生体高分子ゲルの転移過程における環境効果に関す る研究

九州大学学術情報リポジトリ

Kyushu University Institutional Repository

生体高分子ゲルの転移過程における環境効果に関す る研究

金谷, 晴一

九州大学工学応用理学

https://doi.org/10.11501/3075449

出版情報：Kyushu University, 1993, 博士（工学）, 課程博士 バージョン：

σ 

生体高分子ゲルの転移過程における 環境効果に関する研究

平 成 6 年 1 月

金 谷 晴 一

目次

第 l章 序 論

1 ‑ 1  

本研究の背景・・

1 ‑ 1 ‑ 1  

ゲル・

1 ‑ 1 ‑ 2  

加圧処理によるタンパク質のゲル化‑

1 ‑ 1 ‑ 3  

生体高分子と水‑

1 ‑ 1 ‑ 4  

ゲルのガラス化・‑

1 ‑ 2

本研究の目的・

1 ‑ 3  

本論文の構成・・

‑2 

・2

・5

・

5

・7

‑9 

・

9

第

2

章 試 料 及 び 測 定 方 法 ・

2 ‑ 1  

緒 言

2 ‑ 2  

試 料

2 ‑ 2 ‑ 1  

筋原線維タンパク質アクトミオ.シン

2 ‑ 2 ‑ 1 ‑ 1  

アクトミオシンの物性

2 ‑ 2 ‑ 1 ‑ 2  

アクトミオシンの加熱ゲル化過程

2 ‑ 2 ‑ 2

卵白

2 ‑ 2 ‑ 2 ‑ 1  

卵白の物性

2 ‑ 2 ‑ 2 ‑ 2  

卵白のゲjレ化過程

2 ‑ 3  

光学的測定

2 ‑ 3 ‑ 1  

光散乱の理論

2 ‑ 3 ‑ 2  

時間分解濁度スペクトル測定

2 ‑ 4  

重量・体積同時測定

2‑5  時間分解小角X散乱実験・・・・・

2‑6  走査型電子顕微鏡による形態観察 2‑7 広角X線回折実験・・

1 i η L nUつ‑vnJつノ

‑ ‑ U

門 / 門 / 勺 i Q U Q J Q υ Q υ Q υ Q U

つ ノ

U

1 i 1ょ

1 i 1 i 1 i 1 i 1 1ム 句i 1

ム1i︑iっ

L n L q d q J A

斗

第3章 筋 原 線 維 タ ン パ ク 質 の ゲ ル 化 過 程 ・

3 ‑ 1  

緒 言

3 ‑ 2  

実 験

3 ‑ 2 ‑ 1  

試料の調製

3 ‑ 2 ‑ 2  

時間分解濁度スペクトル測定セル

3 ‑ 2 ‑ 2 ‑ 1  

加熱セル

3 ‑ 2 ‑ 2 ‑ 2  

低圧領域の加圧セjレ

3 ‑ 2 ‑ 2 ‑ 3  

高圧領域の加圧セル

3 ‑ 2 ‑ 3  

走査型電子顕微鏡による形態観察

3 ‑ 3  

結果及び考察

3 ‑ 3 ‑ 1  

加熱処理によるゲル化過程

勺J

A 斗AせA‑にJにd勺i門/ハUハUハUハUA生A斗 A q A斗 ・

4 4 A性A斗A

性 に

υ民

υF hυ Fh υ

3 ‑ 3 ‑ 1 ‑ 2   T ' g

の決定・. • . • . 

3 ‑ 3 ‑ 1 ‑ 3   T ' g

に対するpHと

N a C l

濃度の影響・

3 ‑ 3 ‑ 1 ‑ 4  

温度ジャンプ実験

3 ‑ 3 ‑ 2  

加圧処理によるゲノレ化過程

3 ‑ 3 ‑ 3  

走査型電子顕微鏡による形態観察

3 ‑ 4  

結論

. 5 3  

・

5 5

・

5 8 .  6 3  

・

6 9

・

6 9

第 4章 筋原線維タンパク質のゲルーガラス様転移における溶媒効果. . 

. 7 5   4 ‑ 1

緒 言 ・ . . . . • • • . . . 

. 7 6   4 ‑ 2

実 験 ・ . . . . • . . . • • . . . 

. 7 6   4 ‑ 2 ‑ 1

試 料 の 調 製 ・ . . . . • • . . . . • . . 

. 7 6   4 ‑ 2 ‑ 2  

測 定 . . . • . . . • . . . • . . 

. 7 7   4 ‑ 3  

結 果 及 び 考 察 . . . . • • . . . •

. 7 7   4 ‑ 4  

結 論 . . • . . . ..  .・・・・・・・・

8 2

第 5章 卵白のゲルイヒ過程・. . • . . . . • . . • . . . • • • . . . 

