ラットの小腸粘膜における鉄吸収制御機構

(1)

昭和57年12月(1982年) 一1

研究報文

ラットの小腸粘膜における鉄吸収制御機構

説田武,上

出明美,石

田恵子

江頭

亮子,相

間

佳

Study on the Control Mechanism of Iron Absorption

in Rat Intestinal Mucosa.

Takeshi Setsuda, M. D., Akemi Ueda, Keiko Ishida,

Ryoko Egashira and Kei Aima.

1.はじめに Granick1>, Crosby2)らは小腸粘膜のフエリチンに鉄吸収制御機構があることを示唆したが,その詳細については今日なお明らかでない。我々3)'4)r5)は先きに,大量のクエン酸鉄を正常ラットの胃内に投与すると,血清鉄は急上昇するが,持続性がなく,これに少し遅れて十二指腸粘膜のフエリチンー鉄が一過性に著増したことから,この増加は腸からの余分の鉄吸収を阻止するためのシグナルであろう, と考え,報告した。今回は,更にこの点を究明する目的で,正常及び潟血貧血ラットにin situで十二指腸ループを作り,その中へ各種濃度のクエン酸鉄の生食水溶液を注入し, 血清鉄(SI)及び小腸粘膜のフェリチンー鉄(Fr一鉄) とフエリチンーたん白質(Fr一たん白質)を経時的に測定し,又鉄の輸送と関連して小腸粘膜のATPase (ATP分解酵素)とALPase(アルカリ性ホスファターゼ)活性を測定して比較 ,検討した。 II.実験材料及び実験方法実験には体重3009前後のWistar系雄ラットを用い,実験前16時間は絶食させ,水だけを自由に与えた。ラットの尾部先端を切断して濾血(5ml)を行なった後,鉄欠乏飼料6)で5日間飼育したものを潟血貧血京都女子大学栄養学第1研究室(栄養生理学) ラットとした。小腸を幽門から肛門側50cmまでを10 cm毎に区分し,幽門に近い方から順に,十二指腸,小腸1,2,3 及び4とした。ラットを開腹し,十二指腸の両端を糸で結紮して in situで十二指腸ループを作成し,その中へ正常ラットでは,クエン酸第2鉄の3,5及び9mg(鉄0,6, 1.O及び1.8mg)を,又潟血貧血ラットでは,クエン酸第2鉄の15mg(鉄3. O nlg)をそれぞれ注入した。正常ラットでは5,10,20分後に,又潟血貧血ラットでは5,10,20,60,180分後に,それぞれラット 2匹ずつを解剖し,各測定を行なった。 .一.rr一鉄とrr一たん白質の測定:肝t脾の約19,十二指腸及び小腸1,2,3,4の各粘膜をカバーグラスの端で1回軽く掻きとったものをホモジナイズし,各ホモジネートを75℃,10分間熱処理した後,我々3)r4)e7)が先きに報告したCrichtonらの方法に従い, Sephadex G-200でゲル炉過して得たフエリチン分画について, 鉄を日本ロッシュのキットで,又たん白質をLowry法で測定し,それぞれFr一鉄とFr一たん白質と見傲した。なお,Fr一鉄/Fトたん白質(Fe/P)比を求めた。 ATPaseとALPase活性の測定:香川8)らの方法で ATPase活性を測定した。すなわち,十二指腸及び小腸1,2,3,4の粘膜のホモジネートを遠沈して得た上清に,ATP-Na, MgSO4, K-phosphoenolpyruvate, Pyru-vate kinase, Tris-H2SO4 buffer(pH 7.4)をそれぞれ加えて30。C,10分間インキュベートし, ATPaseの

(2)

- 2

ー作用で

ATP

から生じた無機燐を比色定量した。活性を

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で表した。

ALPase

活性仙10)は，上記の各小腸粘膜の上清に

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を加えて

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ALPase

の作用で

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n

で表した。なお，我々3)，4)が先きに報告した方法により，血中の赤血球数 (RBC)， Hb 量，網赤血球数 (RC)，又骨髄の赤芽球数/骨髄球数 (E/M)比と含鉄赤芽球 (SB) 比率を測定した。肝と牌のへモジデリン沈着を

P

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b

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染色で調べた。

1

1 .

