細 菌 と高等植物 におけ る細胞 分裂 の制御機構 の分子遺伝学 的解析

1995年 度 神 奈 川 大 学 総 合 理 学 研 究 所 共 同研 究 成 果 報 告 プ ロ ジ ェ ク トC‑1

1.研 究 テ ー マ

細 菌 と高等植物 におけ る細胞 分裂 の制御機構 の分子遺伝学 的解析

2.代 表 者 名

応用生物科学科 助手 安積良隆

3.研 究 プ ロ ジ ェ ク トメ ン バ ー

学内:神 奈川大学 理学部 応用生物科学科 助手 安積良隆 神奈川大学 理学部 応用生物科学科 教授 鈴木秀穂 学外:横 浜市立大学 木原生物学研究所 遺伝進化学部門 助手 川上直人

1995年4月 〜1996年3月 5.研 究 の 目 的

生物 の増殖 や成 長 に細胞分 裂 は不可欠 であ る。 しか しこの細胞分裂 は適 した時期 、適 した 環境下 で行 わ れな ければ、その生 物 は重大 な危 機 に瀕 す るこ とにな る。細胞 分裂 の開始 や休 止 を制御 して いる し くみ を明 らか にす る ことは生命現象 を理解す る上 で非常 に重 要 な意義 を 持つ 。(計 画1)細 菌類 も栄養 条件 な どの環境 の変化 に対 応す るため細胞 分裂 の休止 や再 開 を行 うが比 較 的、細 胞の構成 が単純で ある に もかか わ らず、 この現象 が どの ような遺伝 子 に よって制御 されてい るか 明 らか にされていない。 この現象 に関 わ る遺伝 子 を突然 変異体 を作 出す る ことに よって単離す る。(計 画2)真 核 生物 では酵母で多 くの研 究が行 われてい る が、 高等植 物 では細胞 周期 に関す る研 究者 も少 な く、研 究 は進 んでい ない 。特 に減数分裂 は 材料 の調 達が難 しいた め減数分 裂誘導 の しくみ はほ とん ど何 もわか ってい ない。そ こで変 異 体の作成 、変異遺伝 子の 同定 が容易 な植物 シロイヌナズ ナを用 い るこ とに よ り卵 の形成 時 に 起 こる減 数分裂 の誘 導機構 を分 子遺伝 学 の手法 を用 いて解 明す る。(計 画3)受 粉 後、胚 形 成 を行 った穂 は季節 が来 るまで休 眠 に入 る。そ して環 境が整 うと発 芽 し発生 を開始す る。 こ の休 眠 と発 芽 を支 配 している遺伝 子 を解析す る。

一123一

6.成 果

計 画1に 関 して は 、大 腸 菌W3110株 を用 い て増 殖 期 か ら休 止期 へ の移 行(細 胞 分 裂 の 休 止)と 休 止 期 か ら増 殖 期 へ の移 行(細 胞 分 裂 の再 開)の 制 御 機 構 を調 べ た 。 まず休 止 期 か ら 抜 け 出せ な い(増 殖 期 へ の移 行 に必 要 な遺 伝 子 の)変 異体 を作 出す るた めW3110を ニ トロ ソグ ア ニ ジ ンで 処 理 し、 制 限温 度 下 で増 殖 で きな い 温 度 感 受 性 突 然 変 異 体 を得 た 。 こ れ らは 単 に制 限温 度 下 で は細 胞 分 裂 で きな い もの と休 止 期 か ら増 殖 期 へ 移 行 で きな い もの を含 ん で い る と考 え られ る。 そ れで 得 られ た変 異 体 を許容 温 度 で培 養 し増 殖 期 に入 った後 、 温 度 を制 限 温 度 に上 げ た。 増 殖 が 停 止 す る もの は 一 般 的 な細 胞 分 裂 の変 異 体 で 、影 響 を受 け な い の も の は増 殖 へ の 移 行 に変 異 が あ る もの と考 え られ る。 繰 り返 し確 認 の実 験 を行 い 、TSG11

1が そ の よ うな変 異 体 で あ る こ と を確 認 した 。 また 休 止 期 に移 行 で きな い 変 異体 を単 離 す る た め、 増 殖 期 に入 れ な い変 異体TSG111を 利 用 す る こ と に した 。TSG111に トラ ン ス ポ ゾ ンTn10を 導 入 し突 然 変 異 を誘 発 した後 、 休 止 期 に入 る まで増 殖 させ 制 限温 度 下 に 移 して プ レー ト上 で培 養 した 。休 止 期 に は行 っ たTSG111は 増 殖 期 に入 れ ない の で コ ロ ニ ー を形 成 で きな い 。 コ ロニ ー を形 成 す る もの はTn10の 挿 入 に よ り休 止期 に移 行 で きな

