遺伝子発現の網羅的解析手法を用いたビタミンKの新規機能に関する研究

遺伝子発現の網羅的解析手法を用いたビタミンKの

新規機能に関する研究

著者

大崎 裕介

号

862

発行年

2005

URL

http://hdl.handle.net/10097/16432

氏

名(本籍)

学 位 の 種 類

学 位 記 番 号

学位授与年月 日

学位授与 の要件

研 究 科 専 攻

学 位 論 文 題 目

おお さき ゆ う すけ 大 崎 雄 介 博 士(農 学) 農 博 第862号 平 成18年3月24日 学 位 規 則 第4条 第1項 該 当 農 学研究 科 生物 産業創 成科 学 専攻 (博士課 程) 遺伝 子発 現 の網羅 的解 析 手 法 を用 い た ビタ ミンKの 新 規 機能 に関す る研究

論 文 審 査 委 員

(主 査)教 授 駒 井 (副 査)教 授 池 田 助教 授 北 澤 助教 授 白 川

三千夫

郁

男

春

樹

仁

論

文

内

容

要

旨

緒言

ビタミンK(K)は 、高等 生 物 にお いてK依 存 性 タンパ ク質 のグル タミン酸 残 基 を γ一カ

ル ボキシグル タミン酸(Gla)残 基 に変換 す る γ一グル タミル カル ボ キシラー ゼ(GGCX)に

必須 の補 因子 である(Fig.1)。 哺 乳 類 にお いてGla残 基 を含 む タンパ ク質(Glaタ ンパ

ク質)に は、プロトロンビンな どの血 液 凝 固因 子 や 骨 基 質 タンパ ク質 で あるオ ステオ カ ル シンなどが含 まれ ることか ら、Kは 血 液 凝 固や 骨 代謝 にお いて重 要 な役 割 を果 たし ている。しか しKの 生 体 内 分布 をみ ると血 液 凝 固 因子 産 生 の 場 である肝 臓 や 骨 以 外 にも精 巣 、脳 、膵 臓 、顎 下 腺 などにも高濃 度 で 存在 しているが 、これ らの組 織 にお ける Kの 役割 は明 らか となっていない。 Kは2一 メチル ー1,4一ナ フトキノンを骨 格 とし、3位 の側 鎖 の違 い によってい くつか の 同族 体 に分 類 される。フィチル 基 を側 鎖 とす るKIは 植 物 によって 生 産 され 、イソプ レニル 基 を側 鎖 とするK2は 主 に微 生物 によって合成 される。側 鎖 を持 たない化 学 合 成 品で あるK3も 含 め、K類 は 高 等 動 物 の組 織 内 にお いてK2の 一 種 であるメナ キノンー4 (MK-4)へ と特異 的 に変 換 され ることが 明らかとなってい る(Fig.2)。MK-4は ヒト白血 病 由来の細 胞 へ のアポ トー シス誘 導 、破 骨 細 胞 へ の分 化 抑 制 や アポ トー シス誘 導 、骨 芽 細胞 のアポトー シス抑 制 など他 のK類 には 見 られ ないMK-4特 異 的 な作 用 を有 し ていることが報 告 され ている。前述 の精 巣 、脳 、膵 臓 、顎 下腺 で はMK-4変 換 活 性 が 非 常 に高 いが 、これ らの組 織 にお ける変 換 の意 義 は未 だ 明 らか となって いない。以 上 のことか らK、 特 にMK-4に は未 知 の作 用 が存在 してい ることが 強 く示 唆 され ている。 近 年 、モデ ル生 物 のゲ ノムプロジェクトの成 果 としてDNAマ イクロアレイを用 いた トラン スクリプ トーム解 析 が 可能 となった。本 研 究 ではK充 足 度 の異 なるモ デ ル 動 物 を作 出 し、これ らの動 物 にお ける遺伝 子発 現 を網 羅 的 に解 析 す ることによって、Kの 新 規 作 用 を検 索す ることを 目的 とした。 第1章K充 足度 の異 なるモデ ル動 物 の作 出 第1節K欠 乏動 物 の作 出 組 織 中のK量 に依 存 して発 現 量を変化 させ る遺 伝 子 種 をスクリーニ ングす るに先 立 ち、K充 足 度 が異 なる組 織 サ ンプ ル を得るため に、K欠 乏 及 びK添 加 モ デ ル動 物 を 作 出 した。 Kは 腸 内細 菌叢 によって合成 され 、宿 主 はこれ を吸収 ・利 用 す ることか ら、実験 には 腸 内細 菌 の存 在 しな いWistar系 無 菌(GF)及 び 腸 内細 菌 を有 す るWistar系 通 常 (CV)ラ ット(雄、11∼12週 齢)を 用 いた。K欠 乏群 、コントロー ル 群 、K添 加 群 とに分 け、 それぞ れ に市 販K欠 乏飼 料(TD97053,HarlanTeklad社)、K欠 乏飼 料lkgあ た りに Klを0.75mg、75mg添 加 した飼料 を与 えて9日 間(GF群)ま た は21日 間(CV群)飼 育 した。欠 乏 状 態 の指 標 として 、血 液 凝 固 時 間で あるプ ロトロンビン時 間(PT)及 び活