結果

1 )

正常ラットの小腸粘膜における

F

r

-

鉄，

F

r

ーたん白質とれ

/P

比，及び

ATPase

と

ALPase

活性の局在

Fi

邑.

1

，

2

に示す如く，正常ラットの小腸粘膜の

F

r

-鉄と

F

r

ーたん白質値及び

Fe/P

比，ならびに

ATPase

と

ALPase

活性は，いずれも十二指腸粘膜が最も高く，反対に小腸4の粘膜が最も低かった。すなわち，

6

匹平均では，十二指腸粘膜の

F

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-

鉄，

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ーたん白質

、

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10

20

食物学会誌・第

3

7

号及び

Fe/P

比は，それぞれ

9 .

6

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0.8μg/g

，

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4

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土

11μg

/g

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0 .

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と

ALPase

活性は，それぞれ

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であった。又，小腸

4

の粘膜の

F

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-

鉄，

F

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ーたん白質及び

Fe/P

比は，それぞれ

0 .

8

土

0.3μg/g

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土

6μg/

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及び

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土

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ATPase

と

ALPase

活性は，それぞれ

3

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n

であった。 2) 正常ラットの十二指腸ループ内へクエン酸鉄を投与した後の SI，小腸粘膜の

F

r

-

鉄及び

ATPase

と

ALPase

活性の変動正常ラットの十二指腸ノレーフ。内へクエン酸鉄丸5，9

mg

(鉄O.

6

， 1.

0

， 1.

8 mg)

を投与した場合，

Table 1

に示す如く，

3mg

投与では， SIが急上昇して

1

0

分後に最高値となり，以後減少するが，十二指腸粘膜の

F

r

-

鉄と

F

r

ーたん白質には著変がなかった。

5r

n

g

1

0

分後に最高値となり，

2

0

分後も高値を示したが，十二指腸粘膜の

F

r

-

鉄と

Fe/P

比は，

1

0

分後に著明な一過性増加を示したにすぎない。又，

9mg

5

分後に最高値となり，

2

0

分後も著明な高値を示したが，十二

一

F

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土SEM

(

n

=

6 )

(3)

昭和57年12月 (1982年) 3 -メJmoVmin./gprotein μmol/min./9 protein 官民 6000

ATPase

ALPase

10001・ 5000 3匝 ₄₀₀₀ 3000 500 2000 1000

G

b

0 .

1

10 20 30 40 50cm-0 10 .20 30 40 50cm

Distance from the pylorus Distance from the pylorus

Fig. 2 The localization of the ATPase and ALPase activities in the small intestines of the normal rats.

*

the mean士SE1¥f(n=6)

Table

1 .

Changes of SI and TIBC levels as well as Fr-iron and Fr-protein levels in intestinal mucosa after various amounts of iron citrate were administered into the duodenalloops of normal rats. Iron i ...金 SI TIBC citrate lMIr l(μg/dl) I (μg/dl)￨ Fr-iron(μg/g) Fr-protein(μg/g) I Duod. Int

川

町

土

13.2

ド

75.7*4

1 .

61 9.6土O.8 2. 9:i::O. 1 2. 6土0.4 I (0.028士 (0.009土 (0.008土 I349:i::11 325土21 311土15 0.003) 0.001) 0.001) 'f¥fO ， 10.6 4.6 5 24~7 4_-_r0_{vv. -}6.4_r _I ₍₀_.₀₃₀₎ ₍₀_.₀₁₄₎ 3mg ! r，，..，..^ ，，，r， '"' 10.9 3.8 [ 1 ( 0 . 0 1 7 ) ( 0 . 0 0 8 ) j 4 0 354 337 20 190. 0 41

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1 I"f¥'":-::，"¥ I"f¥"_~f\~"\ 1 ! ; 1 8 1 1 4 l .J.V V . V ~.J. Å. .J. (0.031) (0.005) 47η3.6 519.8 伊0(.0ω

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)

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)

￨泌紡5 4お制 20 295.1 475. 7 456.8 9 mg I 10 I 364. 4 393.8 497.9

*

Time in mil1 after the iron delivery.

1

1 .

5

(0.043) 27.9 (0.084) 34.4 (0.084) 10.0 (0.054) 3.3 (0.016) 8.3 (0.039) 10.2 (0.032) 3.5 (0.015) 0.9 (0.003)

4 .

