剰 一一 二 閂 一馘 一 一 凶 島 一中 一一図 一一一一一一一一一 一一蟷 一 ３一０ ０ 一一一一一勧 一 〇 Ｄ 亦廿 鍵 10,1里 漿恣 個体発生 形態形成 システムの制御 に基 づ く 難治癌予防 治療法の確立 中村 雅史 久保 真 中島 洋 野村 政壽 * 黒木 祥司*

10,1里 01111

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３ 一０ 〓 ０ ■ 一一一一一勧 ■ 一〇 〓 Ｄ

個体発生・形態形成システムの制御 に基づ く

難治癌予防・治療法の確立

中村 雅史、久保

真、中島

洋、野村 政壽

*、

黒木 祥司

**、

_{田中 雅夫}

**、

_{片野 光男}

九州大学腫瘍制御学、*同病態制御内科、料 同臨床・腫瘍外科

1.は

じめ に 発癌 と組織修復 。再生過程の類似性が、癌治療 お よび再生医療の副作用 とい う面か らも注 目をあ つめて きつつある。 ところで、組織修復・再生過 程 で は、発生 に関わる多 くの情報伝達系 が再活 性化 される。L Walpertは、 この ような発生 に関 わる情報伝達系 の内、

3次元軸 の もととなる位

置情報 をもた らす分泌系情報系 の存在 を予言 し、 その分泌物質をモルフォゲ ンと呼んだ1)。 以前 よ り我 々は、現在明 らかにされているモルフォゲ ン

3種

(Hh,Wnt,BMP)の

内

2種

にあた るWnt、 お よび

BMPと

ス ーパ ー フ ァ ミリー を形成 す る TGF‐_β,Activinに よる、形態形成・発癌 ・癌の進 展 に関す る役割 を明 らかに して きた。今回、第3 のモ ル フ ォゲ ン

Hedgehog(Hh)が

乳癌 で果 た す働 きを明 らかにし、治療標的 としての可能性 を 探索 した。 以前 よ り、

Hhシ

グナルは発生学の分野で胎生 期の形態形成 に必須の分泌型 シグナルであること が明 らか にされていた。 リガ ン ドである

Hh蛋

白 は、膜蛋 白

Patchedl(Ptchl)に

結合す ることで Ptchlが示す シグナルに対す る抑制効果 を阻害 し、 結果的 に膜蛋 白

Sm00thened(Smo)が

活性化 さ れ る。活性型

SmOは

転写 因子Gli3の核 内移行 を 促 し転 写 因子

Gllが

発 現 す る。Glilは下流 の標 的遺伝子 を転写す ることで、

Hhシ

グナルの様 々 な機能が あ らわ される13)。 この ように、Gllは

Hhシ

グナルの最終転写因子 であるとともに標 的 遺伝子で もあ り、シグナル活性化のよい指標であ る4,5)。 近 年 、

Hhシ

グナル の恒 常 的 な活性 化 と発癌 の 関連 性 が指摘 され て きて い る6,7)。

Hhシ

グナ ル の構 成 因子 であ るPtchlや

Smoの

変異 に伴 う活 性化 は、脳、皮膚お よび筋 肉由来の腫瘍の一部 に 認め られ る8,9)。 ところで、最近

Hhリ

ガ ン ドで あ る

Sonic Hedgehog(Shh)の

過剰発 現 に依存 す るシグナルの恒常的な活性化が小細胞肺癌、お よび食道、胃、膵 といった消化器癌で報告 された。 この ように

Hhシ

グナルは多部位の癌で活性化 し ているため、癌 の よい治療標的 として想定で きる。 現時点では、ユ リ科植物の根 よ り精製 されたアル カロイ ドであ るシクロパ ミンが

Smoの

阻害剤 と して知 られてお りЮ'lD、 _{上記腫瘍 由来の細胞株 の} 増殖抑制作用 が証明 されている12,1の。

Hhシ

グナルは、乳腺 の発達 に も重要 であるこ とが報告 されて きたИ'151。 _{Ptchlや Gli2を欠失 し} たマ ウスでは乳管の形態形成 に障害が発生 し、 ヒ ト乳管の過形成 に似た乳管異形成等が認め られる ようになる161。 また、少数の乳癌細胞株 で これ ら の遺伝子異常が発見 されている°。以上の ように、