性 化 部分 トロンボプラスチ ン時 間(APTT)を 測 定 した(Fig.3)。GFお よびcv欠 乏群 で はPT、APTTが ともに延 長 してお り、特 にGF欠 乏 群 で はほ ぼ 全 ての個 体 でPT、 APTTと もに60秒 を越 えていたことか ら重 篤 な血 液 凝 固不 全 の状 態 であったと推 察 さ れた。また蛍 光HPLC法 により肝 臓 、心臓 、腎 臓 、精 巣 、脳 、顎 下腺 中K濃 度 を測 定 し た(Table1)。 肝 臓 中K濃 度 はGF欠 乏 群 で最 低 値 を示 し、以 下低 い順 にGFコ ントロ ー ル群_{、CV欠 乏群 、CVコ ントロール 群 、GF添 加 群 、CV添 加 群 となっていた。他 の} 組 織 中K濃 度 もGF、CVと もにほぼ欠 乏群 、コントロー ル 群 、添加 群 の順 に組 織 中総 K濃 度 が上昇 してお り、またGFに 比 べ てCVラ ットの 方 がK濃 度 は高 値 を示 した。ま た、肝臓 お よび 心 臓 にお いては変 換 され て生 成 したMK-4よ りも飼 料 由来 のK1の 方 が高 い濃 度 で 存在 してお り、腎臓 ではKlとMK-4が 同程 度 、精 巣 、脳 、顎 下腺で は Klよ りもMK-4の 方 が 高 い濃 度 で存在 してい た。以 上 の 結 果 より、GF欠 乏 群お よび CV欠 乏群 で はK欠 乏 状 態 にあ り、特 にGF欠 乏 群 は重 篤 なK欠 乏 状 態 にあると考 えられた。 第2節MK-4欠 乏 動物 の 作 出 MK-4は 他 のK類 にはない特 異 的 な作 用 を有 す る可 能 性 が 示唆 され ているが、K 類 はMK4へ と変換 され ることか ら、組 織 中 のMK-4濃 度 を低 下 させ るた めには全 て のK類 の供 給 を無 くす 必 要 がある。しか し、このアプ ロー チ で は血 液 凝 固不 全などの K欠 乏症 を併 発 す ることか らMK-4特 異 的 な作 用 の 解 析 には 有 用 では なかった。とこ ろが、近年 加 工 油脂 の製 造 工 程 で行 なわれ る水 添 反 応 にお い てKlか ら生 じる2',3'一 ジヒドロフィロキノン(dK1)はK類 同様GGCXの 補 因子 として作 用 す るがMK-4へ と変 換 されないことが報 告 された(Fig.4)。 そこで 、本 実 験 で はdKlを 無 菌 ラットに与 えるこ とにより、血液 凝 固 不 全 を引 き起 こす ことな く組 織 内MK-4を 欠 乏 させ たモデ ル動 物 の 作 出を試 み た。 実験 にはWistar系 無 菌(GF)ラ ット(雄、5週 齢)を 用 い た。Kl群 、dK1群 とに分 け、 それぞれ に2mg宝g飼 料 のK1お よびdKlを 添 加 した飼 料 を与 え26日 間飼 育 した 後 に解 剖 に供 した。飼 育 期 間 中の体 重 お よび 解 剖 時 の肝 臓 重 量 、大 腿 骨 重 量 には 変 化 は認 め られ なか った。Gla化 活性 の評 価 を行 なうため にPTお よびAPTTを 測 定 し たところ、コントロール 群 と比 較 してdK1群 にお いてPT、APTTと もに若 干 ではあるも のの有 意 に延 長 していた(Fig.5)。 血 漿 、肝 臓 、精 巣 、脳 のK濃 度 を蛍 光HPLC法 に より測定 した ところ(Table2)、 肝臓 にお ける総K濃 度 はコントロー ル 群 と比 較 してdKl で約 半分 になってお り、dK1群 で見 られ た血 液 凝 固 時 間 の延 長 は肝 臓 中 の総K濃 度 を反 映したもので あると考 えられ た。精 巣 お よび脳 にお けるMK-4濃 度 はコントロール 群 と比較 してdK1群 では それ ぞれ3分 の1、7分 の1と な ってお り、有意 な低 値 を示 し た。以 上の結 果 か ら、dK1食 の給 餌 により重 篤 な血 液 凝 固 不 全 を引き起 こすことなく組 織 内MK-4濃 度 を低 下 させ たモデル 動 物 の作 出 に成 功 した。

