46(5) 257―265 (2020) ＊〒501-1196 岐阜市大学西1-25-4
HPLCを用いたエンザルタミドおよび
その活性代謝物の血漿中濃度測定系の確立
佐野 空1，曽田 翠＊1，佐橋春香1，松宮英美里1，有我真帆1， 浅野朱里1，臼井茂之1，堀 晃代2，後藤千寿2，北市清幸1 岐阜薬科大学薬物動態学研究室1，岐阜市民病院薬剤部2Development of a HPLC-UV Method for the Quantitative Determination of
Enzalutamide and its Active Metabolites in Human Plasma
Sora Sano1, Midori Soda＊1, Haruka Sahashi1, Emiri Matsumiya1, Maho Ariga1, Akari Asano1, Shigeyuki Usui1, Akiyo Hori2, Chitoshi Goto2 and Kiyoyuki Kitaichi1
Laboratory of Pharmaceutics, Department of Biomedical Pharmaceutics, Gifu Pharmaceutical University 1, Department of Pharmacy, Gifu Municipal Hospital 2
Received December 13, 2019 Accepted April 3, 2020
Enzalutamide is an orally administered drug that effectively treats castration-resistant prostate cancer. The prescribed dose of enzalutamide in Japan is the same as that in other countries, possibly causing an overdose of enzalutamide and adverse drug reactions (ADRs) in Japanese patients. In the present study, for the pharmacokinetic study to investigate the relationship between the effectiveness/ADRs and the concentrations of enzalutamide, we developed a method to measure plasma concentrations of enzalutamide and its main active metabolite (N-desmethyl enzalutamide) using high performance liquid chromatography (HPLC). The HPLC-UV system used was Shimadzu LC-20Avp equipped with a 5C18 column using 20 mM ammonium acetate (pH 5.0) containing 43％ acetonitrile as the mobile phase. Enzalutamide and N-desmethyl enzalutamide were detected at 237 nm. Plasma samples were deproteinized by adding acetonitrile containing an internal standard substance (IS), nilutamide. After the centrifugation, the supernatant was collected and evaporated to dryness under a stream of nitrogen gas. The residue was reconstituted with the mobile phase and injected into the HPLC system. Peaks of IS, N-desmethyl enzalutamide and enzalutamide were detected at a retention time of 9.5, 12.7 and 16.8 min, respectively. The established method was validated based on FDA guidelines and found to have good linearity (0.25-25 μg/mL), precision and accuracy. We also confirmed that our method was applicable to the measure-ment of patient plasma. These results suggest that the established method would be suitable to measure enzalutamide and N-desmethyl enzalutamide in plasma for the research to promote the proper use of enzalutamide.
