香川大学農学部学術報告 弟■35巻 第1号 27∼32，1983
動∫αr∠α∽Sp．M7−1薗株の生産するα，β不飽和
芳香族アルコール酸化酵素の諸性質について岩 原 章二郎，木 下 典 和＊
PROPERTIES OFα，β−UNSATURATED AROMATIC ALCOIIOL
OXIDASE PRODUCED BY FUSARZUMSP．M7・−1
ShojiroIwAHARA and NorikazuKINOSfIITA＊
α，β−Unsaturated aromatic a】coholoxidase produced byFusarium sp．，M7−1was separatedinto
l
three fractions（Fr”−・Ⅰ∼Fr”−・ⅠⅠⅠ）by DEAE−Cellulose column chromatograPhy．．Fr。−Iand Fr…−・ⅠIwere further purified by’gelfiltrations on SephadexG−100，G−150 and G−・200，and Sepharose 2BいBoth the Fr．．・一・Iand Frり・−ⅠIcontained about5−fold amount of polysaccharide for protein．From the be− havior ofthe enzyme preparations on gelfiltration and polyacrylamide ge】electrophoresis，it was
assumedthatthe enzyme preparations consisted ofseveralg】ycoproteins
Fusarium sp∴M7・−1菌株が生産するα，β不飽和7ルコl−Iル酸化酵素をDEAE−Cel】uloseカラムクロ・マトグラ フイ・−・に・より3成分（Fr．−Ⅰ∼Fr…・−ⅠⅠⅠ）に分画し，そのうちのFr．−・ⅠおよびFr，．一・ⅠⅠをさらにゲルろ過に．より部分 精製してそれらの諸性質について検討した。いずれの酵素成分もタソ′くク貿の約5倍魔の多糖を含有していた。これ らの成分の電気泳動ならびにゲルろ過における挙動から本酵素は多種炉の分子種から成る糖タンパク質であろうと推 定した。 緒 著者らほ前報（1〉に・おいて助sαγ宜≠仇Sp∴M7−1菌株の生産するα，β不飽和芳香族アルコ−リレ酸化酵素ほイオソ 交換カラムクロマトグラフイ・一粒より3種㌣こ分画されることを明らかにし，そ∵れらの2，3の性質について−報告した。 これらの酵素化学的諸性質を明らかに・す−る目的で酵素の精製を進めている途上において本酵素が−・般の酵素タンパク 賀とは異なりきわめて複雑な性状を示すことが明らかとなった。その原因ほ酵素標品中に含まれている多糖の性状に 由来するものであると推定されるに．至ったのでそれらの結果について報告する。 葉陰材料および方法 1… 使用菌株および培養方法 ダ％βαγ壱髄彿Sp∴M7−1菌株を用い前報（2）の方法に従って菌の培養を行った。 2．酵素の精製ならびに分析 DEAE−Cellulose，DEAE−Sephadex A50に・よるイオン交換クロマトグデ7イ1・・・・・，SephadexG−PlOO，G・−200， Sepharose2Bに・よるゲルろ過などKlより酵素の精製ならびに分析を行った。 ＊現在：玉藻中学校
香川大学農学部学術報告 第35巻 第1号（1988） 28 3り 酵素活性の測定 酵素活性の測定ほ基質としてコニフェリ・−・ルアルコt−ルを用い前報（1）の方法に従って行った。 4．タンパク質および糖の定量 牛血アルプミソを標準タンパク質として用いLowIy法（る）および280nmにおける吸光度を測定する方法に・より タンパク賀の定盈を行った。糖の定量ほフェノ−・ル硫酸法（4）に．より行った。標準物質として：グルコ・−スを用いた。 5‖ ニポリアクリルアミドゲル電気泳動 ポリアクリルアミドゲル電気泳動ほ．ミツミ科学機器スラブ・デスク電気泳動装置SJ・−・1060・−SDH型を用いて行っ た。10％SDS−ポリアクリルアミドゲル厚さ2mmのプL／lq・ト（10cmxlOcm）を用い，pI‡91r5で，定電流40mA で室温に．おいて2時間泳動を行った。タン／くク質の染色はコマ・−ジブルを用いて行った。 実験結果および考察 1，′ 酵素の分離・精製 Fusarium sp∴M7−・1菌株の培養液約301を前報（1）の方法に／従ってDEAE−Celiuioseカラムタロマトグラフイ −・に．より3種の酵素活性区分（F工十・Ⅰ，Fr・−ⅠⅠおよびFご．−ⅠⅠⅠ）を得た。