第2章 遺伝 子 発 現 の網 羅 的解 析 によるK標 的遺 伝 子 の検 索

Kの 新規 作 用 に繋 がる知 見 を得 るため に、第1章 で作 出 したモデ ル ラットの組 織 内

にお いて 、K充 足 度 に依 存 して発 現 量 を変 化 させ る遺 伝 子 種 を検 索 す るた め に 、

DNAマ イクロアレイ法 を用 いて遺 伝 子 発 現 量 変化 を網 羅 的 に解 析 した。

K欠 乏群 、コントロール 群 、K添 加 群 の肝 臓 、精 巣 、心 臓 、脳 、腎 臓 よりトー タル

RNAを 抽 出 し、各 群 毎 にプ ー ル し、市 販DNAマ イクロア レイ(RatGeneFilters,

ResearchGenetics社)を 用 いて遺 伝 子 発 現 量 を網 羅 的 に解 析 した。スキャッタープ ロッ ト法 によって肝 臓 にお ける発 現 量 を解 析 した ところ、添 加 群 と比 較 して 欠 乏群 で発 現 量 が上 昇 していた遺 伝 子 種 に は 、α1一酸 性 糖 タンパ ク質 、α2一マ クログロブ リン、フィブリ ノーゲ ン、メタロチ オネインな ど一 連 の急 性 期 タンパク質 に属 す る遺 伝 子 が含 まれ てい た(Table3)。 また 、階 層 的 クラスター 分析 により解 析 を行 ったところ、添 加 群 では発 現 量 が低 く欠 乏群 で発 現 量 が上 昇 しているクラスター にお いて 、αド酸 性糖 タンパ ク質 お よびフィブリノー ゲンといった急 性期 タンパ ク質 が含 まれ て いた(Fig.6)。 これ らのうち、 α1酸性 糖タンパク質 、フィブリノーゲ ンγ鎖 、メタロチオネインー2の発 現 量 をノー ザンハ イブリダイゼ ーション法 により測 定 したところ、GF、CVと もにK欠 乏群 にお いて 、いず れも顕 著な発 現 上昇 が認 められ た(Fig.7)。 以 上 のことか ら肝 臓 で はK欠 乏 時 に急 性 期タンパ ク質 の発 現 が上 昇 す ることが示 され た。急 性 期 タンパ ク質 は 炎 症 時 に発 現 が 上昇 するが、この発 現 がK欠 乏 時 に上昇 していたことか ら、Kが 炎 症 を抑 制 す る可能 性 が考えられた。 また、スキャッター プ ロット法 によって精 巣 にお ける発 現 量 を解 析 した ところ、欠 乏 群 と比較 して添加 群 で発 現 量 が上 昇 していた遺 伝 子 種 にはcAMP生 成 、コレステロー ル 合 成 お よびイソプ レノイド代 謝 に関連 す るい くつか の遺 伝 子 が含 まれ ていた(Table4)。 精 巣 ではcAMPに よりステロイドホルモ ン合成 が促進 されることか ら、コレステロー ル 、 ステロイドホル モン合 成 経 路が 活性 化 している可 能性 が示 唆 され た。 第3章Kが 炎 症 に及 ぼす影 響 の解 析 第1節 リポポリサッカライド投 与 による炎 症 誘 導 ラットを用 いた検 討 K欠 乏ラット肝臓 にお ける遺 伝 子発 現 の網 羅 的解 析 か らKが 炎 症 を抑 制 す る可能 性 が示 唆 され た。そこで 」リポポ リサ ッカライド(LPS)投 与 による炎 症 誘 導 モ デ ル ラット を用 い、Kが 炎 症 に及 ぼ す影 響 について検討 を行 った。 Wistar/stdラット(8週齢 、雄)に コントロー ル飼 料 またはK添 加 飼 料 を与 えて10日 間 飼 育 した。LPSま たは 生理 食塩 水 を0.5mg'塩g体 重を腹 腔 内 投 与 し、18時 間 後 に腹 大 動 脈 より採 血して血 漿 を得 た。血 漿 中ALTお よびAST活 性 を測 定 した ところ、LPS非 投 与群 にお いては有 意 な差 は認 められなかったが 、LPS投 与 群 にお い て はコントロー ル 群 と比較 してK添 加 群 で有 意 な低 値 を示 した(Fig.8)。 また、定 量RTPCR法 によっ て肝臓 にお けるマクロファー ジ遊 走 阻止 因子(MIF)発 現 量 を測 定 した ところ、LPS投 ・