1

(0.009) 4. 2 (0.016) 2.0 (0.006) 267 334 410 186 203 211 317 229

*申 Controlvalues (the mean土SEM)(n=6). Parentheses indicate the Fe/P ratio of ferritin.

354

468

256

(4)

4ー食物学会誌・第37号

Table 2. Changes of ATPase and ALPase activities in intestinal mucosa after various amounts of iron citrate were administered into the duodenal loops of normal rats

Iron

cltrate Min*

A TPase ALPase

(μmol of P /min/g protein) (/-tmol of phenol/min/g protein) Duod. Intest. 1 Intest. 2 Duod. 5， 311::1::1， 227 2， 466土499 1， 145士536 。牢牢 712::1::91 466::1::104 441士76 3mg 5mg 9mg ﹁D O O -q L F h d ハ u n u

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L

戸h d 八 U A U 噌i つ臼 1，038 913 975 1，243 1，193 693 1

，

078 1，423 1

，

184 768 642 788 577 637 539 797 731 889 12，269 5，353 6

，

669 596 493 435 5，855 4，574 4

，

097 Intest. 1 Intest. 2 3，832 2，209 3

，

340 1，591 1， 767 1

，

360 949 513 267 1，004 2，675 2，427 532 743 805 4，846 6， 726 6

，

104 2，913 3

，

829 3，137 * Time in min after the iron delivery. 申 *Control values (the mean士SEM)(n=6) 指腸粘膜の Fr-鉄と Fe/P比は， 5-10分後に著明な一過性増加を示したにすぎない。然し， Frーたん白質には，いずれの場合にも著変がなかった。鉄吸収のない小腸1，又は小腸2の粘膜では， Table 1に示す如く，十二指腸粘膜と同様， Fr-鉄と Fe/Pが 10分後に著明な一過性増加を示した。なお，鉄投与後の SIの上昇及び十二指腸粘膜の Fr-鉄の増加は，クエン酸鉄 9mgを投与した場合が最も著明であった。鉄投与後の十二指腸及び、小腸 1，2の粘膜の ATPase と ALPase活性の変動を Table2 に示す。十二指腸粘膜の ATPase活性は，クエン酸鉄 3mgの投与では 5-20分後に，又クヱン酸鉄 5mg或いは 9mg の投与では， 5-10分後或いは5-20分後に増加した。又，十二指腸粘膜の ALPase 活性は，クエン酸鉄 3 mgの投与では 5分後に増加したが，クエン酸鉄5mg 或いは 9mg の投与では，著変を示さなかった。鉄吸収のない小腸 1の粘膜では，クエン酸鉄 9mg の投与の場合だけに， ATPase活性が 20分後に，又 ALPase活性が10分後に軽度の増加を示した。小腸 2

Table 3. Changes of Fr-iron and Fr-protein levels of the liver and spleen after various amounts of iron citrate were administered into the duodenalloops of normal rats

Iron ，."・也 Liver Spleen trate lVlIn甲

l

一一一一一一一一 ( IFr・iron(μg/g)Fr-protein(μg/g) Fe/P ratio [Fr-iron(μg/ g) Fr-protein(μ 0** 9.1士0.4 235士お仏

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- - n

L

10.3 7.4 9.3 248 285 342 515 53.9 589 49.9 442 54.2 514 51. 5 677 31. 6 488 54.3 587 0.042 0.026 0.027 5 9. 3 219 O. 042 9 mg 10 10.9 255 0.043 l 2 0 1 μ 1 8 9 0.066 * Time in min after the iron delivery. 料 Controlvalues (the mean土SEM) (n=6) 0.092 0.113 0.105 0.076 0.065 0.093

(5)

昭和57年12月 (1982年) の粘膜でも， ATPase と ALPase活性が10-20分後に軽度の増加を示した。肝と牌の Fr-鉄は， Table 3 に示す如く，クエン酸鉄 9mgを投与して20分後に軽度の増加を示した以外は，著変がなかった。なお，肝と牌のへモジデリン沈着は，鉄投与して20分後では著変を示さなかった。 3) 潟血貧血ラットの十二指腸ルーフ。内へクエン酸鉄 15mgを投与した後の SI，小腸粘膜の Fr-鉄及び、 ATPaseと ALPase活性の変動 - 5ー潟血貧血ラットの十二指腸ノレープ内へクエン酸鉄15 mg (鉄 3.0mg)を投与した後の SI，十二指腸及び小腸 1， 2の粘膜の Fr鉄とれ/P比の変動を

Table

4

に，又 ATPase と ALPase活性の変動を

Table

5

に示す。

潟血貧血ラットの SI及び十二指腸粘膜の Fr-鉄と

Fe/P比は，正常ラットに比べて約1/3に著減するが，

ATPaseと ALPase活性には変化がなかった。

鉄投与後は， SIが急上昇して20分後に最高値とな

Table

4 .