このうちFr・・−ⅠⅠⅠほ酵素活性が微弱であり しかも不安定であったため，本研究においてほFr．．−ⅠおよびFご．．−ⅠⅠについてさらに精製を進めその諸性質につい て検討した。まず，Fr”−ⅠおよびFr．−ⅠⅠをそれぞれSephadexG・−200でゲルろ過を行ったところ酵素活性はVo 付近に．溶出した。活性区分をコロジオンバッグで濃縮後Sepharose2Bでゲルろ過を行ったところFig・1軋示す ように2成分（Frぴ−ト1，Fr〝一ト2）に分かれて溶出した。F工・小一ⅠⅠの場合も同様の溶出′くタ・−・ソを示した。このうち の主成分Fr小・−Ⅰ−・2およびFr．−Ⅰト2をSepharose2Bに より再クロマトグラフイ・−・を行いそれぞれ単一ゼ・−クとし て得て実験に供した。 2．酵素標品の電気泳動における挙動 以上のゲルろ過の結果からこれらの酵素タソ／くク質の分 子量ほ非常に大きいものと推定される。・そ・こで本酵素の分 ︵一∈＼s苫−n∈︶台Atぢ再む∈hN︻ぷ 盲u冨N︶再．qO︶≡gO占 子盈ならびに純 度を知る目的で SDSポリ アク リルアミドゲル 電気泳動を行っ た。その結果， Fig■．2に．示すよ うに．ゲルろ過に・ おける溶出位置 1 2 3 4 5 芝○℡ 330，000 220，000 94，000 67，000 60，000 43，000 36，000 くつ くニ：フ くこ二⊃ ⊂ニ．つ き ぐニ† ミニン ■ ⊂ニ♪ ● ■■■ − − Fractionnumber（10ml／tube） Fig。1“GelfiltrationofFr；−IonSephar・OSe2B．． Sepharose 2B was equi】ibrated with O．01M phosphate buffer，pH6。0，and
PaCkedin a column（2．6×49cm）”The
enzyme solution（Frり−・Ⅰ），COntaining5．，2
units or55。9mgprOtien was poured
over the column which was eluted
with the same buffer at a flow rateOf 20ml／hr．Fraetions 6−10（Fr．・一手−1） andll−27（Fr．・−I−2）were combined re−
SpeCtively．
−：enZyme aCtivity，”…−‥prOtein 書 くこ〉 亡コ くニニ） mg・2．．SDS−pOlyaery】amide gel からほ考えられ electrophoresisofenzyme ないような低分 preparations・ 子畳域（分子量 1：Standardproteins， 約4万）∼高分 2：F工。−・ⅠⅠ一2， 3：Fr．一Ⅰト2−1， 子畳域（分子量 4：Fr．−Ⅰト2−・2・−1， 30万以上）にわ 5：Fr．−・Ⅰト2−2−・2． たる多数のタン岩原章二郎，木下典和：α，β不飽和芳香族アルコ−ル酸化酵素 29 バク貿成分から成っていることが明らかとなった。このよ うな現象は一・般の酵素タン／くク賀のゲルろ過による精製標 品では認められないことであり，こ．れは本酵素の特異な性 状に．よるもの■ではないかと考えられる。 3い 酵素標晶中の糖成分 本酵素標晶が上記のような複雑な挙動を示すのはタンパ ク質以外の物質が関与して：いる可能性が考えられる。そこ で，本酵素標品中の糖含量を測定した結果Tablelに示 すように．，本酵素標品中に．はタン′くク質の約5倍量の糖が 含まれているこ．とが明らかとなった。糖の種類などの詳細 ほ明らかでないが定性分析の結果からアルドへキソ・−スを 主成分とするアミノ糖を含む多糖であると推定される。糖 の組成などについては現在検討中である。
Tablelい Sugar contentin the enzyme
preparations
︵∈u冨N嵩．q．〇︶已芯︶○占■首長薫こ再d占︶き巨竜：∈旨占 6 4 0 0 2 0 0 0 ︵−∈＼叫旦一品ns 4 2 0 0 0 0 2 6 1 0 0 0 4 2 0 ︵U O ︵U 10 20 30 40 50 Fractionnumber（10ml／tube）Fig．3．Gelfiltration ofFr．・−・Ⅰト20n Sephadex
G−200．
The enzyme so】ution containing・2．7 mgprOtein and20”1mgSugar，44．1 munits of Fr．rq・IIl−2 was separately
POured over the column（2．6×63