Key words ―― enzalutamide, N-desmethyl enzalutamide, HPLC-UV, prostate cancer
緒 言
新規抗アンドロゲン剤であるエンザルタミド
（製品名イクスタンジ®）は，アンドロゲン受容
体（androgen receptor: AR）へのアンドロゲンの 結合を競合的に阻害することにより，AR の核内 移行を阻止し，AR とクロマチンとの結合を阻害 することで腫瘍を縮小・退縮させる薬剤であり，
去勢抵抗性前立腺がん（castration resistant prostate
cancer; CRPC）の治療に用いられている．1）その臨
床効果は前立腺特異抗原（prostate specific antigen:
PSA）値によって評価される．CRPC に対してエン
ザルタミドが投与された日本人患者において，PSA
奏効率（PSA 50％以上低下）は約 60％であり，2, 3）
PREVAIL試験4）における 78％と比較してやや低
られている．一方で，エンザルタミドは重大な副 作用に痙攣発作や血小板減少があり，国内第Ⅰ相 / 第Ⅱ相試験においては忍容性が認められているも の の， 高 血 圧（14.9％）， 便 秘（14.9％）， 疲 労 （12.8％），食欲減退（12.8％），体重減少（10.6％） および心電図 QT 延長（10.6％）などがエンザル タミドと関連する有害事象として報告されている （括弧内はそれぞれの発現率を表す）．5）エンザル タミド 80～160 mg/日で投与された少数日本人患 者の初期治療においても，有害事象は約 40％の 患者に認められ，いずれも添付文書記載用量の 160 mg/日開始症例であったことが報告されてい る．6）また，PREVAIL 試験において，全対象患者 と比較して日本人は 1.2 倍程度血漿中濃度が高い ことが報告されており，これには日本人とその他 人種との体重の違いが重要であることが示唆され ている．4）これらの報告を受けてエンザルタミド の有効性と安全性を考慮すると，CRPC 患者は一 般に高齢者であることが多く，薬剤による有害事 象を発現しやすい患者群であることから，エンザ ルタミドを減量して開始することにより有害事象 のリスクを軽減し，かつ有効性を得ることができ るのではないかと考えられる．実際にエンザルタ ミドの投与量を減量して開始したケースにおいて も，投与量を減量しないケースと変わらない PSA 変動を示すことが報告されている．7） エンザルタミドの薬物動態に関して，エンザル タミドは主に CYP2C8 によって代謝され，その 代謝生成物である N-desmethyl enzalutamide（N-脱メチル体）は活性代謝物であることが知られて いる．8, 9）エンザルタミドの主要な消失経路は代謝 であり，ゲムフィブロジル（本邦未承認）のよう な CYP2C8 阻害剤との併用時にはエンザルタミ ドの投与量を減量すべきであるという報告があ る．10）一方で，透析中の重篤な腎疾患患者におい てエンザルタミド投与開始後に高血圧が起きたこ とから，エンザルタミドの体内蓄積が示唆された という症例報告も存在する．11）以上の結果は，腎機 能や肝機能の変化によるエンザルタミドおよびそ の活性代謝物 N-脱メチル体の血漿中濃度の変動が エンザルタミドの治療効果や有害事象発現に関与 ミドの非活性代謝物である enzalutamide carboxylic acid（カルボン酸体）の存在が知られているが，8）カ ルボン酸体がエンザルタミドの治療効果や有害事 象発現に与える影響に関する報告はほとんどない． 従って，エンザルタミドは添付文書記載通りの 「160 mg を 1 日 1 回経口投与」を行うのではなく， 年齢，既往歴，肝機能，腎機能や併用薬の影響を 考慮した投与量の適正化を行うことが必要である と考えられる．しかしながら，日本人 CRPC 患 者を対象としたエンザルタミドおよび N-脱メチ ル体の血漿中濃度に関する詳細な解析は行われて いない．ヒト血漿サンプル中のエンザルタミドと N-脱メチル体の同時測定に関する既報では，測 定機器に高速液体クロマトグラフィー（high performance liquid chromatography: HPLC）12）および， liquid chromatography - tandem mass spectrometry （LC-MS/MS）13-17）が用いられている．日本人 CRPC 患者のエンザルタミド反復投与における血漿中エ ンザルタミドおよび N-脱メチル体濃度はともに 定常状態でおよそ 10～15 μg/mL であり，4）既報に おけるエンザルタミドおよび N-脱メチル体の定 量範囲は 0.5～50 μg/mL，12,13）0.02～50 μg/mL，14）0.1 ～30 μg/mL，15）1.5～30 μg/mL，16）および 0.005～0.5 μg/mL（エンザルタミド），17）0.01～1.0 μg/mL（N-脱メチル体）17）であるため，HPLC によっても十 分に測定可能な濃度レベルにあると考えられた． そこで本研究では，多くの病院での導入が容易な 汎用性の高い HPLC を用い，多くの医療従事者 が実行可能な簡便な測定手順で，従来法と比較し てより低濃度までエンザルタミドおよび N-脱メ チル体を測定する方法を確立した．確立した測定 系は，米国食品医薬品局（FDA）のガイドライ ン18）に基づいたバリデーションを行うとともに， エンザルタミド服用患者検体の血漿中濃度測定を 行い，その実用性について検討した．