与群 にお いてコントロール 群 と比 較 してK添 加 群 で はMIF発 現 量 は 低 下していた (Fig.9)。K1ま たはMK-4を 単 回 投 与(10'5moレkg体 重)し たラットで はKに よる炎 症 抑制 効 果 は認 め られ なか った。以 上 の結 果 より、Kは 抗 炎 症 作用 を有 しているが、そ の効果 は長 期 的なKの 摂 取 によって発 揮 され ると考 えられ た。 第2節 培 養 細 胞 を 用 い た 検 討 Kの 抗 炎 症 作 用 を 詳 細 に 解 析 す る た め に 、ヒトマ クロフ ァー ジ 様 細 胞 をLPSで 刺 激 し た 際 に 誘 導 され るイ ン タ ー ロイ キ ン ー6(IL-6)発 現 量 を 指 標 とし て 検 討 した 。 培 地 中 に0、0.1、1、10μMのMK-4を 添 加 した とこ ろ 、濃 度 依 存 的 にIL-6発 現 が 抑 制 され た(Fig.10)。10μMのK同 族 体 を 添 加 した とこ ろ 、K1、dK1、MK-3、MK-4の い ず れ も 有 意 にIL-6発 現 量 を 低 下 させ た 。有 意 で は な か っ た がMK-7もIL-6発 現 量 を 低 下 させ た 。K類 の 側 鎖 構 造 と類 似 し た ゲ ラ ニ オ ー ル(GOH)、 フ ァ ル ネ ソ ー ル (FOH)、 ゲ ラ ニ ル ゲ ラ ニ オ ー ル(GGOH)、 フ ィ トー ル(FOH)、 ゲ ラ ニ ル ゲ ラ ニ ル ア セ ト ン(GGAc)を 添 加 した とこ ろ 、GGOHを 除 い てIL-6発 現 量 に 変 化 は 認 め られ な か っ た 。 Kが プ ロテ イン キ ナ ー ゼA(PKA)を 活 性 化 させ る とい う報 告 が あ る ことか ら 、1mMの ジ ブ チ リルcAMPを 添 加 した ところ 、有 意 なIL-6発 現 低 下 が 認 め られ た 。以 上 の ことか ら Kに よ る抗 炎 症 作 用 は 側 鎖 構 造 よ りも 骨 格 構 造 に よ る 寄 与 が 大 き く、PKAの 活 性 化 を 介 して い る 可 能 性 が 示 唆 され た 。 まとめ 本研 究 はKの 新 規 作 用 の検 索 を 目的 として行 われ た。K充 足度 の異 なるモ デル 動 物 を作 出し、組 織 内 の遺 伝 子 発 現 を網 羅 的 に解 析 した ところ、欠 乏 群 で は肝 臓 にお ける急性 期 タンパ ク質 の遺 伝 子 発 現 量 が上 昇 してい ることが 明 らか となった。また 、精 巣 ではステ ロイド産 生 や イソプ レノイド代 謝 に 関 わる遺 伝 子 種 の発 現 が 欠 乏群 と比 較 して添加 群 で上 昇 していた。ラットにお い てLPSに 誘 導 され る炎 症 がK添 加 食 の給 餌 によって抑 制 され たことか らKが 抗 炎 症 作 用 を有 して いることが明 らか となった。さらに ヒトマクロファー ジ様 細 胞 を用 い た検 討 の結 果 、Kの 骨 格 部 分 によるPKAの 活 性 化 を 介して抗 炎症 作用 が発 揮 され る可 能性 が示 唆 され た。