. 8 3   5 ‑ 1  

緒 言 ・ . . . . • . . .・・・・・・・・

8 4 5 ‑ 2  

実 験 ・ . . . . ..  .・・・・・・・・

8 4 5 ‑ 2 ‑ 1  

試 料 の 調 製 ・ . . . . • . . . • ..  ...・・・

8 4 5 ‑ 2 ‑ 2  

時 間 分 解 濁 度 ス ペ ク ト ル 測 定 . . • ..  ..  . . ・ ・ ・ ・

8 4 5 ‑ 3  

実 験 結 果 . . . . • . . . • . . • • • • • . . . . •

. 8 5   5 ‑ 3 ‑ 1  

温 度 変 化 ・ . . . . • . . . • • . . . .・・・・

8 5 5 ‑ 3 ‑ 2  

温 度 ジ ャ ン プ 実 験 ・ . . . . • .・・・・・・・・・・

8 8 5 ‑ 3 ‑ 3  

圧 力 ジ ャ ン プ 実 験 ・ . . . . • .・・・・・・・・・・

8 8 5 ‑ 4

考 察 ・ . . . . • . . .・・・・・・・・

9 4 5 ‑ 4 ‑ 1  

加 圧 に よ る タ ン パ ク 質 の 変 性 ・ . • . • • . . • . . .・・・・

9 4 5 ‑ 4 ‑ 2

実 験 結 果 の 考 察 ・ . . . . • . . • . . . •

. 9 9   5 ‑ 5  

結論・. . . . . • . . . .・・・・・・・

1 0 6

第

6

章 卵 白 の ゲ ル ー ガ ラ ス 様 転 移 と 変 性 処 理 ・ . . . . • . 

1 0 7  

6 ‑ 1  

緒言・ .. . . .・・・・・・・・

1 0 8

6 ‑ 2

実験・. . . • • • • . • • • . • • . . • • • • • • • • • • • •

1 0 8  

6 ‑ 2 ‑ 1  

試料の調製・. . . . ..  ...・・

1 0 9

6 ‑ 2 ‑ 2  

測定・. . . • . . . . • . . • . . • . . • . .・・・・・・

1 0 9

6 ‑ 3  

実験結果・. . . . • . . . ..  ^，  .・・・・・・

1 0 9

6 ‑ 3 ‑ 1  

濁度・重量同時測定・.. . . . • • . .・・・・・・・・・

1 0 9

6 ‑ 3 ‑ 2  

巨視的物性測定・・. . . . .・・・・・・・・・・

1 1 5

6 ‑ 3 ‑ 3  

時間分解小角

X

線 散 乱 実 験 ・ . . . . ..  ....・・・・・

1 1 5

6 ‑ 3 ‑ 4  

走査型電子顕微鏡による形態観察・. .  ...・・

1 1 8

6 ‑ 3 ‑ 5

広角

X

線 回 折 実 験 ・ . ...・・・・・・・・・・

1 2 7

6‑4 考察・・・

6‑5 結論・・

第7章 卵白のゲルーガラス様転移における溶媒効果 7‑1  緒言・・

7‑2  実 験 . • . 

7‑2‑1  試 料 の 調 製 . .  7‑2‑2  測 定 ‑

7‑3  結果及び考察・・

7‑3‑1  試料のVTRイ メ ー ジ

7‑3‑2  走査型電子顕微鏡による形態観察‑

7‑3‑3  広角X線回折実験 7‑3‑4  重量・体積同時測定・

7‑4 結論・・

第

8

章 総 括 参考文献 発表論文リスト

口頭発表リスト

本論文の各章と発表論文の関係 謝 辞

. 127 

・129 . 134 

・135

・135 . 135 

・136

・136 . 136 

・138

・138 . 138 

・150 . 152  . 156  . 159  . 162  . 167  . 169 

第 l 章

序 論

1‑1  本 研 究 の 背 景

生 体 高 分 子 の ゲ ル 化 、 及 び 最 近 認 識 し 始 め ら れ た ガ ラ ス 化 と い っ た 物 性 変 化 の 研 究 は 、 医 学 ・ 生 物 学 と 物 理 学 の 境 界 領 域 で あ る。例 え ば 、 医 学 の 分 野 で は 、 血 液 の 凝 固1)や人工筋肉としてのアクチュエータ:2)等、また、生物学の 分 野 で は 、 微 生 物 ・ 酵 素 の 固 定 等 が あ げ ら れ る 。 一方、物理学の分野では、

ゲ ル の 構 造3‑8)及 び レ オ ロ ジ ‑ 的 性 質9，10)に つ い て 様 々 な 研 究 が な さ れ て い る 。 さ ら に 応 用 上 は 、 高 分 子 工 業 の 分 野 で は 、 衝 撃 緩 衝 材 や コ ン タ ク ト レ ン ズ 、 衛 生 用 品 の 開 発11)等 が あ げ ら れ 、 ま た 食 品 工 業 の 分 野 で は 、 食 品 の 機 能 的 特 性 で あ る 「 硬 さ

J i

軟 ら か さ 」 と い っ た テ ク ス チ ャ や 保 水 性 に つ い て の 研 究 が 活 発 に な さ れ て い る 12)。 特 に 、 こ う し た 生 体 高 分 子 に お け る ゲjレ化及びガラス 化 と い っ た 転 移 現 象 に お け る 環 境 効 果 を 調 べ る 事 は 、 そ の 機 構 解 明 を 可 能 と す る ば か り か 、 医 療 、 食 品 等 の 分 野 で の 応 用 に 著 し い 進 展 が 期 待 さ れ る 。