Hhシ

グナルは乳腺 における発癌過程 に何 らかの 関係 を持つ と思われるが、その詳細 は明 らかにな っていなかった。今 回我 々は、九州大学第一外科 における乳癌切 除標本 を用 いて、

Hhシ

グナルが 大部分 の乳癌組織 で恒常 的 に活性化 されてい る ことを証明 した。 また、

Hhシ

グナルの活′性化が 乳癌細胞の増殖 に必要であ り、 シクロパ ミンによ り細胞増殖が抑制 され ることを証明 し、

Hhシ

グ ″アリl″レυθs ttλ II No.1 2りり5

鸞

椰

当

:計

「薫

りⅢⅢ

: 01111111111111111‐￨￨: ナルが乳癌の有効 な治療標的である可能性 を示 し た。 この報告 はCancer Res.64(17):6071‐ 4,2004 よ り改編 した ものである。

2.材

料 と方 法 臨床検体 2002年か ら2003年に、九州大学病院 臨床・腫 瘍外科 にて原発性乳癌 の切 除術 を受 けた患者52名 を対象 とした。全症例が術前 に説明を受け同意 し た上で、本研究 に登録 された。手術摘 出標本 は10

%ホ

ルマ リンで固定、パ ラフイン包埋 された後、 組織病理学的に解析 され、

TNM分

類 に従い分類 された。組織病理学的解析 によ り、標本47例の う ち46例が浸潤性乳管癌、

5例

が非浸潤性乳管癌、 1例が浸潤性小葉癌であった。 免疫組織染色 抗体検 出法 は以前報告 されてい る方法 に沿 っ て行われた181。 ここでは、以下の改変 プロ トコー ルに従 った。内因性ペルオキシダーゼ活性 は、

3

%H202 メ

タノールを用い室温で30分 問処理 し不 活性化 した。抗原賦活化 は0.01 mo1/Lク エ ン酸ナ トリウム溶液 (pH6.0)を用いて

5分

間煮沸 し行 った。

1次

抗体 はすべ て

4度

で一昼夜反応 させ た。

1次

抗体 は以下 の ものが使用 された。Sonic hedgehog(Shh)(N‐19,sc…1194)、 Ptchl(H-267, sG9016)、 Glil(N‐16,so6153)(す べ て250倍 希釈 にて使用。Santa Cruz Biotechnologyp Santa Cruz,

CA)。

2次

抗 体 (Shh、 Glilに対 して は抗 ヤ ギ

IgGポ

リクローナル抗体。Ptchlに対 しては抗 ウ サギ

IgGポ

リクローナル抗体。ニチ レイ、東京) は室温 で

1時

間反応 させ た。 目的蛋 白の存在 は

DABを

用 いて茶褐色 に発色 させ ることで同定 し た。 また、核 を同定するためにヘマ トキシリンに て軽 く染色 した。それぞれの切片 において、癌細 胞 お よび周 囲の正常乳腺上皮細胞 を各 々100個観 察 した。 これ らの細胞の うち、

50%以

上が染色 さ れている場合 を陽性 と判定 した。 また、Glilによ り核が染色 された癌細胞の全癌細胞 に対する割合 22レ '￨:,=壺藤 を Glilの 核染色率 として表 した。 細胞株 の免疫 染 色