方 法
1．実験材料 標準物質としてエンザルタミド，N-脱メチル 体はコスモバイオ（株）（東京），カルボン酸体は富部標準物質（ internal standard substance: IS ）は nilutamide（フナコシ（株），東京）を用いた．薬 物の希釈・溶解にはメタノール（MeOH，キシダ 化学（株），東京）を使用した．移動相作成に用い た酢酸は小宗化学薬品（株）（東京），酢酸アンモニ ウムおよびアセトニトリル（acetonitrile: AcCN） はナカライテスク（株）（京都）よりそれぞれ購入 した．検量線作成およびバリデーションに使用し たヒト標準血漿はコスモバイオ（株）から購入し た．また，フィルター処理には Millex®-LG（0.20 μm, Merck, Darmstadt）を使用した． 2．分析条件 測 定 機 器 に は HPLC（SHIMADZU LC-20AD system,（株）島津製作所 , 京都）を用い，分析用カ ラムには COSMOSIL® 5C18-MS-II（4.6 ID × 250 mm, 5 μm, ナカライテスク（株））を使用した．移 動相は 20 mM 酢酸アンモニウム（pH 5.0）と AcCNを 57 : 43 の割合とし，流速は 1.5 mL/min， カラム温度は 40℃，検出波長は 237 nm，測定時 間は 20 分とした．なお，HPLC へのサンプル注入 量は 100 μL とした． 3．ストック溶液および qualitycontrol（QC） 血漿の作成 エンザルタミドおよび N-脱メチル体はそれぞ れ 1 mg/mL となるよう MeOH に溶解し，ストッ ク溶液とし，–30℃で保存した．標準希釈液はス トック溶液を MeOH で用時希釈して作成した．IS は 0.1 mg/mL となるよう MeOH に溶解して –30℃ で保存し，ストック溶液をそのままの濃度で測定 に使用した．分析法バリデーションおよび血漿中 の薬物安定性の検討に用いる QC 血漿は，血漿中 薬物濃度として 0.25（lower limit of quantification: LLOQ），0.5（low quality control: LQC），10（middle quality control: MQC）および 25（high quality control:
HQC）μg/mL の濃度になるように標準希釈液をヒ ト標準血漿に添加・混和して作成した． 4．血漿サンプルの調製 希釈開始時点でエンザルタミドと N-脱メチル 体を 1 : 1 で混合し，ヒト血漿中濃度として 0.25～ 25 μg/mLとなるようにストック溶液を MeOH で段 階希釈した．1.5 mL チューブに，ヒト標準血漿 200 μL，エンザルタミドと N-脱メチル体の混合希 釈 液 20 μL，IS 60 μL を加え，さらに AcCN 900 μLを入れて混和した後，遠心分離（12,500 rpm, 4℃, 15 min）して除蛋白を行った．その上清を窒素乾 固（50℃, 30 min）後，移動相 150 μL に再溶解し， 再び遠心分離を行った後，シリンジフィルターに 通し HPLC に注入した． 5．検量線 検量線の作成には，血漿中濃度換算として 0.25， 0.5，2.5，5.0，10 および 25 μg/mL の 6 点を用い， 既知濃度（x）に対し，IS のピーク面積に対する エンザルタミドおよび N-脱メチル体のピーク面 積比（y）から最小二乗法による直線回帰分析で 算出した．相関係数が 0.99 以上であった場合を 検量線の直線性ありと判断した．算出した回帰式 を用いて各濃度の検量線用試料面積比から推定血 漿中濃度を求めた． さらに，2 つのピーク間の分離度を日本薬局方 （第十七改正日本薬局方 一般試験法 2.01 液体クロ マトグラフィー）の定義式に基づいて算出した． 6．分析法バリデーション FDAのガイドライン18）に基づき，選択性，直 線性，回収率，再現性および安定性についての検 討を行った．血漿由来成分の影響を受けずに目的 物質の検出が可能かを確かめるための選択性の検 討では，25 μg/mL のエンザルタミドおよび N-脱 メチル体を添加したヒト標準血漿とブランク血漿 の測定を行った．再現性の検証においては，方法 3. に示した 4 濃度の QC 血漿を用いた．定量下限 は，分析対象物質のレスポンスがブランク試料の レスポンスの 5 倍以上である濃度で，かつ，真度 と精度が± 20％以内を満たす濃度とした．安定 性は，0.5 および 25 μg/mL の QC 血漿について， 卓上安定性（室温，24 時間），長期安定性（–30℃， 6カ月），調製後安定性（オートサンプラー内， 24時間）および凍結融解安定性（–30℃で保存し， 翌日室温にて完全溶解させた後，再度 –30℃で凍 結する作業を 3 回繰り返す）を検討した．許容基