こ こ で は 本 研 究 の 内 容 に 深 く 関 係 す る ゲ ル 及 び ガ ラ ス に つ い て そ の 概 要 を 以下に述べる。

1‑1‑1  ゲル

ゲルは、 「 あ ら ゆ る 溶 液 に 不 溶 の 三 次 元 網 目 構 造 を も っ 高 分 子 及 び そ の 膨 潤 体 」 と 定 義 さ れ て い る13)。 ゲ ル の 網 目 構 造 を 膨 潤 さ せ て い る 溶 媒 が 、 水 で あ

る か 有 機 物 質 で あ る か に よ っ て 大 き く ハ イ ド ロ ゲ ル と オ ル ガ ノ ゲ ル に 分 類 さ れ る 。 我 々 の 身 の 回 り に あ る ほ と ん ど の ゲ ル は ハ イ ド ロ ゲ ル で あ り 、 ゆ で 卵 、

こ ん に ゃ く 等 多 く の 食 品 や 吸 水 性 高 分 子 が こ れ に 当 た る 。 一方 、 オ ル ガ ノ ゲ ル に は 、 衝 撃 吸 収 材 な ど の シ リ コ ン オ イ ル を 溶 媒 と す る ゲ ル 等 が あ る 。

Table1‑1に ゲ ル の 分 類 を 示 す11)。

高 分 子 間 の 水 素 結 合 や ク ー ロ ン カ あ る い は 配 位 結 合 に よ っ て 橋 架 け 形 成 を す る も の を 物 理 ゲ ル と 呼 び ¥ 寒 天 、 ゼ ラ チ ン 等 、 天 然 に 存 在 す る ゲ ル の 多 く

はこの様に合成される。

ま た 、 生 体 を 構 成 し て い る 大 部 分 も ゲ ル で あ り 、 構 成 物 質 は 多 糖 類 と タ ン パ ク 質 に 分 類 で き 、 こ れ ら は 生 体 内 で 、 皮j討 を 始 め 角 膜 や 硝 子 体 、 軟 骨 等 の 組 織 の 構 成 因 子 と な っ て い る 。 一 方 、 生 体 か ら 取 り 出 し た 天 然 由 来 の 高 分 子 物 質 を 用 い て 人 工 的 に 作 る ゲ ル を 天 然 高 分 子 ゲ ル と 呼 ぶ 。 主 な ゲ ル 形 成 能 を

T a b l e  1 ‑ 1.ゲルの分類

11)

固相一液相 ハ イ ド ロ ゲ ル 水

オルガノゲル 有機溶媒 リポゲル 油性溶煤

構成する相 アルコゲル アルコール

と溶媒 固相一気相 キセロゲル ^{こフこ'c左メ~}

、

アエロゲル ^{二7工'cニ左メ言'"} 

国相‑固相 ポリマーゲル ポリマー ゲルゴム ポリマー

天然ゲル タンパク質ゲル、多糖ゲル、生きているゲ ル、再構成されたゲル

構成高分子 合成ゲル 有機高分子ゲル、無機ゲル

ハイ ブリッドゲル 多糖と合成高分子、タンパク釘と合成高分 子

網目の形成 共有結合

分子間結合 クーロン力 水素 結 合 配 位 結 合

大きさ ミクロゲル 分子内橋架け構造

マクロゲル 分子間橋架け構造 (通常のゲル)

T a b l e   1 ‑ 2 .

ゲルイヒ能を持つ天然高分子11) 

多 糖 類

非 電 解 質

電 解 質

ル ス ス ス

︒ ヒ 一 一 一 ロ ロ

ロロプルルルシセセセキルロルロチ

ト チ ド メ ニメ ヒ

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ン 体

マ 郡 山 屯

ン ト 誘 プ ク 素 ン ラ 維 デ ガ 繊

ペ ク チ ン 酸 ペ ク チ ニ ン 酸 ア ル ギ ン 酸 寒天

カラギーナン プロテオグリカン グリコプロテイン ラ ン ダ ム コ イ ル 一 一 ゼ ラ チ ン

球 状 タ ン パ ク 質 タンパク質系

アクチン チュープリン ヘ モ グ ロ ビ ンS

インスリン フィブリン 卵 白 ア ル ブ ミ ン 血 清 ア ル ブ ミ ン

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天 然 高 分 子 ゲ ル を 構 成 す る 網 目 は 、 生 体 高 分 子 と 同 様 に 多 糖 類 と タ ン パ ク 質 に 大 別 で き る 。 多 糖 類 は 高 分 子 量 に な る と 橋 架 け 点 を 導 入 し な く て も 分 子 同 士 が か ら み 合 っ て ゲ ル 化 す る 。 こ れ ら の ゲ ル は 食 品 の 増 粘 剤 、 ゲ ル 化 剤 と

し て 食 品 工 業 の 分 野 に お い て 広 く 用 い ら れ る 。

1‑1‑2  加 圧 処 理 に よ る タ ン パ ク 質 の ゲ ル 化

1914年、 Bridgmanに よ り 加 圧 処 理 に よ っ て タ ン パ ク 質 が ゲ ル 化 す る と い う 事 が 報 告 さ れ た14)。 そ の 後 、 最 近 の 高 圧 技 術 の 進 歩 に よ り 、 多 く の 工 業 分 野 で 高 圧 が 利 用 さ れ る 様 に な っ て き た が 、 医 学 ・ 薬 学 ・ 生 物 学 ・ 食 品 科 学 等 い わ