4種

類 の ヒ ト乳 癌 細 胞 株 (BT¨474,SK―BR-3, MDA―MB231,MCF‐7)とヒ ト大腸癌細胞株(DLD…1) は、

10%ウ

シ胎児 血清 (FBS;Sigma Chemical,St。

Louis,MO)を

含 む

RPMIを

培 養 液 と し、培 養 フ ラス コ内で単層培 養 した。 これ らの細胞 を、8穴

の培 養 ス ライ ド (BIOCOAT① ,Becton Dickinson,

San JOSe,CAlを 用 いて

2-4×

105個

/穴

の細胞 密 度 で37度

4時

間培養 した。 その後 、 ス ライ ドを ドライ アで乾燥 し、100%メ タノー ルで

-30度

5 分 問処 理 し、以 降 は免疫組織 染色 に準 じた。 ウェス タ ン ブロ ッテ ィング法 ウェス タンブ ロ ッテ イ ング法 は、以前報告 され て い る方法 に沿 っ て行 われたl① 。培 養細胞 を62.5 mmo1/L Tris― HCl(pH 6.8)、

100 mm01/LD冨

、

2%SDS、 10%グ

リセ ロー ルか らな る bufferに て処理 し、蛋 白成 分 をニ トロセル ロース膜 に移 し た。 移 した 蛋 白 は抗 Glil抗 体 (N‐16,so6153)、 つ いで ホース ラデ イシユ・ペ ルオキ シダーゼ標識 抗 ヤ ギ抗 体

(KPL,Gaithersburg,MD)と

反 応 さ せ 、Molecular lmager Ⅸ (Bio‐Rad Laboratones,

Hercules,CA)を

用 いて確認 した。 増 殖活性測定法 シ ク ロパ ミン と トマ チ ジ ンは、 そ れ ぞ れ トロ ン ト・ リサ ー チ 。ケ ミカル社 (North York,ON,

Canada)と

シ グマ・ ケ ミカル社 よ り購 入 した。 これ らの試 薬 は、100%メ タノー ル に溶解 させ濃 度 を調 整 した。細 胞増殖 活性 に対 す る シクロパ ミ ンの影響 を調べ るため に、 ヒ ト乳癌 細胞 は シクロ パ ミンを含 む培 養 液で4日間培 養 した。対 照 とし て、トマチ ジ ンお よびメ タノー ル を用 い た。細胞 増殖活性 は

MTrを

用 いて測 定 した。 統 計解 析 統 計 学 的解 析 はすべ て

SAS統

計 ソ フ トを用 い 7θ ″′助 υθs 乃′.II 助.1 2005

約1% 寺￨^￨で■￨ 雨IMIlrl l・・1痙￨ザ ￨■●11・ て行 った。

3.結

果 (1)乳癌組織 にお ける

Hhシ

グナルの恒常的 な活 性化 手術摘 出乳癌のパ ラフイン包埋組織切片 を用い て、

Hhシ

グナルの構 成 因子 であ るShh、 Ptchl お よびGlilの免疫染色 を行 った。全52症例の うち 47例が浸潤癌、

5例

が非浸潤癌であった。 これ ら 52例_{の切除標本には、いずれ も癌組織 の周辺部に} 隣接 して正常乳腺上皮の一部が認め られた。52症 例 の癌 組織 の うち、

Shhは

52例、Ptchlは 50例、 Glilは52例に強発現 を認 めた (図 1、 下段)。 こ れに対 し、周 囲の正常乳腺 上皮 では これ らの蛋 白発現 は認め られなかった (図 1、 上段)。 Ptchl とGllは

Hhシ

グナルの構成因子であるとともに 標的遺伝子で もあるため、両者が多 くの乳癌組織 内で強発現 しているとい う結果 は、乳癌 で

Hhシ

グナルが一般的に活性化 していることを示 してい る。 Glilは

転写因子としてのみ働き

Gli2,3で

のよう

な repressor機 能 を持 たない4)。 また、マ ウスで はGlilを表皮 に過剰発現 させ ると基底細胞癌 を誘 導 しうる ことが報告 されている2の 。以上の ことよ り、Glilの核染色率 は

Hhシ

グナルの直接 的な指 標 になる と考察 し、全癌細胞 に対す るGlilの核染 色 を示す癌細胞の割合 (Glilの核染色率

%)を

更 に調べ た。Glilの核染色 を示す腫瘍細胞 は52症例 のすべての標本中で認め られたが、周辺の正常乳 腺組織 には染色 される乳管上皮 は存在 しなかった (図 1)。 Glilの核 染色率 の分布 は 2-95%、 平均 は40。