準は FDA のガイドライン18）に基づき，真度は± 15.0％以内（ただし，定量下限は± 20.0％以内）， 精度は 15.0％以下（ただし，定量下限は 20.0％以 下）と設定した．なお，真度と精度は次の式を用 いてそれぞれ算出された．
真度（relative error: RE）
RE（％）＝ 測定値 – 理論値
理論値 × 100
精度（relative standard deviation: RSD）
RSD（％）＝ 標準偏差 平均値 × 100 7．患者検体測定 岐阜市民病院にて CRPC と診断され，エンザ ルタミドの投与が開始された 70 歳代の男性患者 1名の血漿中エンザルタミドおよび N-脱メチル 体濃度を測定した．患者はエンザルタミド 160 mg/日を投与され，血漿中濃度測定用の採血は投 与開始後 14，28，56，84，119 および 154 日目の 日常診療用の採血に上乗せして行った（採血時間 は直前のエンザルタミド服用から約 11 時間後に 相当する）．また，併用薬（括弧内は 1 回服用量 を示す）は，アムロジピン（5 mg），オルメサルタ ン（20 mg），ビソプロロール（2.5 mg）およびリバー ロキサバン（15 mg）であった．なお，本測定は 岐阜薬科大学および岐阜市民病院の「人を対象と する医学系研究に関する倫理指針」に準拠した倫 理審査委員会の承認を得ている（承認番号：30- 43および 482）． 患者の血漿サンプルは，岐阜市民病院にて –80℃にて冷凍保存されたものを融解し，1.5 mL チューブに 200 μL 入れ，MeOH を 20 μL，IS を 60 μLを加えた．以降の調製方法は上述 4. の血漿 サンプルの調製手順と同様に行った．
結 果
1．選択性 本測定系で得られたエンザルタミド，N-脱メ チル体および IS 含有血漿サンプルと，ブランク 血漿サンプルのクロマトグラムをそれぞれ図 1A および B に示す．保持時間 9.5 分で IS，12.7 分 で N-脱メチル体，16.8 分でエンザルタミドのピー クが確認され，直前のピークとの分離度はそれぞ れ 9.27（IS– N-脱メチル体），9.05（N-脱メチル 体 – エンザルタミド）と算出されたことから，3 化合物は互いに干渉することなく測定できること が確認された．また，N-脱メチル体のように活 【図1】 図 1 各サンプルのクロマトグラム （A）エンザルタミド（25 μg/mL），N-脱メチル体（25 μg/mL）および IS（100 μg/mL）を添加した血漿のクロマトグラム．（B）ブ性を示さないが，エンザルタミドの主要代謝物の 1つであるカルボン酸体のピーク位置を確認した ところ，保持時間は 4.5 分であり，IS，N-脱メチ ル体，エンザルタミドのいずれのピークとも重な らないことが確認された（図 1C）．さらに，血 漿成分由来のピークおよびカルボン酸体のピーク は，N-脱メチル体，エンザルタミドおよび IS の 定量に影響を及ぼさないことが確認された． 2．検量線 エンザルタミド，N-脱メチル体ともに血漿中 濃度換算 0.25～25 μg/mL の濃度範囲において良 好な直線性を示し，相関係数はいずれも 0.99 以 上の良好な相関を示した（図 2）．また，本測定 系の定量下限はヒト血漿中濃度換算でエンザルタ ミド，N- 脱メチル体ともに 0.25 μg/mL であった． 3．分析法バリデーション 血漿中濃度として 0.5，10 および 25 μg/mL の 時の回収率は，エンザルタミドではそれぞれ 91.8％，95.5％および 99.0％，N-脱メチル体では それぞれ 83.4％，91.3％および 89.1％であった． 回収率はいずれも高く，濃度間の変動が十分に小 さいことが確認された． 日内再現性および日間再現性については，検討 したすべての濃度において真度および精度はとも に許容基準値以内であり，再現性高く測定できる ことが示された（表 1）．また，卓上安定性，長期 【図2】 図 2 血漿中エンザルタミドおよび N- 脱メチル体の検量線（n = 2） 〇エンザルタミド，◇ N-脱メチル体． エンザルタミド 血漿中濃度 （μg/mL） （μg/mL）算出濃度 日内変動 （n = 5） 日間変動 （n = 5） 回収率 （n = 5） RSD （％） RE （％） RSD （％） RE （％） 25 25.00 ± 0.61 2.99 –0.84 5.74 –0.11 91.8 10 9.96 ± 0.02 0.46 7.02 5.65 0.72 95.5 0.5 0.49 ± 0.00 2.14 –1.27 5.63 –2.09 99.0 0.25 0.21 ± 0.00 3.05 –16.15 8.60 –13.36 –
RSD: relative standard deviation, RE: relative error.