ゆ る バ イ オ サ イ エ ン ス へ の 高 圧 利 用 は 、 ま だ 未 開 拓 の 分 野 と し て 残 さ れ て い る。

し か し 、 高 圧 下 で の 生 物 現 象 に 対 す る 関 心 は 世 界 的 に 高 く 圧 と 食 品 及 び バ イ オ テ ク ノ ロ ジ ー に 関 す る シ ン ポ ジ ウ ム 等 が 数 多 く 行 わ れ 、 こ の 分 野 の 研 究 の 発 展 を 伺 い 知 る 事 が で き る15・17)。 そ し て 、 す で に 果 実 ジ ャ ム の 加 工 と 汁 の 味 の 改 良 で 実 用 化 に 成 功 し て い る18)。加熱処理と異なり、高圧処埋では食 品 素 材 の 栄 養 素 や 風 味 を 損 な う 事 な く 加 工 ・ 殺 菌¹⁹⁾が可能である。

1‑1‑3  生 体 高 分 子 と 水

食 品 等 の 生 体 高 分 子 ゲ ル の 主 要 な 構 成 成 分 は 水 で あ り 、 食 品 の 物 性 や 機 能 を 決 定 す る 重 要 な 因 子 と な っ て い る²⁰⁾。 特 に 、 高 圧 下 に お い て は 、 水 は 圧 力 媒 体 と し て だ け で な く 、 水 素 結 合 、 疎 水 結 合 、 静 電 的 相 互 作 用 の 改 変 を 通 し て 、

タ ン パ ク 質 や 多 糖 類 の 構 造 と 機 能 に 影 響 を お よ ぼ し て い る21)。 そ れ ゆ え 、 食 品 系 へ の 圧 力 の 作 用 機 構 を 理 解 す る た め に は 、 生 体 高 分 子 と 水 の 相 互 作 用 、 す

な わ ち 水 和 に 対 す る 知 識 が 必 要 と な る 。

タ ン パ ク 質 等 の 生 体 高 分 子 が 水 に 接 触 す る と 、 図1‑1に 示 す 様 な 、 い わ ゆ る 水 和 層 が 形 成 さ れ る 。 こ の 水 和 層 は タ ン パ ク

1 1

に 強 く 結 合 し た 水 ( 不 凍 水 (non‑freezing water)) と 弱 く 結 合 し た 水 ( 結 合 水(boundwater))の

2

層 か ら 成 り 立 っ て い る22)。 不 凍 水 は 主 と し て 電 離 基 や 極 性 基 に 直 接 配 向 し た 水 で 、 そ の熱運動は強く束縛されており、回転の相関時間'tcは10^・7秒のオーダーである。

一 方 、 結 合 水 は 、 不 凍 水 と の 水 素 結 合 に よ り あ る 程 度 配 向 し た 水 で 、τcは10^・9秒

自由水 ( F r e eWater) 

結合水 (BoundWater)  L 

t 水和層 不凍水 ( N o n ‑ F r e e z i n gWater) ) 

図 1 ‑ 1.タンパク 質 界 面 に お け る 各 種 の 水 の 分 類

の オ ー ダ ー で あ る 。 更 に そ の 外 側 に 通 常 の バ ル ク 水 と 同 様 な 自 由 水 ( (free  water); 't c~10-12秒)がとりまいている。これらの水和水の量、構造、性質は、

温 度 、 圧 力 、 添 加 物 等 熱 力 学 的 因 子 に よ り 影 響 を 受 け る が 、 当 然 、 圧 力 効 果 に対しては水和水の体積と圧縮率が問題となる。

一 般 に タ ン パ ク 質 が 変 性 す る と 、 分 子 内 部 の ア ミ ノ 酸 残 基 が 露 出 し 溶 媒 と 接 触 す る 様 に な る た め 水 和量 は 増 加 し 、 モ ル 体 積 が 減 少 す る 。 ま た 、 タ ン パ

ク 質 分 子 同 士 の 会 合 で は 脱 水 和が 起 こ り 、 モ ル 体 積 は 増 加 す る 。 従 っ て 、 比 較 的 低 圧 下 で は タ ン パ ク 質 の 変 性 が 促 進 さ れ る 結 果 、 会 合 反 応 は 抑 制 さ れ 、 す な わ ち 解 離 現 象 が 起 こ る と 考 え ら れ る 。 し か し な が ら 、 よ り 高 圧 下 に お い

て は 、 疎 水 結 合 に 対 す る 圧 力 効 果 の 反 転 に よ り 会 合 が 促 進 さ れ る21。)

1‑1‑4  ゲ ル の ガ ラ ス 化

ガラス窓、やガラス瓶等の様に、身のまわりにあるガラスを見ると、 一般 的

に 、 透 明 で 、 も ろ く 、 加 熱 に よ り 流 動 す る と 考 え ら れ る。ガラスの↑

t l i f t

とし

て以下の様に定義されている。狭い定義として、 『溶融物を結晶化する事な

く冷却して得られる無機物質j23)が あ げ ら れ る が 、 最 近 、 非 品 賃 金 属 及 び 非 自 質 高 分 子 等 、 こ の 定 義 に 合 わ な い が ガ ラ ス と よ ん で 当 然 だ と 思 わ れ る 物 質 が 数多くある。そこで、広い定義として、 『ガラス転移現象を示す非品質固体