Cm）of Sephadex G・−・200 equilibrated with Oい1M（a），0．01M（b）of phosphate buffer，pH 6．．0，and with deionized
Water reSPeCtively and eluted with
the same soIvents at flow rate of 23 nll／hr．−：enZyme aCtivity，”・””：prOtein，
：Sugar，（a）：elutedwith0。1M phosphate buffer，pH6．．0，（b）：eluted With O．01M phosphatebuffer，pH6い0， （c）：elutedwith deionized water
Fraction Protein Sugar Ratio （mg） （mg）（sug・ar／protein） Fr．．−工 46−．4 216．．0 4い4 Fr．−・ⅠⅠ 29．8 161．6 5．4 4．．ゲルろ過における培およびタンパク質の挙動
本酵素標品中に．存在する糖が単なる混合物としてタンパ
ク貿と相互作用をしているものであるかタンパク質と結合 しているものであるかどうかを明らかにする目的で以下の 実験を行った。Fr・い−Ⅰト・2を0．01M：および0．1M：リソ酸緩 衝液，脱イオ・ソ水でそれぞれ平衡化したSephadexG−・200 でゲルろ過を行いFig■い3に示すような結果を得た。0．．1M 緩衝液でゲルろ過を行った場合に・は，糖，タンパク質およ び酵素活性ともに1㌔付近に・単一ゼ、−クとして溶出され た。0．．01M緩衝液の場合には高分子域で2成分に分かれ て溶出された。ところが，脱イオ■ソ水の場合には糖，タンパク質，酵素活性ともに仇付近から低分子畳域の広範囲に わたって溶出した（Figふ・（c））。高分子盈区分（Fr．−・ⅠⅠ−2−1）を濃縮後再度脱イオン水でゲルろ過を行ったところ坑 付近に単一ゼ・−・クとして溶出され，低分子盈域には糖，タ∵／バク貿，酵素活性ともに．認められなかった。したがって この成分は高分子成分であり解離して低分子化す−ることはないと考えられる。一方，低分子盈区分（Fr．−Ⅰト2−・2）ほ 0．1M緩衝液でゲルろ過を行うとlち付近に・単一ゼ・−・クとして溶出されるが，再度脱イオン水で溶出すると高分子最 区分に．は溶出されず低分子畳区分に溶出された。したがってこの成分は分子量ほあまり大きくないけれども0い1M 緩衝液中では会合して高分子の性質を示すものと推定される。この低分子盈区分を脱イオソ水を用いてSephadex G一・100でゲルろ過を行うとさらに・2成分に分離した。2成分を同一・条件で再クロマトグラフイ・−・を行い中間分子量 区分としてFr。−Ⅰト2−・2−1および低分子盈区分としてm．一Ⅰト2−2・−2を得て実験に．供した。以上のようにして分離し た各成分の糖，タソ′くク質および酵素活性を測定してTab】e2に示す結果を得た。いずれの成分も酵素活性を示す が活性がいちじるしく低下していた。糖含盈は低分子盈区分の方が高く，酵素活性は逆に分子畳の高い区．分の方が高 い値を示した。各成分をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した結果，Fig・．2に示すように高分子畳区分 （Fr＼−1ト2−・1）では分子量30万以上と推定される領域にのみ．タソバク貿成分が認められ，中間分子量区∵分（Fr．−Ⅰト香川大学遵学部学術報告 第35巻 第1号（1988）
Table2… The enzyme activity and sug・ar COntentSin the enzyme preparations
30
Fraction Totalactivity Totalprotein Totalsugar Specific acitivity Ratio
（munits） （mg） （mg） （munits／mgprOtein）（Sugar／pro七ein） 一⊥ 2 ︼ ︻ ﹁⊥ 2 2 ︼ ■ − 2 2 qム ウ︼ ■ ︼ ■ ■ 丁⊥ l I T⊥ T⊥ Ⅰ ： Ⅰ ︼ − ︻ r 4 9 7 0 5 2 0 2 2 ﹁⊥ 5 3 ︵1．〇 9 5 3 4 0 8 6 1 1 7 2 2 9 4 5 8 8 6 4 2 0 6 5 4 7 5 3 6 7 2 3 4 9 2一・2・−1）でほ分子量約20万∼30万の領域に不鮮明なタンパク質のバンドが認められた。低分子盈区分（F工・．．−Ⅰト2一2 −2）に・おいてほ分子盈3万∼15万の領域に．数個のタンパク賀成分が認められた。Fr．−・ト2についても上記と同様の 実験を行った結果ほぼ同様の結果が得られた。以上のゲルろ過ならびに電気泳動の結果から本酵素標品は多種病の分 子種の混合物であると考えられる。このように．多種の分子種を含みゲルろ過において仙・般の酵素では認められないよ うな挙動を示すのほ酵素タンパク質そ・のものの性状に．よるものではなく標品中の糖含急が異状に．高いことから考えて おそらく糖分子の性質に由来するものと推定される。この点を明らかにする目的で次のような実験を行った。Fr‖−Ⅰ −2を加熱（1000C，10分）変性させたのち，Trypsinで5時間，さらに放線菌Proteaseで5時間消化させ透析 して低分子ペプチドを除去した。透析液をSephadex Gld200を用い脱イオ・ソ水でゲルろ過を行った。その結果を