87%で

あった。次 に、Glil核染色率 と病理組 織学的所見 との関係 を検討 した。Glilの核染色率 は、Estrogen receptorの 発 現 との 間 に正 の相 関 を認めた。 これは、乳癌のホルモ ン依存性発育に

Hhシ

グナルが関与 している とい う以前 なされた 報告 と一致す る結果である2め 。 また、組織型別で は浸潤型 に有為 に高いことが明 らかになった。

(2)Hhシ

グナル抑制 による乳癌細胞増殖阻害

4種

の ヒ ト乳癌細胞株 (M‐474,SK―BR-3,MDA―

MB231,MCF-7)を

用 い て、

Hhシ

グナルの制御 Gl11 Normal C瞭義駐鼎 図

1

ヒ ト乳癌組織におけるHhシグナルの活性化 52症例の ヒ ト乳癌組織標本 は、Shh、 Ptch]、 GII]それぞれの蛋 白に対する抗体 を用いて免疫組織染色さ れた (茶褐色)。 核染色 にはヘマ トキ シ リンを用いた (紫色)。 平L癌組織で は、Shh、 Ptchl、 GII]いずれ も強発現 している (下段)のに対 し、周囲の正常乳腺組織での発現は認め られなか つた (上段)。 さ ら に、癌細胞では強い核染色を示 した (矢印)。 図は代表例である (倍率400倍)。 Barは10μ

mを

示す。 Cancer Res 64(17):6071-4,2004よ り改編 ″ア′″Zυθs Иフム

II助

.I」Zη

5 77

による乳癌の増殖抑制効果 を検討 した。

4種

の ヒ ト乳癌細胞株すべてにおいて、免疫染色上Shh、 Ptchl、 Glilの発現増強 を認めた。 また、

Hhシ

グ ナルが活性化 してい ない大腸癌細胞株DLD… 1で は2)いず れ も陰性 であ った (図 2)。

Hhシ

グナ ル活性化 の指標 となるGlilの核染色像 は、MDA‐

MB231を

除 く他 の

3種

の乳癌細胞株 で強 く認 め られた。 また、MDA―

MB231の

Gll核染色性 は弱 いが、negative controlと なるDLD…1と の比較 で は明 らかに染色 されてお り、

Hhシ

グナルの活性 化が存在す ることが示唆 された。 これ らの乳癌細胞株 を

Hhシ

グナルの阻害剤 で あるシクロパ ミンとともに培養す る と、MCF-7を 除 く乳癌細胞株 で有意な細胞増殖の抑制が見 られ た (図 3A)。 シクロパ ミンとは明 らかに異 な り、 非活性型のシクロパ ミンアナログである トマチジ ンでは、癌細胞の増殖抑制は認め られなかった。 シ クロパ ミン存 在 下 で はBT¨474お よびSK―BR-3 のGlilの細胞質発現 と核染色性 は減少 してお り、 シ クロパ ミンは、増殖 阻害 を示 した癌細胞株の

Hhシ

グナルを不活性化 していた ことを確認で き た (図3B)。 シクロパ ミンによる

Hhシ

グナルの 不活性化 は、 ウェス タンプロッテ ィング法 により 再確認 された (図3C)。 この ように、BT‐474およびSK―BR-3で はシクロ パ ミンにより核 内のGlil蛋白量が減弱 し増殖抑制 BT-474 SK‐BR‐3 1圧E"亀』配日B231

