Japanese Physical Therapy Association
NII-Electronic Library Service
Japanese Physioal Therapy Assooiation理学 療 法 学 第
41
巻 第2
号90
〜
91
頁 （2014
年 ） 平成
24
年 度
研究助 成 報 告 書
ヒ
ト間 葉 系 幹 細 胞
の
軟 骨分 化 能
に
お け る
重 力
環
境 変化
の
影
響
中田恭 輔1〕，
上床 裕之 1〕，
大倉
優之介
1），
古
川拓 馬1），
猪村
剛史
1〕，
深 澤賢宏
］），
大鶴 直史
1〕，
弓削
類
D
1〕広 島 大 学 大 学 院 医．
歯薬 保 健 学 研 究 科生体 環 境 適 応 科 学 講 座 要 旨：
【
目的｝
本研 究の 凵的は，
ヒ ト間 葉 系 幹 細 胞の軟 骨 分 化 におい て模 擬 微 小 重 刀 環 境の 与える影 響につ い て検 討 する こ とである。
【
方 法】
培 養 細 胞はヒ ト間 葉 系 幹 細 胞 を用いた。
通 常のIG
重 丿J環 境下 で軟 骨 分 化 誘 導 を 行 う群 （以下，
IG
群 ），
模 擬 微 小 重 力 発 生 装 置 〔3D
−
Clinostat
）によっ て10
βG
環 境 ドで軟 骨分化 誘 導を行 う 群 （以 下，
CL
群 ）の2
群に分け て 軟骨 分 化誘 導を行っ た。
解 析は，
形態学 的解 析と し て アル シ ァ ン ブルー
染色を 行い，
分 子 細 胞 生 物 的解 析と し てReverse
Transcription
−
Polymerase
Chain
Reaction
を行っ た。
【
結 果】
lG
群と比 較 してCL
群で は，
ア ルシアン ブルー
染 色 性が低 く，
軟 骨 基 質 を構 成 する Type U al collagen の遺 伝 子 発 現が低 下 した。 【結 論 】 模 擬 微 小 重 力 環 境に よっ て ヒ ト冏 葉 系 幹 細 胞の 軟 骨 分 化 誘 導 が 抑 制された。
キー
ワー
ド：ヒ ト間 葉 系 幹 細 胞，
軟 骨 分 化，
模 擬 微 小 重 力 環 境 緒 言間葉 系 幹細胞 （
Mesenchymal
Stem
Cell
：以 下，
MSC
）
の軟骨 分 化に おい て
，
物 理 的 圧 刺 激の影 響 が み ら れ る。
これ ま での 静 水 圧 や 回転 培 養 によって圧 刺 激 を加 えた研 究で は，
軟 骨 分 化 が 促 進 さ れるこ とが 報 告 されて い る 02）。 し か し，
MSC
の軟 骨 分 化におい て物 理 的 な負 荷を取 り除い た研 究は ほ と ん ど み ら れない。 その理 由と して，
ln vitro におい て重力とい う通常に 存 在 する刺激 を取 り除 くこと が困難なこ と が挙
げら れ る。
模擬微小 重 力 発 生 装 置
（
3D
−
Clinostat
）は，
直 行二軸の ま わ りに 試料を360e
回 転 さ せ，
電 力ベク トルを 時 間軸で積分する こ と に よりIO
’
3G の環境 をつ く る 装 置3）で あ り，
In
vitro に おい て重 力という負 荷を取 り除 くこ と が で き る と考え ら れ る。
よっ て本 研 究では，
模 擬 微 小 重 力 発生装 置に よっ て 重力負
荷を 取 り除い た 環 境 下 に お けるhMSC
の軟 骨 分 化 能を検 討 するこ とを 目的とした。 材 料 と方 法 L 培 養 細 胞お よ び増殖培養
条 件培 養 細 胞は
，
購入 ヒ ト問 葉 系 幹細 胞（
human
Mesenchymal
Stem Cell：以 下
，
hMSC
） （Lonza
社 製，
スイス）を 用い た。
増 殖 培 地はDulbecco’
s modified Eagle’
s medium （Sigma
社製，
米 国 ）に 10％ fetal bovine serum （
Thermo
Scientific
HyClone
社製
米 国 ），
penicillin（100
unit／m1 ）／streptomycin（
10
μ1
／ ml） （Sigma
社 製 ） を 添 加 した ものを使 用し，
3
日ごと に培
地 交 換 をしながら，
5
％CO2
，
95
％ airt37
℃の条件
下 で培 養 を 行っ た。
2
．
軟 骨細胞へ の分 化 誘 導 ペ レッ ト法 を用い て軟 骨 分 化 誘 導 を21
日 間行っ た。
通 常 重 力環境下 で軟骨分化 誘 導 を行 う 群 （以 下，
1G
群 〉，
模 擬 微 小 重 力 発 生 装 置 （3D
−
Clinostat
）によっ て 10’
3G 環 境下で軟 骨 分 化 誘導
を行 う
群（
以 下，
CL
群 ）の2
群に分け て比 較し た。
軟 骨 分 化 誘 導 培 地は
，
Minimum
Essential
Medium
Eagleに
Penicillin
（
100
unitfml）
IStreptomycin
（10
μレ ml）
，
L
−
Glutamine
（
10
μ レ ml）
，
Dexamethason
（
10
．
7
M
〆1
），
L
−
Ascerbic
acid2
−
phosphate sesquimagnesium salthydrate
（50 μg／ml ）
，
D （＋）Glucose
solution （4
．
5 gA ），
Sodium
pyruvate （10e
ptg
／m］） （いずれもSigma
社 製 ），
ITS＋Premix（10μVml） （BD 社 製
，
米 国），
TGFf33 （10
ng ／ml） （R
＆D
System
社 製，
米 国 ）を添 加し たものを使用し た。
3
．
アルシ アンブルー
染 色 軟 骨 分 化 誘 導0
，
7
，
14，
21 日後のペ レ ッ トを10
％ ホルマ リ ン固 定後 パ ラフ ィ ン包 埋 した。
薄 切 標 本 を作 製し，
アル シァ ンブルー
溶 液 （pll2，
5
）で軟 骨 基 質に含 まれる酸性ム コ多 糖 類 を 青 色 核 を赤 色に染 色し た。一
般 染 色として，
ヘ マ ト キシ リン・