J

23)がある。

最近、 Takushiら は 、 白 濁 し た 卵 白 ゲ ル (ゆで卵)が、乾燥雰囲気中で硬く 透 明 に な り 、 ガ ラ ス の 様 な 状 態、(以 降 ガ ラ ス様状態と呼ぶ)に変化し、逆に、

ガラス様状態、の卵白を精製水に浸すと膨潤して 再 び ゲ ル に な る と い う 事 を 報 告した24)。図1・2は 、 ゆ で 卵 と 、 そ れ を 一 月 程 度 冷 蔵 庫 で 保 存 し た も の の 写 真 で あ る 。 こ の ゲ ル ー ガ ラ ス 様 転 移 に お て 、 濁 っ た 軟 ら か い 試 料 が 収 縮 し 、 硬

く透明になる(図1̲3²⁵)) と い う 事 か ら 、 内 部 構 造 に 大 き な 変 化 が 生 じ て い る という事が示唆された。Takushiらは、ゆで 卵 の 白 味 の 乾 燥 過 程 に お け る 重 亘 変 化 の 測 定 を 行 い 、 転 移 過 程 は 2段 階で あ る と 報 告 し た 。 彼 ら は 、 第 一 段 階 が ゲ ル 中 の 弱 い 相 互 作 用 を 受 け た 水(freewater)の 脱 水 過 程 で あ り 、 第二 段 階 が ネ ッ ト ワ ー ク に 強 い 束 縛 を 受 け た 水(boundwater)で あ ろ う と 結 論 し た26)。 さ ら に 、 力 学 的 性 質 の 時 間 分 解 測 定 か ら 、 乾 燥 過 程 に お い て 、 弾 性 率 及 び 弾 性 損 失 の 時 間 変 化 が 、 通 常 の ガ ラ ス 転 移 に お け る 温 度 変 化 と 非 常 に 類 似 し た 振 る 舞 い を 示 し て い る 事 が 観 測 さ れ た27)。 し か し な が ら 、 その 物 性 に 関 す る そ

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の 他 の 研 究 は 皆 無 で あ る と い っ て 良 い 。

1^・2 本 研 究 の 目 的

前 節 で 述 べ た 様 に 、 生 体 高 分 子 の ゲ ル 化 、 及 び 最 近 認 識 し 始 め ら れ た ガ ラ ス 化 と い っ た 物 性 変 化 の 研 究 は 、 医 学 ・ 生 物 学 と 物 理 学 の 境 界 領 域 で あ り 、 応 用 上 は 、 特 に 食 品 加 工 の 分 野 に お い て 、 テ ク ス チ ャ ー や 栄 養 素 の 制 御 等 大 変 重 要 で あ る 。 特 に 、 食 品 加 工 に お い て 、 通 常 の 熱 処 理 に 対 し て 、 生 の フ レ

ー ノ て ー を 保 っ た ま ま 食 品 化 出 来 る と い う 利 点 か ら 、 加 圧 処 理 が 最 近 注 目 を 集 め て い る 。 現 在 ま で ゲ ル 状 態 で の 静 的 な 物 性 測 定 は 広 く 研 究 さ れ て お り 、 ネ ッ ト ワ ー ク 中 の 自 由 水 が 非 常 に 大 き な 役 割 を 果 た し て い る と 考 え ら れ て い る が 、 変 成 途 中 の 過 程 が 生 成 物 の 物 性 に 大 き な 影 響 を 与 え る の は 明 ら か で あ る に も か か わ ら ず 、 そ の 動 的 機 構 及 び ネ ッ ト ワ ー ク と 白 雨 水 の 相 互 作 用 に 関 す る研究はほとんど行われていない。

こ の 様 な 状 況 を 背 景 に 、 様 々 な 加 工 条 件 に よ る 生 体 高 分 子 の ゲ ル 化 及 ぴ ガ ラ ス 化 と い う 転 移 現 象 に お け る ネ ッ ト ワ ー ク と 白 雨 水 の 相 互 作 用 の 変 化 に つ い て 種 々 の 物 性 の 時 間 分 解 観 察 を 行 い 、 変 性 環 境 が 物 性 変 化 のdynamicsに及 ぼ す 影 響 と い う 新 し い 観 点 か ら 観 察 を 行 っ た 。

ま た 、 本 研 究 で の 対 象 物 質 と し て 、 筋 原 線 維 タ ン パ ク

1 1

ァ ク ト ミ オ シ ン 及 び 卵 白 を 選 ん だ が 、 そ の 選 択 理 由 と し て は 、 ま ず 、 最 も ポ ピ ュ ラ ー な 生 体 高 分 子 で あ り 、 特 に 食 品 と し て 幅 広 く 利 用 さ れ て い る 点 、 次 に 、 生 ( ゾ ル 状 態 、 ) で は 、 透 明 で あ る が 、 ゲ ル 化 に よ り 白 濁 す る と い う 事 か ら 、 変 性 過 程 に お い て 著 し い 物 性 変 化 が 期 待 さ れ る と い う 点 が あ げ ら れ る 。