Fig・．．4に示した。この場合ゲルろ過を01M二緩衝液で行うとタンパク質および糖成分は1㌔付近に．単一ゼ・−クとして
溶出された。FigAの低分子鼻区分をSephadexG−100で脱イオン水を用いてゲルろ過を行ったところ，さら私大 きく2成分に分離した（Fig．．5）。このうちの低分子靂区分をSephadexG−200を用いて0．1M緩衝液でゲルろ過 を行うと1ん付近に単一・ピ・−・クとして溶出された。この区分はタン／くク貿分解酵素処理によりタ∵／／くク賀ほかなり除 去されておりタソバク督に対して糖含最ほ約10倍となっているけれどもゲルろ過における挙動は未処理のものと同 様であった。つぎに．，この低分子屋区分をDEAE−SephadexA50でクロマトグラフィーを行うとFigい6K．示すよ うに4成分に分画された。このクロマトグラフイ一に．おいても糖とクソ／くク貿ほ分離されなかった。これらの4成分 看じ宗N︶再d．〇︶utむ︶○よ ︵∈已○∞N嵩．白．〇︶已芯ちJd 0“0 10 20 30 40 50 FI’aCtion number（10mItube） Fig・い5… GelfiltrationofFr．−・IT2−・20nSephadex G−・100． SephadexG−・100wasequilibratedwith deionized waterand packedina co］− umn，2．2em x42em小机十・ト2−2（5．5mg protein，49．6mgSugar）was app］ied OntO the column which was washedwith deionized water at a flow rate Of25ml／hr．
−：prOtein，・・・・・…− ：Sug’ar．
Fr・aCtion number（10mI／tube）
Fig。4．、Gelfiltration of protease treated enzyme on Sephadex G・−200
SephadexG−200wasequilibratedwith deionlzed water and packedin a col−
umn，26cm x65cm．The enzyme so− 1ution（Fr．−Ⅰ−2）was treated succes− SivelywithtrypSin（5hr）and pIOteaSe （5hr）andthetreateden2：ymeSOlution WaS aPplied onto the column which was washed with deionized water at a flow rate of30ml／b】∴ ・…一−・ ：pr・Otein，N：Sugar．
岩原章二郎，木下典和：α，β不飽和芳香族アルコ・−リレ酸化酵素 31
Fraction number（5mltube）
Fig．6．．Ion−eXChange COlumn chromatography of Fr −I1−r2−2−20n DEAE−Sephadex A50
DEAE−Sephadex A50was equi】ibrated with O．01M phoshate buffer，pH6．O and packed in a column，1．5em x9．Oem．Fr．−ト2−2−2（4…2 mg・prOtein，24．7mg・Sug・ar）was poured over
the column and elutedwith a stepwise addi−
tion of various concentration of phosphate
buffer and of NaCl−M：prOtein， ：Sugar．Ⅰ：0い01M phos−
phate buffer（pH6．0），ⅠⅠ：0．．1M phosphate buffer（pH6…0），ⅠⅠⅠ：0．1M NaClin O小1M Phosphate buffer（pH6．0），ⅠⅤ：0．、2MNaC】 in O．1M：phosphate buffer（pH6．0），Ⅴ：0．．4 MNaClin0。1M phosphate buffer（pH6．0）， ⅤⅠ：2M NaClin0。1M phosphate buffer（pH
