タバコ培養細胞およびシロイヌナズナの耐塩性に及ぼす不飽和脂肪酸の重要性

タバコ培養細胞およびシロイヌナズナの耐塩性

に及ぼす不飽和脂肪酸の重要性

小林雄二*ῌ前田良之***ῌ坂田洋一**ῌ田中重雄**ῌ武長 宏***

ῑ平成 +- 年 , 月 ,2 日受付ῌ平成 +- 年 . 月 +3 日受理ῒ

要約 : 高等植物の耐塩性と不飽和脂肪酸との関係を明らかにするため῍ 脂肪酸の不飽和度の増加が植物の耐

塩性に及ぼす影響について検討したῌ 光独立栄養性タバコ緑色培養細胞 ῑNicotiana tabacum cv. Samsun

NNῒ の塩適応株は野生株に比べて C+0 : + および C+2 : - 脂肪酸の含有率が高く῍ C+0 : *, C+2 : *, C+2 : , 脂 肪酸の含有率が低かったῌ また῍ 脂肪酸の不飽和化酵素遺伝子が欠損したシロイヌナズナ変異株は῍ 発根時 あるいは子葉の展開時において野生株に比べて耐塩性が減少していたῌ これらの結果から῍ 脂肪酸の不飽和 度の増加がタバコ培養細胞およびシロイヌナズナの耐塩性に関与している可能性が示されたῌ キ῍ワ῍ド : タバコ῍ シロイヌナズナ῍ 不飽和脂肪酸῍ 耐塩性 ῎῎῎῎῎῎῎῎῎῎῎῎῎῎῎῎῎῎῎῎῎῎῎

緒

言

土壌への塩類集積は῍ 作物の生産性の向上にとって大き な障害となっており῍ 植物に対して様῎な影響を引き起こ すῌ その影響の一つとして植物の脂肪酸の不飽和化が塩ス トレスによって減少することが報告されている+, ,ῒ ῌ また῍ 耐塩性の強いトウモロコシでは塩ストレスによって脂肪酸 不飽和化酵素遺伝子 w-- ffatty aacid ddesaturaseῑfad1 およ

び fad2ῒ の mRNA の蓄積量が増加すること-, .ῒ ῍ らん藻の 脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の欠損株は野生株に対して塩に 対する感受性が高いことが示されている/ῒ ῌ これらの報告 は脂肪酸の不飽和度の増加が植物の耐塩性に関与している 可能性を示しているῌ そこで῍ 本試験は ,** mM NaCl 存 在 下 で 光 独 立 栄 養 的 に 生 育 可 能 な タ バ コ 培 養 細 胞

ῑNicotiana tabacum cv. Samsun NNῒ0ῒ

の脂肪酸組成῍ お よび 0 系統の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が欠損したシロイ ヌナズナ変異株の耐塩性を調査し῍ 植物培養細胞および植 物体の耐塩性に及ぼす脂肪酸の不飽和度の影響を検討し たῌ

材料および方法

+ῌ 光独立栄養性タバコ培養細胞の生育条件 光独立栄養性タバコ培養細胞 ῑNicotiana tabacum cv. Samsun NNῒ は糖源の供給を伴わずに生育可能な細胞株 であり῍ 細胞株の培養は室田ら0ῒ の方法に従ったῌ すなわ ちショ糖を含まない改変 Linsmaier-Skoog 培地 ῑpH /.1ῒ にて二酸化炭素濃度 +ῐ,῍ を維持し῍ 連続照明下 ῑ+,* mE m῔,s῔+ῒ で往復振とう培養 ῑ+** rpmῒ を行ったῌ 細胞株 は野生株および ,** mM NaCl 存在下で生育可能な塩適応 株を用いたῌ なお῍ 塩適応株は῍ ,** mM NaCl 添加培地に て継代培養を行った0ῒ ῌ ,ῌ タバコ培養細胞の脂肪酸組成の分析 継代後 +* 日目の野生株および塩適応株から Bligh and Dyerの方法1ῒ に従って脂質を抽出し῍ -,῕῍ 窒素気流下に て脂質 + mg を乾固後῍ ,./῍ HClῌメタノ῏ル῍ 内部標準と してペンタデカン酸を加えて 2/῕῍ ,./ 時間加熱したῌ 冷 却後῍ ヘキサンおよびヘキサン : 水 ῑ- : + vῌvῒ にて脂肪 酸メチルエステルを抽出したῌ これを減圧下で濃縮後῍ ガ スクロマトグラフ GC-3A ῑShimadzu, Japan),