N-脱メチル体 血漿中濃度 （µg/mL） （µg/mL）算出濃度 日内変動 （n = 5） 日間変動 （n = 5） 回収率 （n = 5） RSD （％） RE （％） RSD （％） RE （％） 25 25.03 ± 0.27 3.04 –1.64 5.91 –0.10 83.4 10 9.88 ± 0.02 0.43 6.21 5.67 0.64 91.3 0.5 0.51 ± 0.00 1.32 3.14 7.21 –1.51 89.1 0.25 0.23 ± 0.01 1.58 –5.34 10.06 –12.49 －
RSD: relative standard deviation, RE: relative error.
安定性，調製後安定性および凍結融解安定性の試 験においても，真度，精度はともに許容基準を満 たし，血漿中の各薬物の安定性が確認された（表 2）． 4．患者検体測定結果 CRPCと診断された男性患者の，エンザルタミ ド投与開始後 14 日目および 56 日目の血漿サンプ ルを測定して得られたクロマトグラムを図 3 A， B に示す．患者検体においても夾雑ピークの重な りはなく，IS，N-脱メチル体およびエンザルタミ ドのピークを検出することができた．カルボン酸 体と同じ保持時間を示すピークが観察されたた め，血漿中濃度を暫定的に換算したところ，14 日目は 1.2 μg/mL，56 日目は 3.2 μg/mL と算出さ れた．また，患者が服用していた併用薬はエンザ いことが確認された． エンザルタミド投与開始後 14 日目～154 日目（14， 28，56，84，119 および 154 日目）の血漿中濃度の 変化は図 3 C に示す通りであった．
考 察
FDAのガイドライン18）に基づくバリデーショ ンにより，本研究におけるエンザルタミドおよび N-脱メチル体のヒト血漿中濃度測定系の選択性， 再現性や血漿中での安定性が確認された．本測定 系の回収率はエンザルタミドでは 90％以上，N-脱メチル体では約 87％といずれも高く，濃度間 の差も小さいことを確認した．既報12）での回収 率は IQC サンプル（0.75，5.00 および 50.0 μg/mL） 安定性 （n = 3） エンザルタミド N-脱メチル体 RSD （％） RE （％） RSD （％） RE （％） HQC LQC HQC LQC HQC LQC HQC LQC 卓上安定性 1.24 0.52 3.36 –1.21 1.27 0.64 3.36 –0.98 長期安定性 1.40 3.13 2.14 –6.82 1.40 5.00 8.69 –3.65 調製後安定性 2.89 0.56 1.83 –1.58 2.92 1.20 1.88 –3.86 凍結融解安定性 2.20 3.83 –0.49 0.67 2.18 3.70 –4.58 –1.26HQC: high quality control （25 μg/mL）, LQC: low quality control （0.5 μg/mL）, RSD: relative standard deviation, RE: relative error.