6uO）． はいずれもSephadexG−・200によるゲルろ過における挙動ほ未処理のものと同様であった。これらの4成分のうち の主成分（Fr．．−C）をSepbadexLH−・20でゲルろ過を行ったとこち駅g．7に．示すように仇付近にタン′くク質と糖 を含む成分が溶出された。この成分の糖含盈はタン／くク質の約15倍でありタソバク質はかなり除去されてこいるもの と考え．られる。この成分をSephadexG−I200を用い0．1M緩衝液でゲルろ過を行うとⅤ○付近に．単一ゼ1−・クとし て溶出された（Fig・．8−・（a））。もちろん脱イオ・ソ水では低分子畳区分に・溶出されてくる。つぎに，この区分に・TIypSin で部分消化した牛血アルブミンを混合してゲルろ過を行ったところ添加したタソバク貿成分は糖を含む成分と完全に 分離された（Fig．8−（b））。したがって糖成分は不特定のタソバク質やペプチドなどを吸着する性質は．もっていないも のと考えられる。 以上述べたように，本酵素標晶は各種のタロマトグラフイ・−・において糖とタン／くク貿は行動をともにすること，タ ソ′くク質分解酵素でタン／くク質を部分的に除去してもクロマトグラフ的性質は変化しないこと，糖成分は不特定のタ ソ′くク貿やペプチドなどを吸着する性質を示さないことなどから本酵素は糖タンパク質であろうと推定される。本酵 素標晶が低分子盈（分子量約4万）∼高分子畳（分子畳30万以上）の広範囲にわたる分子盈分布を示すのはおそらく 活性タンパク質の分子量が異なるためでなく，糖分子の分子量および性状の相違や糖分子へのタソバク質分子の結合 数のらがいなどに．よるものではないかと考えられる。
香川大学農学部学術報告 第35巻 第1号（1983） 32 へ∈UO宍︶再．q．〇︶u一望○よ ︵∈U冨N︶再．qO︶u虻︶○よ ︵l己＼餌∈︶L品コS 10 20 30 40 50 6 4 0 0 い 0 Fraction number（10ml／tube） Fig・．7小 Gelfiltr・ationofFr；−ConSephadex LH血20 SephadexLH”20was equilibrated
with deionized water and packed
in a eol11mn，3．．2em x62em．Fr． −C（0．3mgPrOtein，3．3mg・Sugar）
wasapplied onto the column and
eluted with deionized water at a
fbw rate of37ml／hI・．−：pT・Otein，−−…−−−：Sugar．
Fraction number（10ml／tube）
Fig．8．Effect oftrypsintreatedalbumin onthe gelfiltration ofFr．G−10n
Sephadex G−L200．
SephadexG−200was equilibrated
with Oい1M：phoshate butter（pH 6巾0）and packedina co】umn，2．6 emx69emりF‡・．C−1（0．56mg−prO− tein，6．．51mg・Sugar）with orwith−
out addition of trypsin treated
albumin（5．7mg−prOtein）was ap−
Pliedontothecolumnand eluted
withO．1M：phosphatebuffer（PH 6．0）．− ：prOtein，”・・−” ：Sugar，
（a）：Fr．C−1without addition of trypsin treated albumin，（b）：Fr・． C−1withadditionoftrypsintreat− ed乱1bumin． 引 用 文 献 L．．and p．ANDALL，R．T∴よβわ∼．C九β刑．．193， 265（1951）． （4）安藤鉄郎，寺山宏，西沢一俊，山川民雄編：生化学 研究法Ⅰ，p．．232，朝倉書店 （1983年5月31日受理） （1）岩原章二郎，杉山裕子‥木材誌，29，824（1983）・ （2）IwAHARA，S．，NISHIHIRA，T・，JoMORr，T・，Ku− WAHARA，M．and HIGUCHI，T．：JIFerment． rβ￠丸竹0∼．，58，183（1980）． （3）LowRY，0．H．．，RosENBROUGH，N．F．，FARR，A