Supelco-wax +* [-* m, *./- mm, +.** mm (Supelco, USAῒΐ によっ

て分析した1, 2ῒ

ῌ

-ῌ シロイヌナズナ変異株の子葉展開率および発根率の測 定

供試したシロイヌナズナ変異株の種子 ῑArabidopsis

thaliana sp. Columbiaῒ は῍ fad,ῌ+ ῑStock No. CS2*.+ῒ῍ fad-ῌ, ῑStock No. CS2*-.ῒ῍ fad.ῌ+ ῑStock No. CS,*/ῒ῍ fad/_{ῌ+ ῑStock No. CS,*0ῒ῍ fad0ῌ+ ῑStock No. CS,*1ῒ῍}

および fad1ῌ+, 2ῌ+ ῑStock No. CS2*-0ῒ であり῍

Arabido-psis Biological Resource Center ῑABRCῒ より譲渡され

たῌ また῍ fad.ῌ+ および fad/ῌ+ は C+0 : * から C+0 : + へ῍

fad,_{ῌ+ は C+2 : + から C+2 : , へ῍ fad-ῌ, および fad1ῌ+, 2} ῌ+ は C+2 : , から C+2 : - へ῍ fad0ῌ+ は C+0 : + から C+0 : ,へ῍ あるいは C+2 : + から C+2 : , へそれぞれ変換する不 飽和化酵素遺伝子が欠損した変異株である3, +*ῒ ῌ シロイヌ ナズナ変異株種子は῍ ロックウ῏ル上へ播種し +ῌ, 強度の MGRL培地にて ,-῕῍ 連続照明下 ῑ/*ῐ1* mE m῔,s῔+ῒ で 栽培を続け次世代の種子を得た++ῒ ῌ 種子を 1*῍ エタノ῏ ル῍ /῍ NaClOῌ*.*/῍ Tween ,* で滅菌し滅菌水で / 回洗 * ** *** 東京農業大学農学研究科農芸化学専攻 東京農業大学応用生物科学部バイオサイエンス学科 東京農業大学応用生物科学部生物応用化学科

Jour. Agri. Sci., Tokyo Univ. of Agric., .0 (,), 2.ῌ21 (,**+)

浄した後῍ .῔ 条件下で -* 分吸水させたῌ その後῍ 種子を

*῎,** mM NaCl を添加した寒天培地 ῑMS salt, -ῌ su-crose, Gamborg’s vitamin, +.,ῌ agar ῏Wakoῐ ῏pH /.1ῐῒ

へ播種した+,, +-ῐ ῌ 暗所にて .῔῍ / 日間の低温処理後῍ 人工 気象室にて ,-῔῍ 連続照明下 ῏/*῎1* mE mΐ,sΐ+ῐ で +. 日間栽培し῍ 発根率῍ および子葉展開率を測定したῌ

結果および考察

供試したタバコ培養細胞の野生株および塩適応株の脂肪 酸組成を Table + に示すῌ 野生株に比べて塩適応株の C+0 : +および C+2 : - 脂肪酸の含有率は有意に高く῍逆に C+0 : *, C+2 : *および C+2 : , 脂肪酸の含有率は低い値を示し たῌ また῍ 脂肪酸の不飽和度を示す不飽和脂肪酸ῌ飽和脂肪 酸比は῍ 野生株の +.1 に比べて塩適応株で ,.. と高い値を 示し῍ 脂肪酸の不飽和度の増加が塩適応株の耐塩性の強化 に関与している可能性が認められたῌ そこで῍ 脂肪酸の不飽和度の増加と耐塩性の強化との関 連が植物体においても認められるかを明らかにするため に῍ 脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の欠損したシロイヌナズナ の耐塩性を野生株と比較した῏Table , および Table -ῐῌ ,**mMの NaCl 処理条件下で῍ 野生株と比べて fad,ῌ+, fad-ῌ,, fad.ῌ+, fad/ῌ+῍ および fad1ῌ+, 2ῌ+ の発根率は有