変 成 環 境 と 自 由 水 と の 相 関 関 係 を 明 ら か に す る 事 に よ り 、 三 次 元 ネ ッ ト ワ ー ク 形 成 の 制 御 、 お よ び 生 命 復 活 現 象 が 解 明 で き れ ば 、 医 療 機 械 の 分 野 で 大 変 注 目 を 集 め て い る マ イ ク ロ ア ク チ ュ エ ー タ に 対 応 す る 新 規 物 質 の 創 成 や 移 植 臓 器 等 の 保 存 等 へ の 応 用 が 可 能 と な る で あ ろ う 。

1‑3  本 論 文 の 構 成

本 論 文 は 序 論 を 含 め て

8

章 よ り 構 成 さ れ る 。

第 l章 ( 本 章 ) で は 、 本 研 究 の 背 景 及 び 目 的 に つ い て 述 べ た 。

第

2

章 で は 、 研 究 に 用 い た 試 料 及 び 時 間 分 解 観 察 を 行 う た め の 種 々 の 測 定 手 段 と 、 そ の 原 理 に つ い て 述 べ る 。

第 3章 で は 、 筋 原 線 維 タ ン パ ク 質 ア ク ト ミ オ シ ン ( ミ オ シ ンB)の ゲ ル 化 過 程 に お い て 加 熱 及 び 加 圧 と い う 処 理 法 の 違 い が ゲ ル 化 過 程 に ど の 様 な 影 響 を 及 ぼ す か に つ い て 、 濁 度 ス ペ ク ト ル 測 定 を 行 い 、 得 ら れ た 結 果 か ら 環 境 の 効 果 が 生 成 物 に 及 ぼ す 影 響 に つ い て 検 討 す る 。

第 4章 で は 、 乾 燥 に よ る ア ク ト ミ オ シ ン ゲjレ の ガ ラ ス 化 に お け る 溶 媒 効 果 に つ い て 、 重 量 及 び 体 積 の 同 時 測 定 を 行 い 、 乾 燥 過 程 に お け る 溶 媒 の 効 果 に ついて考察する。

第 5章 で は 、 代 表 的 な 生 体 高 分 子 の 一 種 で あ る 卵 白 に つ い て 、 温 度 及 び 庄 力 を パ ラ メ ー タ と し て そ の ゲ ル 化 に お け る 動 的 機 構 の 変 化 に つ い て 観 測 を 行 い 、 加 熱 及 び 加 圧 処 理 を 併 用 し て 行 っ た と き の ゲ ル 化 過 程 に つ い て 検 討 す る 。

第 6章 で は 、 加 熱 及 び 加 圧 処 理 に よ り ゲ ル 化 し た 卵 白 の 乾 燥 過 程 に 関 し 、 巨 視 的 物 性 測 定 と し て 、 重 量 ・ 体 積 の 同 時 測 定 を 行 い 、 微 視 的 構 造 変 化 測 定

と し て 時 間 分 解 小 角 X線 散 乱 実 験 を 行 い 、 加 熱 ゲ ル 及 び 加 圧 ゲ ル の 乾 燥 過 程 に お け る ゲ ル ネ ッ ト ワ ー ク と 自 由 水 と の 相 互 作 用 に つ い て 比 較 す る 。

第 7章 で は 、 ゲ ル ー ガ ラ ス 様 転 移 に お い て 、 ゲ ル の 主 要 二 成 分 の一つ で あ る ゲ ル 中 の 溶 媒 の 効 果 に つ い て 検 討 す る 。

第

8

章 で は 、 本 研 究 で 得 ら れ た 結 果 を 総 括 す る 。

第 2 章

試 料 及 び 測 定 方 法

2‑1  緒 言

まず始めに、本研究で用いた試料の一般的な物'I~I: について述べる。次に本 研 究 で は 転 移 過 程 に お け る 動 的 機 構 を 解 明 す る た め 種 々 の 時 間 分 解 観 察 を 行

っ た の で 、 そ の た め の 種 々 の 測 定 手 段 と そ の 原 理 に つ い て 述 べ る。

通 常 の 生 体 試 料 の 物 性 測 定 は 電 子 顕 微 鋭 観 察3・6)や 、 電 気 泳 動 法 な ど で あ り

0)、 こ の 方 法 で は 試 料 を 測 定 し や す い 様 に 加 工 す る の で ( 例 え ば 急 速 乾 燥 や 金 の 蒸 着 、 着 色 等 ) 、 試 料 本 来 の 物 性 を 測 定 す る た め に は 完 全 で は な い 。 ま た 、 時 間 分 解 測 定 も 困 難 で あ る 。 従 っ て 、 試 料 の 物 性 を で き る だ け 損 な わ ず 自 然 の 状 態 で 観 察 す る に は 非 接 触 で な け れ ば な ら な い 。 そ こ で 、 光 及 びX線を プ ロ ー ブ と し た 非 接 触 時 間 分 解 観 察 法 を 採 用 し た 。