エ オジ ン染 色 を行っ た。
各 標 本は，
多 機 能 顕微 鏡 （BZ−
9000
，
KEYENCE
社 製，
日本 ）で観 察 した 』4
．
Reverse
Transcription
−
PCR
（
以 下，
RT
−
PCR
＞
軟 骨 分 化
誘導
0
，
7
，
14
，
21
目後
にISOGEN
（
ニ ッポ ンジー
ン社 製，
日本 ）を用い て 全RNA
の抽
出を行っ た。
逆 転写 反 応は，
Rever Tra Ace（
TOYOBOLIFE
SCIENCE
社 製，
日本 ）を用い て
行
っ た。
軟
骨分化
マー
カー
とし て，
軟 骨 基 質を構 成 するtypeH
alphal
collagen （以 下，
Type l aDを 用 い た
。
typell
a1 の プ ラ イマー
は，
セ ン ス 5’
−
AAGAACTGGTGGAGCAGCAAGAGC
−
3
’
，
ア ンチセ ン ス5
’
−
TACAAGAAGCAGACCGGCCCTATG
・
3
’
（Sigma
社 製 ） と し た。
内 部標 準 遺伝
子と し てgapdh を用い た。
gapdh の プ ライマー
は，
セ ン ス5
’
−
TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTT
−
3’
，
ア ンチセ ン ス5
’
−
CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC
−
3
’
（Sigma
社 製）
と し た。
PCR
の条 件は．
typeH
al ：95
℃−
30
sec，
，
67
℃−
30scc
．
，
68
℃−
60
sec．
を30
cycles．
gapdh ：95
℃−
30
sec．
，
60
℃−
30sec
，
，
68
℃−
90 sec．
を20 cycles と し た。
結 果 アル シアンブル
ー
染 色における酸性ムコ多糖類の染色 に関し て，
軟 骨 分 化 誘 導0
日後では確 認 されず，
7，
14，
21
目後で は1G
群 とCL
群 と もに確 認 さ れた （図1）。
1G 群 とCL
群 を 比較 すると，
1G
群よ りCL
群の方が酸 性ム コ多 糖 類の染色 性 が 低 かった。
RT
−
PCR
結 果に関 して，
Type ［a1 は軟 骨 分 化誘導
7
日後か ら発 現 が 確 認 さ れ，
軟 骨 分 化 誘導
14
回後
，
21
日後で はIG
群 よりCL
群で発 現が抑 制さ れ た。
考 察模 擬 微 小 重 力環 境に関して
，
骨 芽細 胞 や 筋 芽 細 胞の分 化 が抑 制さ れ た報 告4周 や．
骨 髄 問 質 細 胞の神 経分 化 が 抑 制 さ れ た 報 告6〕がある。
本 研 究におい ても，
模 擬 微 小 重 力 環 境 に おい てアル シ ア ンブルー
の染色 性の低 下，
Type
H
al の遺 伝 子 発 現 抑 制 が 確 認 され た こ と か ら，
模擬微小重 力 環 境で hMSC の軟 骨 分 化 が 抑 制 され た こ と が示さ れ た。
今 後，
模擬 微 小重力 環 境 N工 工一
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ts
t･DayO
Day7
t
6
+"
tk.Slti]iEJ)scij't'･a)kYs\･pg
Day14
Day21
91typell
al
collagen
gapdh
IG
CL
IG
CL
IG
CL
pa
1C:
th
.(
MSC
O.Wc･l･bSMLtinllfii'11
"
tLk
1ab
= fl, Oza[Jjeti･
bdi-ptditfo6t-eft6tL4.,
!
wt
1) Mivanishi K, Trindade
MC.
et al./Dose-
and
dependent
eft'ects of cyclichydrostattic
]]ressure ont-msforming growth
factor-beta3-induced
chondrogenesis
by
adu}thuman
mesenchymal stem cellsinx,itro. Tissue
Eng.
2006:
12(8):2253-2262.
2)
Wu X,LiSIL
et al,: The effect of the microgravitying
cutture system on thechnndrogenic differentiationof
bone
marrew mesenchymal stem cells. Mol Biolechnel.
2e13:
54(2)i
331-336.
3)
Yuge
L,
Kajiume
T,
et at./ Microgravity pntentiatesRT.PCR
stern cell proiiferaLion"'hile sustaining the capability of
differentiation.
Stem
Celis
Dev.2006:15(6}:921-929.
4) Yuge L. Hide I. et al./ Celldifferentiationand p38rL･T,XPK
cascade are
inhibited
in
human ostceblasts culturedin
a
3D-cLinosrat.
In VitroCellDev BiotAnim. 2003:39(1-2)/
89.97.
5) IIirnsaka K, Nika",a T, et al.:
Clinorotation
preventsdifferer]tiationof rat nivoblastic L6 cells ii'iassociation
'
with redueed
NF-kappa
B-signaling.
Biochim
Biophys
Acta.20(]5/l743{1-2}:130-140.
6)
YugeL,
Sasaki
iX,et al./Siniulated
micrograN,it},niaintains the undifferentiat.ed state and enhancas the
neural repair potentialof