意に低下した῏Table ,ῐῌ また῍ 子葉の展開率は῍ +/* mM および ,** mM の NaCl 処理下で fad,ῌ+ のみ有意に低下 した ῏Table -ῐῌ 植物において脂肪酸の不飽和度の増加には῍ 一連の脂肪 酸不飽和化酵素が関与し῍ 各酵素によって不飽和度が順次 増加することが報告されている3, +*ῐ ῌ 本試験の結果῍ ,** mMの NaCl 処理条件下でのタバコ培養細胞の塩適応株に おいて C+0 : * 含有率の減少と C+0 : + 含有率の増加およ び C+2 : , 含有率の減少と C+2 : - 含有率の増加が有意に 示され῍ C+0 : * から C+0 : +῍ および C+2 : , から C+2 : -へ変換する脂肪酸不飽和化酵素に関わる遺伝子の関与が示 唆されたῌ 一方῍ 脂肪酸不飽和化酵素遺伝子欠損株を用い た結果から῍ シロイヌナズナの発根および子葉展開時の耐 塩性にはそれぞれ C+0 : * から C+0 : +, C+2 : + から C+2 : ,, C+2 : ,から C+2 : -῍ および C+2 : + から C+2 : , への不 飽和度の増加が関与している可能性が示されたῌ 特にタバ コ培養細胞においても認められた C+0 : * から C+0 : + お よび C+2 : , から C+2 : - への脂肪酸の不飽和度の増加は 植物の耐塩性強化に強く関連しているものと判断できたῌ 脂肪酸の不飽和度の増加と耐塩性との関連について῍ 膜脂 質内の不飽和脂肪酸は῍ 物理化学的な膜の構造や原形質膜 の ATPase 活性にも影響を与えること+., +/ῐ ῍ らん藻の脂肪

Table + Fatty acid compositions in Wild type and NaCl-adapted cells of tobacco

Table , Germination ratio (rooting) in seeds of Arabidopsis thaliana sp. Columbia

酸不飽和化酵素遺伝子の欠損株は῍ 野生株に対して塩に対 する感受性が高く῍ この感受性が原形質膜の NaῐῌHῐ antiporter活性の減少によるものであるということが報 告されている/῏ ῌ 本試験で認められた不飽和脂肪酸の増加 は῍ 塩に対する生体膜の構造の維持に関与しているものと 思われ῍ 今後῍ 不飽和脂肪酸含有率の増加が認められる膜 画分および脂質分子種を検討するとともに各膜画分におけ るイオン輸送能についても検討することが必要であるῌ 謝辞 : 研究を行うに際して光独立栄養性タバコ培養細胞を 提供して頂いた東海大学教養学部 室田憲一博士῍ ならび に シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ 変 異 体 の 種 子 を 分 与 し て 頂 い た

Arabidopsis Biological Resource Center ῎ABRC῏ に対

して深く感謝いたしますῌ

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Table - Germination ratio (cotyledon growth) in seeds of Arabidopsis thaliana sp. Columbia

小林ῌ前田ῌ坂田ῌ田中重ῌ武長

Importance of Unsaturated Fatty Acids on Salt

Tolerance of NaCl-Adapted Tobacco Cell Cultures

and Arabidopsis Thaliana

By

Yuji K

OBAYASHI

*, Yoshiyuki M

AEDA

***, Yoichi S

AKATA

**, Shigeo T

ANAKA

**

and Hiroshi T

AKENAGA

***

(Received February ,2, ,**+/Accepted April +3, ,**+)

Summary : A line of NaCl-adapted photoautotrophically cultured tobacco cells (Nicotiana tabacum cv. Samsun NN) contained more unsaturated fatty acids than unadapted cells, suggesting that high levels of unsaturated fatty acids may cause the cells to be more resistant to salt stress. Mutants of Arabidopsis thaliana, lacking genes encoding fatty acid desaturases, were inferior to the wild type in susceptibility to salt stress during the germination period. These results suggest that the desaturation of fatty acids is responsible for the salt tolerance in tobacco cells and A. thaliana.

Key Words : Tobacco, Arabidopsis thaliana, unsaturated fatty acid, salt tolerance

* ** ***

Division of Agricultural Chemistry, Graduate School of Agriculture, Tokyo University of Agriculture

Laboratory of Plant Genetics, Department of Bioscience, Faculty of Applied Bioscience, Tokyo University of Agriculture Laboratory of Plant Production Chemistry, Department of Applied Biology and Chemistry, Faculty of Applied Bioscience, Tokyo University of Agriculture