2‑3で は 、 時 間 分 解 濁 度 ス ペ ク ト ル 測 定 に つ い て 述 べ る 。 白 色 平 行 光 を 試 料 に 照 射 し 、 そ の 透 過 光 を 光 フ ァ イ パ に よ り 分 光 光 度 計 内 に 導 く 事 に よ り 、 広 い 波 長 領 域 の ス ペ ク ト ル デ ー タ を 瞬 時 に 得 る 事 が で き る 。 更 に 、 データ解 析 に よ り 、 特 に 光 散 乱 の 波 長 依 存 性 よ り 散 乱 体 の 大 き さ の 変 化 を 算 定 す る 方 法 を述べる。

重量・体積の同時測定を行うため、

2 ‑ 4

で述べる様に、

CCD( c h a r g e ‑ c o u p l e d   d e v i c e )

カメラ、

VTR

、 フ レ ー ム メ モ リ ー ・ ボ ー ド 、 電 子 天 秤 等 に よ り 構 築 し

た 系 を 新 規 に 製 作 し 、 更 に 密 度 変 化 ( 重 量 / 体 積 ) を 算 出 し た 。

2‑5で は 、 転 移 過 程 に お け る 構 造 変 化 測 定 と し て 、 時 間 分 解 小 角X線 散 乱 実 験 を 高 エ ネ ル ギ 一 物 理 学 研 究 所 放 射 光 実 験 施 設

BL‑IOC

に お い て 行 い 、 得 ら れ たデータから、

G u i n i e r

プ ロ ッ ト に よ り ク ラ ス タ ー ・ サ イ ズ の 見 積 り を 行 う 方 法を述べる。

ま た 、 変 性 途 中 の 動 的 機 構 と 得 ら れ た 物 質 の 物 性 と の 相 関 を 解 明 す る た め に 、 走 査 型 電 子 顕 微 鏡 (SEM)に よ る ( 静 的 ) 形 態 観 察 (2‑6)及 び 広 角X線 回 折 実 験 に よ る ( 静 的 ) 微 視 的 構 造 観 察 (2‑7)も併せて行った。

2‑2  試 料

本 研 究 で 用 い た 試 料 は 、 最 も 代 表 的 な 生 体 高 分 子 で あ る 筋 原 線 維 タ ン パ ク 質 及 び 卵 白 で あ る 。 以 下 に 述 べ る 試 料 に つ い て の 基 本 的 な 物 性 を 基 に し て 、

の 効 果 と い う 新 し い 着 眼 点 に 立 ち 非 接 触 時 間 分 解 観 察 に よ り そ の 解 明 を 行 つ た。

2‑2・1 筋 原 線 維 タ ン パ ク 質 ア ク ト ミ オ シ ン

2‑2‑1‑1  ア ク ト ミ オ シ ン の 物 性

ま ず 初 め に 、 筋 原 線 維 を 構 成 し 筋 収 縮 と そ の 制 御 に 関 与 す る 主 な 構 造 タ ン パ ク 質 の 一 覧 をTable2‑1に示す³¹⁾。 こ れ ら の タ ン パ ク 質 の 特 徴 は 自 己 集 合 あ る い は 他 の タ ン パ ク 質 分 子 と 結 合 し て 特 有 の 超 分 子 構 造 を 形 成 す る 事 で あ る 。

筋 原 線 維 の 全 タ ン パ ク 質 重 量 の44%を 占 め て い る ミ オ シ ン ( 分 子 量 約

500，000) は 、 長 さ 約160nmで、細長い胴体(尾部)に二つ の 頭 が つ い て い る 双 頭 構 造 を し て い る 。 筋 原 線 維 タ ン パ ク 質 の220/0を 占 め て い る ア ク チ ン ( 分 量 約42，000) は 、 径 が 約5nmで、ある (0‑ア ク チ ン と 呼 ば れ て い る ) 。 図2‑1に 示 す 様 に 生 理 的 条 件 下 で は 、 ミ オ シ ン は 、 頭 部 を 失 き 出 し た 形 で フ ィ ラ メ ン

ト を つ く り 真 ん 中 を 中 心 に 双 極 性 の ら せ ん 構 造 を と っ て い る 。 ま た ア ク チ ン 分 子 は ら せ ん 状 に 重 合 し て フ ィ ラ メ ン ト (F‑ア ク チ ン と 呼 ば れ て い る ) に な

っている31) 。 こ れ ら フ ィ ラ メ ン ト の 滑 り に よ り 筋 肉 の 収 縮 ・ 弛 緩 が 起 こ る32)。 通 常 筋 肉 か ら 抽 出 し た も の を 、 ア ク ト ミ オ シ ン ま た は 、 ミ オ シ ン Bと呼び、

ア ク チ ン お よ び ミ オ シ ン 分 子 の 他 に 、 調 節 タ ン パ ク 質 ( ト ロ ポ ミ オ シ ン 、 ト ロ ポ ニ ン 等 ) 及 び 骨 格 タ ン パ ク 質 を 少 量 含 ん で い る 。

2‑2‑1‑2  ア ク ト ミ オ シ ン の 加 熱 ゲ ル 化 過 程

ア ク ト ミ オ シ ン は 加 熱 に よ っ て ゲ ル 化 す る 事 が 知 ら れ て い る の で 、 ゲ ル 形 成 能 天 然 高 分 子 で あ る 。 ア ク ト ミ オ シ ン の ゲ ル 化 過 程 に お い て は 、 ミ オ ン ン 分 子 が 主 に 寄 与 し て い る と 言 わ れ て い る33)。 そ し て 加 熱 に よ り 分 子 運 動 が 激 し