MCr-7

DD-1

図

2

ヒ ト乳癌細胞株 におけるHhシグナルの活性化 ヒ ト乳癌細胞株BT-474、 SK― BR-3、 MDA―MB231、 MCF-7とヒ ト大腸癌細胞株DLD-1を、Shh、 Ptch]、 GI11それぞれの蛋 白に対する抗体 を用 い て免疫組織染色 した (茶褐色)。 核染色 には ヘ マ トキ シ リンを用 いた (紫色)。 乳癌細胞 株 で は、Shh、 Ptchl、 GI11いずれも強発現 して いるの に対 し、DLD-1での発現は認め られなか つた (倍率400倍)。 Barは10μ

mを

示す。 Cancer Res 64(17):6071-4,2004よ り改編

SHh

Rdhl

Cl11

ヲ

讚

・Ｍ

Ａ

瞼

れ

Й″I″aυθs 乃 洗II S、.1 2θθ5

響謗

欝砧;

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●

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∫

∫

Ｌ

ざ

∫

∫

ぎ

臓 け474

∫ ∫

SK‐BR‐

3

図

3 A:シ

クロパミンによる乳癌細胞の増殖抑制

B手474、 SK―BR-3、 MDA―MB231、 MCF-7、 DLD-1の各 細 胞 株 を10μmovLの トマ チ ジ ン あ る い は10μmoνLのシ ク ロ

パミンとともに37度 で4日間培養 した。細胞の増殖活性 は、Ml「法を用いて570nmにおける吸光度 を測定 し(A5Юnmヽ

trlp面cate)、 メタノーリレ単独の コン ト□一ル培養液を用いた場合の細胞増殖活性を100とした割合 ± 標準偏差 (%)

で表 した。同様の実験 を3回繰 り返 し、代表データを示す。

*￨まP<0.01、

**は

P<0001を示す。

B:シクロパミンはBT-474と SK―BR-3の GI11の発現 を抑制する (免疫染色)

B千474、 SK― BR…3、 MDA―MB231、 MCF-7と DLD-1は、10μmovLのトマ チ ジ ンあ る い は10μmoVLのシ クロ パ ミ ン

ととも に37度 で24時 間培養 した。その後、細胞 は抗Gli]抗体 を用 いて免疫染色 (B)とウェスタンブロ ッテ イング (C)を行 つた。核染色 にはヘ マ トキ シ リンを用いた (紫 色)。 B手474とSK―BR-3は トマチジン処理

(B

上段)に比 べ、シクロパ ミン処理

(B

下段)でGI11の発 現が抑制 された。MCF-7と DLD-1では、シクロパミン処 理の有無 に よる差 は認め られなか つた (倍率400倍)。 Barは10μ

mを

示す。

C:シ

クロパミンはB手474と SK―BR-3の GI11の発現を抑制する (ウェスタ ンブロ ッテ イング) ウェスタンブロ ッテ イングでも免疫染色 とほぼ同様の結果であ つた。 Cancer Res 64(17):6071-412004よ り改編 が認め られることが明 らかになった。 ところで、 同濃 度

(10,M)の

シクロパ ミンは、染色 上Glil が過剰発 現 し核 内染色性 も高 いMCF‐ 7に対 して は、Glilシ グナルの減弱や増殖抑制 を引 き起 こさ なかった。 しか しなが ら、

20-100,Mの

範囲で シ クロパ ミンは濃度依存性 に MCF‐7の増殖 と核染

色 を抑制 してお り (data not showll)、

MCF-7に

お

lJID盪ヽ 「1口[ヨロE諄二

MCユ

サ E‖ED卜二 いて も

Hhシ

グナルが細胞増殖 に寄与 しているこ とが示唆 された。以上の結果 は、

Hhシ

グナルが 乳癌治療の標的 となる可能性 を示 した。

4.考

察

Hhシ

グナルは様 々な癌種 で活性化 しているこ とが報告 されているが6,7)、 ヒ ト癌組織標本 を用 7'I″♭υ′s 乃 ′.II ハb.1 2θ り5

iO雪拒 `矛 華￨￨￨デ

鱚莉

ITll鵞

是

儡

mlT辟

Ｏ ｉ いて

Hhシ

グナルの活性化 を示 した報告 はほ とん どない。我 々の知 る限 りでは、比較的多 くの組織 標本で

Hhシ

グナルの恒常的な活性化が報告 され ているのは、膵癌1の と胃癌21)におい てのみであ る。 我 々は、手術摘 出乳癌組織52例を用いて、乳癌 において

Hhシ

グナルが恒常的に活性化 している ことをは じめて明 らかに した。 また、

Hhシ

グナ ルが乳癌の新 しい治療標的のひとつの候補である 可能性 も示 した (図3)。 乳癌組織 内では標的遺伝子であるPtchlと Glil が2例_{を除 きともに高発現 してお り、 これ らの結} 果は乳癌 における