表 2 血漿中エンザルタミドおよび N-脱メチル体の安定性
【図3】
図 3 患者検体の測定結果
1日 1 回 160 mg のエンザルタミドを経口投与した患者の投与開始より 14 日（A），56 日（B）の血漿サンプ ルを測定して得られたクロマトグラムおよび血漿中濃度推移（C）．IS: internal standard substance．● エンザル タミド，◇ N-脱メチル体．
90.4％，N- 脱 メチ ル 体 で 102.4％，90.1％および 95.5％であった．LC-MS/MS を用いた既報ではエ ンザルタミドで 100％，N-脱メチル体で 141％，13） 63.6～72.7％，14）および 77.2～115.2％15）であった． 以上のことから本測定系の回収率は既報と同等で あることが確認された． エンザルタミドおよび N-脱メチル体の定量に 関して，HPLC を用いて測定している既報12）の 定量範囲 0.5～50 μg/mL と比較して，本測定系で はより低濃度（0.25 μg/mL～）の測定が可能となっ た．LC-MS/MS を用いた既報14, 15）での定量下限は 0.02 μg/mLおよび 0.1 μg/mL と本測定系を大きく 下回るものの，より多くの臨床現場での利用が可 能な汎用 HPLC を用いた測定系のなかでは最も 良い感度を有する測定系の確立に成功した．さら に，HPLC を使用した既報12, 19）においてカルボン 酸体は検討されていないが，本測定系ではカルボ ン酸体がエンザルタミドおよび N- 脱メチル体と 分離できることを確認した．カルボン酸体は非活 性代謝物であり薬効に影響を与えないが，エンザ ルタミドおよび N-脱メチル体の定量や有害事象 の発現に影響する可能性は否定できない．本研究 ではエンザルタミドおよび N- 脱メチル体の同時 測定に着目したためカルボン酸体の定量は行わな かったが，LC-MS/MS を用いた測定系のなかには カルボン酸体を測定しているものもあり，14, 17）今 後，カルボン酸体の血漿中濃度を測定し，有害事 象発現等との関連を解明することも重要であると 考えられる．なお，本測定系条件でカルボン酸体 はエンザルタミド，N-脱メチル体および IS とも 分離できているが，カルボン酸体の定量への応用 に向けては夾雑ピークとの分離やバリデーション 基準を満たしていることの確認が必要である． 本測定系を用いて患者検体を測定した結果，カ ルボン酸体と思われるピークが確認されたもの の，夾雑の影響はなく，エンザルタミドおよび N-脱メチル体の定量に与える影響は少ないこと が確認された．さらに，併用薬によるエンザルタ ミドおよび N- 脱メチル体の定量への影響も認め られなかった．エンザルタミドは治療薬物濃度 モニタリング（therapeutic drug monitoring: TDM） 対象薬でなく，有効性の目標濃度は確立されてい ないため，血漿中濃度の妥当性はインタビュー フォームおよび既報を参考に判断した．既報4）に よると，日本人 CRPC 患者のエンザルタミド反 復投与における血漿中濃度は約 1 カ月で定常状態 に達し，エンザルタミドの血漿中濃度はおよそ 10～15 μg/mL であった．また，N-脱メチル体は 約 2 カ月で定常状態に至り，その血漿中濃度はエ ンザルタミドと同程度であった．4）ほかの既報に おいても同様の結果が報告されており，エンザル タミド 160 mg/日で投与された時の定常状態のト ラフ値は，エンザルタミドが 11.4 ± 2.95 μg/mL （n = 679），10） 10.7 ± 2.31 μg/mL（n = 26），12）N-脱 メチル体が 13.0 ± 3.78 μg/mL（n = 680），10）10.6 ± 2.03 μg/mL（n = 26）12）であった．これらの結果 と比較して本患者の測定結果は妥当な値であると 考えられる． 以上の結果は，HPLC-UV 法を用いた 20 分の 測定時間でエンザルタミドおよびその活性代謝物 N-脱メチル体の血漿中濃度を同時に測定できる こと，臨床においても本測定系が十分に利用可能 であることを示唆している．今回確立した測定系 の臨床応用に対する検討は，1 症例の血漿中濃度 の測定結果に基づくものであった．併用薬や病態 などにより測定条件の微調整が必要なケースも考 えられるため，今後，症例数を増やし，本測定系 が汎用性を有するものであることの確認が必要と 考えられる．さらに，エンザルタミドの適正使用 推進のため，未だ解明されていないエンザルタミ ドと N-脱メチル体の血漿中濃度と治療効果（PSA 無増悪生存期間，画像診断上の無増悪生存期間， および全生存期間により評価される7, 20））や有害 事象の発現との関連に関する検討が必要と考えら れる．すなわち，エンザルタミドで治療される患 者を対象に，治療日誌の記載や患者面談，カルテ 情報の収集を行い，PSA 値による有効性の確認と 副作用の出現時期・程度を把握し，エンザルタミ ドと N-脱メチル体の血漿中濃度との関連を解明 し，TDM の実施によるあるいは患者状態に合わせ たエンザルタミドの投与量調整が可能となれば， 日本人 CRPC 患者のエンザルタミドによる治療と QOLの改善に貢献することが大いに期待される．
利益相反
開示すべき利益相反はない．
引用文献
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