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liv巳r heart Iddney testls 5ubr悶ndlbubrbra諭

gland K1 def GFcoot sup 2.5ま0.8■1.1±0.29 4.2土O.4・2.6雲0.2邑 2494士558b933主73b で0ま4,9陰 2.7士1.49 147士17b 0.3士0.103.6土0.4邑1.9ま0.4魯 0,6ま0.4・N.D.厘N.D.睾 37土5.3b34土3,3b109士1.1h def Cvcont s叩 10圭5.2.3.7士1.68 22圭4.5■29圭3.0融 2862之6で,b4769士5.2b 25圭6,3置 3.8ま0.48 463士25b 12士3.0書0.4土O.2■6.7ま4.08 2.0土0,3邑1.9圭Oj・8.0土1.10 11Tt11ｰ137t12ｰ68D369ｰ MK4 def GFcoot sup N.D! N.D.ｰ 28士4,4b 1.4士0.18 5.0土O.3■ 270士19b 1.0土0.58 3.4土0.3■ 186士9.1h 99忠16■ .11ま0.6■77士3.2璽 137士4.3■29±1.2■145士42や 669土58b607士34吟660主24昌 d6「 CVmnt sup N,D! N.D.' 136士59b 10ま1.94.7土0.60 9.7士1.512土0.6■ 2065ま 曜264317土17h 212土13嗣48圭7.2■228士298 147士4.8P38ま2.1・402土23■ 1336±54b909士27塾1281土7砂 'Valuesaremean一ｱ一SEMpmoUgtissueof3-7-rats _.Values withdif「erentsuperscripts.a陀significan価yd爾erentatρ く 0.05.K1,vitaminK1;MK-4,menaquinone-4;GF,germfree group;CV,conventionalgroup,def,vitaminKdeficientgroup; vitaminK1;phylloquinone O 、 0 CH3 i _{ト H} ー 3 hydrogenation Y 2',3'一dihydrophylloquinone(dK1) 0 0 CHj it ト H ー 3 KIanddKIactasacofactor 。fγ刃1utamylca市bxylase converttoMK-4 menaquinone-4(MK-4) O CH3 i H σ4 notconverttoMK-4 Fig.4ThestrucEureof2',3'一dihydrophylloquinone(dK1).dKl actsasacofactorofy-glutamylcarboxylaseanddoesnot converttomenaquinone-4.

(8 ω ) ① ε 個芒 o 荒 葛 σ 8 35 30 Table2.vitaminKconcentrations.' 25 ロCont_■dK1 K1 pm◎1'mLorP而ol'gUssue dKIMK-4 to捻1 20 plasma ㎡ 1 。。 甑 5.6士1.88 0.2士0.2b N.D.a 3.3士1.Ob α4土0.2・6.2士2.O N.D.ｰ3.4t1.1 15 1蝉er