Hhシ

グナルの活性化 を示唆 し ている。 ところで、Ptchlを発現 していなか った

2例

の組織型はいずれ も浸潤癌であ り、

Shh染

色 強度 はPtchlの強発現 を認めた他の50例に くらべ 弱 い ものであるが、 この ような違いはGlil発現で

は明 らかではなかった (data nOt showll)。

RttI遺

伝 子 とG′′I遺伝 子 は

Hhシ

グナルの標 的遺伝子であるが、勤力遺伝子 は標的遺伝子では ない14)。

RttI遺

伝子 の変異 は ヒ ト乳癌 で報告 されてお り、 これ らPtchlを発現 していなかった

2例

は

RttI遺

伝子 に変異があ り、 この研究で使 用 されている抗体が変異 Ptchl蛋 白を認識で きな かった可能性がある。 この場合、高濃度の

Hhリ

ガン ド(Shh)がシグナルの活性化 に必要でな く、 弱 い

Shhの

染色性 も説明で きる。 いずれの場合 で も、最終転写因子 として

Hhシ

グナル活性化の 指標 となるGlilの発現 が全乳癌症例 に認め られ ることよ り1'4,5)、 乳癌 にお ける恒常 的な

Hhシ

グナルの活性化 は一般的な現象である と考 えられ る。 癌細胞 における

Hhシ

グナル活性化 には主 にふ たつの機序が提案 されている。 ひ とつ は

Hhリ

ガ ン ド依存性機序であ り、

Shhの

ような

Hhリ

ガ ン ドがPtchlに結合す るこ とでPtchlの機能 を抑制 して

Smoを

活性化 し、その結果

Hhシ

グナルが 活性化 され る とい う機序 であ る。 もうひ とつ は

Hhリ

_{ガ ン ド非依存性機序であ り、 リガン ド以下} の因子 をコー ドす る遺伝子の変異 に由来 してお り、上 述 の よ うにPtchl遺伝 子 や

SmO遺

伝 子の 変異が この タイプの

Hhシ

グナル活性化機序 とし て存在することが報告 されている。 シクロパ ミン は

Smoと

の直接 的 な関与 を通 じて

Hhシ

グナル を阻害するので11'°、 リガン ド依存性 お よび非依 存性 の

Hhシ

グナル活性化 を阻害で きると考えら れてい る。本研 究で も、 シクロパ ミンは

Hhシ

グ ナルが活性化 している乳癌細胞株の増殖 を容量お よび時間依存性 に抑制 したが (data nOt shown)、

MCF-7に

関 して は、染色上

Hhシ

グナルが活性化 しているにも関わ らず他の乳癌細胞 よ りもシクロ パ ミンに耐性 であった。その理 由 として、ABC トランスポー ター等の多剤耐性遺伝子産物の影響 も想定 されるが、最近、

Shhに

対するモノクロー ナル抗体が

MCP7の

増殖 を抑制 で きなか ったこ とが報告 されてお り20、

_shhの

下流 に存在す る因 子の変異が存在す る可能性 も考 え られる。 結論 として、

Hhシ

グナルは多 くの乳癌 で恒常 的に活性化 してお り、乳癌 における強力な治療標 的 とな りうる と考 え られ る。今後 は、様 々な レ ベルでの

Hhシ

グナルの制御法 を開発 し、 また、

Hhシ

グナル抑制が標的臓器以外 に与 える影響 を 検証 してい く必要があると思われる2り 。 謝辞 野見 山 香、寅 田 信博、真鍋 深雪 各氏 に多大 な協力 を提供 していただいた こ とを深 く感謝す る。 参考文献

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