Changes of SI and TIBC levels as well as Fr-iron and Fr-protein levels in intestinal mucosa after 15 mg of iron citrate was administered into the duodenal loops of phlebotomied anemic rats 民1in* n 6・・・ v - -va e m & E A n + A o w o

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料 Valuesat five days after phlebotomy and feeding on the iron deficient chow.

t Control values (the mean土SEM) (n=6) り， 3時間後も高値を示した。十二指腸粘膜の Fr-鉄と FejP比は， 3時間後には増加の傾向を認めたが，正常値よりも低値であった。鉄吸収のない小腸1，2 の粘膜の Fr鉄は，鉄投与して 10分後では変化がなかった。又，十二指腸粘膜の ATPaseとALPase活性は，鉄投与して 20分後から著増し， 3時間後も高値を示した。鉄吸収のない小腸 1， 2の粘膜の ATPaseと ALPase性は，鉄投与して 10分後では変化がなかった。肝と牌の Fr-鉄と FejP比は， Table 6に示す如く，潟血後著減するが，鉄投与して3時間後までは著変がなかった。潟血後，血中の RBC と Hb，又骨髄の SBが著減し，反対に血中の RC と骨髄の EjM比が増加したが，鉄投与して3時間後には，いずれも改善される傾向を示した。牌のヘモジデリン沈着は，潟血後減少したが，鉄投与して3時間後までは変化がみられなかった。

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考

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正常ラットの小腸粘膜の Fr-鉄， Frーたん白質， Fe jP比及び ATPaseとALPase活性が，いずれも十二指腸で最も高値を示したが，このことは食物中の鉄が十二指腸及び上部空腸で最も活発に吸収されると言われている11)ととと併せ考えると，甚だ興味深いことである。ラットの小腸粘膜の ATPaseと ALPase 活性は，十二指腸が最も高く，回腸が最も低いという報告12)がある。正常ラットの十二指腸ループ内へクエン酸鉄を投与した場合， 3-9mgの投与量では，鉄の投与量に比例して， SIの上昇が著明となったことから，十二指腸からの鉄吸収は，鉄の投与量に比例して増大することが考えられる。又，鉄投与後の十二指腸粘膜の Fr-鉄とれjP比の一過性増加は，鉄の投与量が多いほど著明であった。以上を綜合して考えると，正常ラットでは十二指腸粘膜のフエリチンが，余分の鉄吸収を制御するために，一種のシグナル3)州，5)として働くことが示唆される。 Greenbergerら13)は，小腸粘膜細胞の brush border に吸着される鉄の量が，体内の貯蔵鉄の変動によって変化することを報告した。従って，正常ラットに鉄を大量に経口投与した場合，十二指腸粘膜の Fr-鉄が著明な一過性増加を示すのは，恐らく小腸からの余分の鉄吸収を阻止するために，粘膜細胞の brush borderに結合する鉄の量を抑えるシグナノレとして働くととを示唆する。鉄吸収のない小腸l或いは小腸2の粘膜では，十二指腸粘膜と同じく，程度乙そ弱いが， Fr-鉄が一過性増加を示した。とのことは，小腸 1，或いは小腸 2の粘膜細胞内のアポフエリチンに，血液由来の鉄が取りとまれたことを示唆する。この Fr-鉄の一過性増加は，十二指腸と同じく，小腸1，或いは小腸2からの鉄吸収を制御するためのシグナノレであろう，と考えられる。 Crosby2) らは，乙のような血液由来の鉄を“ mes-senger iron"と呼び，体内の貯蔵鉄の状態を伝えるメッセンジャーとして働くものと考えた。以上を綜合して考えると，正常ラットに過剰の鉄を経口投与した場合，小腸粘膜のフエリチンが全体とし