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Tahle4Genesupregulatedingermfreetestisgroups.' acc.No.NAMEKlsup/def 40 AA955508aderrylatecydase320.8 AlO29771adenylatecycla3e53.36 AA956889adenyfatecydase42.63 gA956815adenylatekinase22.16 gA859704aderrylatekinase32.43 AtO59291proteinkinase,cAMP-dependent,regulatory,type2,a3.78 AlO43867P【3teinkina5e,AMP菰lva燈d,γ1no剛jcsubu口 忙t62 AIO58589mevalonate(diphospho)decarboxylase3.08 AA9979581anosterolsyrnhase1.78 AA9649483吻 α一hydr剛s圃ddehydrogenase1.94 AA818329cytochromeP450,family11,subfamilya,polypeptide11.94 A1070588famesyitransferase,CAAXbox,a1.77 AIO7{807rヨbgeranylgeraπyl廿ansfbrasecornponenet、subunitα17.6 A1029123rabgeranylgeranyitransferasecomponenet,subunitp2.53 A1072276res-relatedasgoaatedwithdiabetes9.17 AA957963GDPdissoaationinhibitor25.17 30 20 ﹂ 、 ⊇ 10 一 T 贈 工 ゴ、 .」■ 1:』 一 ㌃;享恢 ㌣ 、,乙'

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supplement. (℃ ﹃ 硝 ) に 〇 一ω ω Φ ﹂ 6 7 0 ﹂ = ≧ Φ ︾ 鵠 O [Φ ﹂ ハ◎ 4 1 1 1.2 1.0 0.8 6 4 2 0 ハ U ∩ U 0 a b 口cor詑 口sup Fig.9EffectofvitaminKsupplementeddietonhepaticmRNA levelofmicrophagemigrationinhibitoryfactor(MIF)inducedby lipopolysaccharide(LPS)administration.Dataareexpressed asmeanfSEM,n=3-5.Valueswithdifferentlettersare significantlydi価erentatpく0.01.Cont,c◎ntrolgroup;sup, supplementgroup. A C (互 ￡ ) ` O 砺 ω 9 α X O り ﹂ 一 〇 ≧ 一 亜 ① ﹂ tz 0 8 6 4 2 づ む   ロ む む (O 一〇 一 ) 口 O 一ω ω O ﹂ α × ① ⑩ 1 ﹂ 一 〇 ︾ 寡 O 一⑩ ﹂ o.o LPS一 LPS+ 隅 a ■ ・ ab 凹 rFPP .、ド 一 b 一 ㍗ 「 「 b 転 評 一 .' ' ゐ ㌃{'rL 「"、, ,」「」 調 、 ・ 「 三レ獄' ㍉ ,いr'㌧ ∼ ' 幽 ` .㌧ 「、 ヒ 駈_rγ・気 , b 膏 」「 ヤ「互 「ヒ ㌔ ぐ ㌔ ㌃ ナ ジ ￡ T 一 屯二 、r戸 ド '」 臼 サ γ ・ 妬 」 く 一 ゴビ'- r 」 .r r ㍉' rボ ∵ 、で' }.「P る 髪ご P」 、Tr ,, .`窟'}b 「-.曲 」"」 「 ., 爵鰹 守 1F ■ ■ ■ 「 0 o.1110 MK-4concentration(NM) B 2 ﹂ β β 4 2 コ  コ む む     ワ (" 言 唱 ) ` O 一の の O ﹂ α × O ㊤ ﹂ 一 〇 ︾ 霜 〇 一Φ 一 o.a ac ﹂/ 犠 . , 此 撃 be 島 .乎 ﹁ b 望. b b }」 り.2 1.0 os 0.6 o.a C o.z o.o contMK4G◎HFOHGGOHPOHGGAc D (コ ￡ 言 2 の ω o ﹂ α x o 叩 目 ⑩ ︾ 一制 器 ﹂ cont 1.2 1.0 0.8 0.8 o.a os o.0 10μ納MK4 1mMdbrAMP K1 dKi MK-3MK-4MK-7 唱 十 十 十 十 Fig.10EffectofKoninterleukin-6(IL-6)mRNAlevelinducedbyLPSinhumanmacrophagicTHP-1cells.A,effectof concentrationofMK-40nIL-6expression;B,effectofKanaloguesonIL-6expression;C,effectofsidechainofK