くな っ た変 異 体 で あ る と考 え られ る。 この よ うな変 異 体TIM1、TIM2、TIM3、

TIM4を 得 た 。 これ らの 変 異体 は長期 間培 養 した と き生 存 率 が 野 生 型 に比 べ 著 し く低 下 す る。 これ は休 止期 に入 れ ず細 胞 が 休 止 期 の細 胞 が持 つ耐 性 を獲 得 す る こ とが で きなか っ た め と考 え られ る。今 後 は これ らのTSG111、TIM1、TIM2、TIM3、TIM4の

変異 した遺 伝 子 の 同定 を行 い 、 そ の 遺伝 子 の機 能 を探 る予 定 で あ る。

計 画2で は シ ロ イヌ ナズ ナ を用 い て 高等 真 核 生 物 にお け る体 細 胞 分 裂 か ら減 数 分 裂 へ の転 換 の機 構 を調 べ る。 この た め に減 数 分 裂 へ の移 行 に関 す る突 然 変 異 体 を作 成 し、 そ の変 異 し た 遺伝 子 を単 離 し解析 す る こ とに よっ て 、 減 数分 裂 へ の細 胞 分 裂 様 式 の転i換期 には細 胞 内 で

どの様 な こ とが 起 こ り、 そ れが どの様 に調 節 され て い るか を明 らか にす る 。 この計 画 の 第 一 段 階 と して 卵 で 発 現 す る遺 伝 子 を単 離 す る こ とに した 。 こ の 目的 で デ ィ フ ァ レン シ ヤル デ ィ ス プ レイ法 を行 っ た 。 まず 、 シ ロ イヌ ナ ズ ナの 葉 と開花 後 の花 全 体 と開花 前 の若 い つ ぼみ か

ら摘 出 した 雌 しべ か らRNAを 抽 出 した 。3種 類 の1次 プ ライ マ ー を用 い て 、 そ れ ぞ れ の RNAか ら逆 転 写 を行 いPCRの 鋳 型 を用 意 した。 これ らの鋳 型 を もと に3種 類 の1次 プ ラ イマ ー と16種 類 の2次 プ ラ イマ ーの48種 類 の組 み合 わせ でPCR反 応 を行 った 。 こ れ ら のPCR産 物 をシ ー クエ ンス ゲ ル 電気 泳 動 に よっ て分 離 しそ れ ぞ れ のPCR産 物 の組 織 特 異 性 を調 べ て み た 。最 初 の デ ィ フ ァ レン シ ャル デ ィス プ レイ で 全 部 で2582の 産 物 を確 認 す る こ とが で きた が 、 そ の 中で 若 い 雌 しべ に特 異 的 と考 え られ る もの は242個 で あ っ た 。 こ れ らの 産物 の組 織 特 異性 を確 認 す るた め に82個 を選抜 し、 デ ィフ ァ レ ンシ ャルサ ザ ンハ イ ブ リ ダ イゼ ー シ ョ ンを行 っ た 。82個 の うち有 力 と考 え られ る もの10個 につ い て 、 さ ら に 組 織 特 異性 を確 認 す る た め に ノ ー ザ ンハ イブ リ ダ イゼ ー シ ョンの実 験 を行 っ た 。 この うち5 個 の 産 物 に関 して は雌 しべ の み に特 異 的 で あ る こ とが確 認 さ れ た 。残 りの5個 の もの に 関 し

て は ノ ーザ ンハ イ ブ リダ イ ゼ ー シ ョンの感 度 以 下 で確 認 す る こ とが で きな か った 。 以上 の結 果 か ら雌 しべ で特 異 的 に発 現 す る遺伝 子 のPCR産 物 を得 る こ とが で きた の で 、今 後 は これ らの 遺伝 子 が 発 現 す る細 胞 の特 異 性 を決 定 し、 卵 で 特 異 的 に発 現 す る遺 伝 子 を同定 す る。 こ の 遺 伝 子 の 発 現 調 節 領 域 をGUS遺 伝 子 の よ うな リポ ー ター遺 伝 子 と組 み 合 わ せ 、 卵 の マ ー カ ー遺 伝 子 を作 製 す る。 計 画2の 第 二段 階 と して は この卵 の マ.̲̲..カー遺伝 子 の 発 現 の 有 無 を

