 分 子 内 S-S 結 合 は 酸 化 状 態 ）
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Fig.2-9 A) Trastuzumabな ら び に IgG-BP で 修 飾 さ れ た Trastuzumab の MassPREP micro desalting column (2.1 × 5 mm, Waters)分 離 時 の TIC(Total ion chromatograms) B) MS spectra C) デ コ ン ボ リ ュ ー シ ョ ン 後 の MS ス ペ ク ト ル
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Fig.2-10 修 飾 に 用 い た IgG-BP（ 分 子 内 S-S結 合 は 還 元 状 態 ）
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Fig.2-11 A) 還 元 さ れ た Trastuzumab な ら び に IgG-BP で 修 飾 さ れ た Trastuzumab の MassPREP micro desalting column (2.1 × 5 mm, Waters)分 離 時 の TIC(Total ion chromatograms) B) 重 鎖 の MS spectra C) デ コ ン ボ リ ュ ー シ ョ ン 後 の 重 鎖 MS ス ペ ク ト ル D) 軽 鎖 の MS spectra E) デ コ ン ボ リ ュ ー シ ョ ン 後 の 軽 鎖 MS ス ペ ク ト ル