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昭和57年12月 (1982年) て，消化管由来の鉄の他に，血液由来の鉄をも取りこんで，小腸からの余分の鉄吸収を制御するために，一種のシグナノレとして働くことが示唆される。小腸粘膜内を鉄が濃度勾配に逆って，粘膜側から襲膜側へ向って移動する際には， ATP がエネルギー源として必要であることが指摘されている山。正常ラットの十二指腸ノレープ内へクエン酸鉄を投与した場合，十二指腸粘膜の ATPase活性は， SIの上昇とほぼ平行して増加するが，又鉄の投与量に比例して増加した。従って， ATPaseが，小腸粘膜細胞内の鉄の輸送に関与しているととが示唆される。しかし， ALPase活性は，鉄投与後， SIと平行して増加せず，又鉄の投与量に比例して増加しなかった。潟血貧血ラットの十二指腸ループ内へクエン酸鉄15 rngを投与すると， SIが速やかに著明な上昇を示し，又十二指腸粘膜の ATPase と ALPase活性が著増し，いずれも3時間後まで高値を持続した。しかし，十二指腸粘膜の Fr一鉄と FejP比は， 3時間後に軽度の増加を示したが，対照に比べて低値であった。正常ラットの場合と異り，鉄投与後に十二指腸粘膜の Fr一鉄が一過性増加を示さなかったのは，漏血貧血ラットの体内では鉄不足が存在するためと考えられる。鉄投与後，十二指腸粘膜の ATPaseと ALPase活性が， SI の上昇とほぼ平行して増加したことは，この両酵素が十二指腸の粘膜細胞内の鉄輸送に関聯していることを示唆する。腎尿細管の上皮細胞膜の表面では， Na+と K+の吸収，或いは輸送が活発で， ALPase及び、Na+ -K+依存性の ATPaseの活性が増加すると言われている凶。然し，上述の如く，正常ラットの十二指腸ループ内へクエン酸鉄を投与した場合.十二指腸粘膜の ATPase 活性は， SIの上昇と平行して増加するが， ALPase活性は SIの上昇と平行して増加しなかった。とのことは，十二指腸粘膜における鉄輸送に主役を演ずるのは， ALPaseよりもむしろ ATPase であることを示唆する。正常ラット，潟血貧血ラットともに，鉄投与により血中の RCが減少したが，とれは RCがトランスフエリンから鉄を細胞内に取りこんで15).16)，Hb 合成を促進したことが一因と考えられる。又，潟血貧血ラットでは，鉄投与後，徐々に骨髄の EjM 比が減少し， SBが増加したが，肝と牌の Fr一鉄とヘモジデリン沈着は， 3時間後も著変がなかった。このことは，十二指腸粘膜から吸収された鉄が，主として骨髄に運ばれて赤血球造血に利用されたことを示唆する。 7

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まとめ

1. 正常ラットでは，十二指腸粘膜の Fr-鉄， Frーたん白質及び FejP比が最も高値で，又 ATPase と ALPase活性も十二指腸粘膜で最も高値であった。 2. 正常ラットの十二指腸ループ内へクエン酸鉄を投与すると，鉄の投与量に比例して SIが急上昇するが，持続性がなく，又十二指腸粘膜の Fr鉄が， SI のピークに少し遅れて著明な一過性増加を示した。鉄吸収がない小腸 1，或いは小腸 2の粘膜では，十二指腸粘膜と同じく， Fr-鉄が鉄投与後に一過性増加を示した。以上より，正常ラットに大量の鉄を経口投与すると，小腸粘膜のフエリチン全体が，消化管のみならず，血液に由来する鉄を取りこみ，小腸からの余分の鉄吸収を制御するために，一種のシク、、ナノレとして働くことが示唆された。 3. 潟血貧血ラットの十二指腸ループ内へ大量のクエン酸鉄を投与すると，十二指腸粘膜からの鉄吸収が活発で， SI及び十二指腸粘膜の ATPase と ALPase 活性が著増するが，正常ラットの場合と異り，体内に鉄不足があるために，十二指腸粘膜の Fr-鉄は一過性増加を示さなかった。本研究の概要は，第43回日本血液学会総会(昭和56 年 4月，名古屋市)にて発表した。参考文献

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ラットの小腸粘膜における鉄吸収制御機構

研 究 報 文