一124‑̲

手 が か りに 、卵 の 減 数 分 裂 へ の 移 行 に 関す る突 然 変 異 体 を選 抜 す る。 そ して最 終 段 階 で は 変 異体 の 変 異 した 遺 伝 子 を 同 定 し、 そ の機 能 や発 現 調 節 の 機 構 を明 らか にす る こ とに よ り、 減 数分 裂 が どの よ うに 誘 導 され そ の細 胞 内 で は何 が起 こ っ て い るか を明 らか にす る。

計 画3で は 、 休 眠 をす る正 常 な系 統 の小 麦 と休 眠 を しな い小 麦 の 突 然 変 異株 を用 い て 、 休 眠 して い る細 胞 が 再 び活 発 に細 胞 活 動 を活 性 化 し、 細 胞 分 裂 を再 開 す る し くみ を調 べ た 。 完 熟 時 の 種 子 で 発 現 す る遺 伝 子 に こ れ らの小 麦 の 問 で 差 異 が 認 め られ るか ど うか を、 無 細 胞 翻 訳 系 を用 い てmRNAか ら タ ンパ ク質 を合 成 し2次 元 電 気 泳 動 に よ っ て分 析 した とこ ろ 、 変 異 体 で は種 子 の 完 熟 時 に 蓄 積 しない タ ンパ ク 質 が存 在 す る こ とが 確 認 さ れ た 。 この タ ンパ ク 質 が 休 眠 を引 き起 こす 可 能 性 が 考 え られ る。 こ の タ ンパ ク質 の遺 伝 子 を デ ィ フ ァ レ ン シ ヤ ル ス ク リー ニ ン グ法 を用 い る こ と に よっ て ク ロー ニ ン グす る こ とに成 功 した 。 この ク ロ ー ン を 用 い て この 遺 伝 子 のmRNAの 蓄積 量 の 経 時 的 変 化 を調 べ て み た と こ ろ 、 この 遺伝 子 の mRNAは 正 常 な小 麦 で は種 が 熟 す る に つ れ て 蓄積 量 が 増 加 して い たが 、休 眠 しな い 変 異株 で は や は り蓄積 が 認 め られ な か っ た。 今 後 は この 遺 伝 子 産 物 の働 き を解 明 して 行 こ う と考 え て い る。

7.成 果 発 表 学 会 発 表

第18回 日本 分 子 生 物 学 会

1995年12月6日 〜9日 、 名 古 屋 、 名古 屋 国 際 会 議 場

3P‑135

DiIlcrcntialDisplay法 に よ る シ[7イ ヌ ナ ズ ナ の 雌 し べ 特 異 遺 伝 子 の ク ロ ー ニ ン グ

○ 小 禁 邦 宏 、 高 師 知 紀 、安 磧 良 隆 、 鈴 木 秀 穂 (神 奈 川 大 ・理 ・応 用 生 物)

CloningofPistil‑SpecificgenesofArabidopsisfhalianaby DifferentialDisplay

Ok.Koshiba,T .Takasi,Y.Azumi,H.Suzuki (Debt.ofBiol.Sci.,KanagawaUniv.)

本 大 会 で の 当 グ ル ー プ の も う一 つ の演 題(高 師 ら、 神 奈 川 大 ・理 ・応 川 生 物)と 同 じ 日的 で 、雌 しべ 特 異 遺 伝 子 の 単 離 を別 の 方 怯 で 試 み た 。 ま ず シ ロ イ ヌナ ズ ナ の 雌 しべ(開 花前 の 若 い つ ぼ み か ら雌 しべ の み を摘 出 した もの)、 ヱ旦(開 花 後 の 花 全 体)、 及 び韮 か らtotalRNAを 準 備 し た 。 こ れ らのRNAを 鋳 型 と し、 市 販 の キ ッ ト(RNAimageTMKit:

Genllunter社)を 用 い てDifferentialDisplayを 行 った 。 その 姑 果 、雌 し ぺ の み に 、 あ る い は 雌 しべ に 多 量 に 一fir̲する と 考 え られ るmRNAの

PCR産 物 の パ ン ドが 多 数 砕 認 さ れた 。 そ れ ら の バ ン ド部 分 のDNAを 再 増 幅 し、 雌 しべ 、 花 、 及 び 葉 か らのlocalRNAを も と に して作 製 した ブ ロー ブ をハ イブ リ ダ イズ させ る、DifferentialSouthernHybridization を行 った 。 さ らに 確 認 の た め 、 再 増 幅 産 物 か ら ブ ロ ー ブ を網 製 して 雌 し ぺ 、花 ,及 び 葉 のRNAに 対 してNothpmllybridizalionを 行 った が 、 こ れ らの 産 物 は 高 師 らに よっ て 褥 ら れ た ク ロ ー ン の 遺 伝 子 よ り も若 い 雌