論 文 審 査 結 果 要 旨

ビ タ ミンK(K)は,K依 存 性 タ ンパ ク質 の 翻 訳 後 修 飾(γ 一カ ル ボ キ シル 化,Gla化)に 必 須 の 補 因子 で あ り,血 液 凝 固や 骨 代 謝 な どに関 与 して い る。Kは3位 の側 差 に よ って 分 類 され,フ ィチ ル 基 を側 鎖 とす るKl,鎖 長 の 異 な るイ ソプ レニ ル 基 を側 鎖 とす るK2(メ ナ キ ノン ーn)な どが あ る。 高 等 動 物 で は摂 取 したK類 の 一 部 は組 織 内 で 紐 の一 種 で あ るメ ナ キ ノン ー4(MK-4)へ と変換 され る こ と が 明 らか とな って お り,MK-4は 他 のK類 に はな い 未知 の 作用 を 有 して い る 可能 性 が示 唆 され て い る。 本 研 究 で は,Kの 新 規 機 能 を 明 らか とす る こ とを 目的 と した。 無 菌 ラ ッ トにK欠 乏 飼 料 を給 餌 してK欠 乏動 物 を作 出 した 。また,無 菌 ラ ッ トに2',3'一 ジ ヒ ドロ フ ィ ロキ ノ ン(dK1)添 加 食 を 給 餌 して,重 篤 な 血 液 凝 固不 全 を伴 わ ず に組 織 内MK-4の み を欠 乏 させ た モ デ ル 動 物 を初 め て作 出 した 。 組織 内K充 足 度 に応 答 して発 現 量 に 変化 が 生 じた遺 伝 子 種 を検 索 した とこ ろ,肝 臓 に お い てK欠 乏 時 に α1一酸 性 糖 タ ンパ ク質,フ ィ ブ リ ノー ゲ ン,メ タ ロチ オ ネ イ ン な ど, 炎 症 時 に発 現 が 上 昇 す る急 性 期 タ ンパ ク質 の発 現 上 昇 が 認 め られ,Kが 炎 症 を抑 制 す る 可 能性 が 考 え られ た。 ま た,精 巣 で は コ レス テ ロー ル お よび テ ス トステ ロン合 成 に 関 わ る酵 素 の遺 伝 子発 現 がK欠 乏 時 に低 下 す る こ とが 認 め られ た 。 血 漿 中テ ス トステ ロ ン濃 度 を測 定 した とこ ろ,給 餌 飼 料 中K濃 度 に応 答 して上 昇 して い た こ とか ら,Kは 精 巣 に お い て テ ス トス テ ロ ン合成 に関 与 してい る こ・とが 示 唆 され た。 Kが 炎 症 に及 ぼ す 影 響 を解 明 す る た め,リ ポ ポ リサ ッ カ ライ ド(LPS)投 与 に よ る炎 症 誘 導 モ デル ラ ッ トを用 い て 検 討 を行 っ た。飼 料 中へ のKの 添加 に よ りLPSで 誘 導 され る血 漿 中 トラ ンス ア ミナ ー ゼ で あ るAHお よびAST活 性 の上 昇 が 抑 制 され た こ とか ら,Kが 抗 炎 症 作 用 を有 して い る こ とが 示 され た 。 また,ヒ トマ ク ロ フ ァー ジ様 細 胞 を用 い た 検 討 で は,KがLPS刺 激 に よ り誘 導 され るイ ン ター ロイ キ ン ー6(IL-6)発 現 を 抑 制 した こ とか ら,Kに よ る抗 炎 症 作 用 はIL-6発 現 の抑 制 を介 して い る 可 能 性 が 示 され た 。この効 果 はK同 族 体 に は認 め られ た が側 鎖 類 縁 体 に は認 め られ なか っ た こ とか ら, 抗 炎 症 作 用 に はKの ナ フ トキ ノ ン骨 格 が重 要 で あ る可 能 性 が示 され た 。 1本論 文 で はK充 足 度 の異 な るモ デ ル 動 物 を対 象 と し,遺 伝 子 発 現 の網 羅 的解 析 手 法 を用 い る こ とに よ りKの 新 規 機 能 の 解 明 を 試 み た結 果,抗 炎 症 作 用 や テ ス トス テ ロ ン合 成 へ の 関 与 とい うKに 関す る新 しい 知 見 が 明 らか に され た 。 よ って 審 査員 一 同 は,当 論 文 提 出者 に博 士(農 学)の 学 位 を授 与 す る に値 す る もの と判 定 した 。