しべ で 発現 す る遺 伝 子 に 由 来 す る もの と考 え ら れ る 。

一125一

日本 植 物 生 理 学 会1996年 度 年 会

1996年3月27日 〜29日 、鹿 児 島 、

鹿児島大学教養部

1aHO1

シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ の 雌 しべ 特 異 遺 伝 子 の 解 析 安 積 良隆 、高師 知紀 、小 柴邦 宏、鈴 木秀 穂

(神奈 川 大 ・理 ・応 用生物)

我 々 は 高 等 植 物 の 雌 性 配 偶 子 で あ る 卵 の 形 成 過 程 に 興 味 を 持 ち 、 こ の 過 程 に 関 わ る 遺 伝 子 を シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ よ り ク ロ ー ン 化 し 、 そ の 性 質 を明 らか に す る こ と に した 。 そ の た め に 二 つ の 方 法 を 採 用 した 。 一 つ は サ ブ トラ ク シ ョ ン法 に よ る雌 し べ 特 異 遺 伝 子 が 濃 縮 され たcDNAラ イ ブ ラ リー の 作 製 で 、 雌 しべ のcDNAよ り葉 で も 発 現 して い る 遺 伝 子 のcDNAを 除 い た 。 この ラ イ ブ ラ リ ー よ りデ ィ フ ァ レ ン シ ャ ル ス ク リー ニ ン グ に よ っ て 雌 しべ 特 異 遺 伝 子 を 選 抜 す る 。 も う 一 つ の 方 法 は デ ィ フ ァ レ ン シ ャ ル デ ィ ス プ レ イ 法 に よ る 区 画 化

さ れ たcDNAの 比 較 で あ る 。 この 方 法 で は 、 蕾 中 の 若 い 雌 しべ 、 開 花 後 の 花 全 体 、 お よ び 葉 か ら

RNAを 抽 出 し 比 較 を 行 っ た 。 これ ら二 つ の 方 法 に よ っ て 得 られ たcDNAの 遺 伝 子 の 発 現 の 特 異 性 を ノ ー ザ ンハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン に よ っ て 調 べ た と こ ろ 、6つ のcDNAは 若 い雌 し べ で の み 発 現 して い る 遺 伝 子 に 由 来 して い る こ とが 確 か め ら れ た 。 今 後 こ れ ら の 遺 伝 子 の 発 現 の 細 胞 特 臭 性 をinsituhybridization法 に よ っ て 解 析 す る.

1pHO2

コム ギ種 子発 達 過程 に お ける休 眠関 連遺 伝 子 の発 現 1皿上直ム 、野 田 和彦 覧(横浜 市大 ・木原 生研 、1岡 山大 ・ 資 生研)

休 眠 を 持 つ 正 常 系 統 の コ ム ギ 種 子 胚 に は 存 在 す る が 、 完 熟 時 に 休 眠 を 示 さ な い 突 然 変 異 体 の 種 子 胚 に は 蓄 積 し な い タ ンパ ク 質 、"ポ リペ プ チ ドe"を 見 い だ し た 。 種 子 発 達 過 程 に お け る ポ リ ペ プ チ ドe遺 伝 子 の 発 現 様 式 を 調 べ る た め 、ポ リ ペ プ チ ドeの 完 全 長cDNAを 単 離 し た 。 ス ク リ ー ニ ン グの 過 程 で 、 ポ リ ペ プ チ ドecDNA と70%程 度 の 相 同 性 を 持 つ2種 のcDNAも 得 た 。 ポ リ ペ ブ チ ドe遺 伝 子 の 発 現 は 胚 の 形 態 形 成 終 了 後 、水 分 の 減 少 と と も に 明 ら か と な り 、成 熟 過 程 で 増 加 し た 後 減 少 した.こ の 発 現 量 の 変 化 は 、 胚 に お け るABA量 の 経 時 的 変 化 と 一 致 す る 。と こ ろ が 、ポ リ ベ プ チ ドeのmRNA 量 は 胚 をABAで 処 理 して も 増 加 せ ず 、 未 熟 種 子 お よ び 一 度 吸 水 した 休 眠 種 子 を 乾 燥 さ せ る と 増 加 し た

。低 湿 度 下 で 成 熟 した コ ム ギ 種 子 は 、高 湿 度 下 で 成 熟 した 種 子 よ り も 強 い 休 眠 性 を 示 す こ とが 知 られ て い る 。した が っ て 、 ポ リペ ブ チ ドeが 種 子 の 休 眠 性 に 役 割 を 担 っ て い る 可 能 性 が あ る 。

一126一