く な り 弱 い 共 有 結 合 が ひ き ち ぎ ら れ て ゲ ル 化 す る 。 ま た ゲ ル 化 過 程 は こ の 場 合 不 可 逆 過 程 で あ る 。 図2‑2に ア ク ト ミ オ シ ン の 加 熱 ゲ ル 形 成 反 応 を 表 す 模 式 図 を 示 す33)。 そ の 各 段 階(A)~(D) では、以下の現象が起こっていると考えられ る。

(A)  加 熱 前 、 遊 離 の ミ オ シ ン 分 子 及 び ミ オ シ ン 分 子 と 結 合 し た ア ク チ ン フ イ

T a b l e   2 ‑ 1 . 筋 原 線 維 構 成 タ ン パ ク 質

31)

名 称 分 子 量 組 成

局 在 機 能

(0/0 ) 

収縮タンパク質

ミオシン 500.000  43  A帯 ATP分解

アクチン 42，000  22  I帯 他のアクチンと結合、

ミオンンと結合

調節タンパク質

トロポミオシン 66，000  5  I帯 アクチン、 トロポニンと結合 トロポニン 70，000  5  I帯 カルンウム調節

M‑タンパク質 165，000  2  M線 ミオンンを束ねる

c ‑

^{タンパグ質} 135，000  2  A帯 ミオシンと結合

αーアクチニン 190，000  2  I帯 アクチンをゲル化 s‑アクチニン 67，000  _ー ^つ アクチンの末端因子

骨格タンパク質

コネクチン 2，800，000  10  A，I帯 ミオシンを Z線に連結

A帯 及 びI帯とは、筋線維の構造単位である筋原線維 中 で 主 と し て ミ オ シ ン で 構 成されている部分及びアクチンで構成されている部分の名称。またM線 はA帯 の中央にあり、ここでミオシンフィラメントが束ねられている。

F ‑ A c t i n  

A c t i n 分 子42 個

40nm 

Myosin F i l a m e n t  

ふ\金\金\占l~ ーヱ0)0 J o J ‑ o   J ‑ o  

0

ぢ ^σ ぢ σ ぢ σ ぢ ^σ ぢ一下、¥守¥号、

Myosin 分子 ' " ' ‑ 3 0 0 個

図 2 ‑ 1.アクチン及びミオシンの分子モデル

31)

( A )  

B 

( C )  

(D) 

図2 ‑ 2 . アクトミオシンのゲル化モデル

³³⁾

ラメントは、分散している。

(B)  遊 離 ミ オ シ ン の 分 子 頭 部 聞 の 凝 集 反 応 が 起 こ る 。

(C)  ミ オ シ ン 分 子 の 尾 部 聞 の 架 橋 形 成 が 起 こ る 。

( D )  

網 目 構 造 が 形 成 さ れ る 。 ( ゲ ル 化 )

2‑2‑2 卵白

2‑2‑2‑1  卵 白 の 物 性

卵白の主要なタンパク質は、 Ovalbumin、Ovotransferrin(Conalbumin)  Ovomucoid、Lysozyme及び、Globulinで あ る が 、 現 在 で は 少 な く と も 12種 類 そのうち同名称、で異種のものを数えると 15種 類 以 上 の タ ン パ ク 質 が 見 出 さ れ ている(Table2‑2)34)0 Ovalbuminは 、 卵 白 タ ン パ ク 伎 の 約540/0を 占 め る タ ン パ ク 質 で 、 電 気 泳 動 的 に

3

成 分 に 分 け ら れ 分 子 量 は そ れ ぞ れ 約46，000で 等 し い が 、 タ ン パ ク 質 に 結 合 し て い る リ ン 酸 基 の 数 が 異 な る 。 Ovalbuminの 全 一 次 構 造は、 m‑RNAの塩基配列等)⁵⁾に よ り 決 定 さ れ た 。 こ の 結 果 に よ れ ばOvalbumin

は385個 の ア ミ ノ 酸 か ら な る 分 子 量42，699のl本 鎖 ポ リ ペ プ チ ドl本 の 糖 鎖 か ら できている。また、 l分子当たり l個 のS‑S結合と4伺 のSH基 を 持 っ て い て 、 こ れらのうち3個のSH基は未変性の状態、ではSH基 試 薬 と 弱 く 反 応 す る が 、 変 性 すると4個のSH基 の 全 て が 反 応 性 に 富 む も の と な る 。 ま た 二 次 構 造 に つ い て は、 αーヘリックス、 β構 造 と ラ ン ダ ム コ イ ル が そ れ ぞ れ300/0と370/0である。

2‑2‑2‑2  卵 白 の ゲ ル 化 過 程

卵 白 の 主 要 タ ン パ ク 質 はOvalbuminで あ り 、 自 然 の 状 態 で は 分 子 内 水 素 結 合 及 び 疎 水 結 合 に よ り 、 疎 水 性 ア ミ ノ 酸 残 基 を 内 部 に し て 糸 ま り 状 の 構 造 を 作

っていると考えられている。

ま ず 加 熱 に よ り 、 タ ン パ ク 質 分 子 のBrown運 動 が 盛 ん に な り 、 高 次 構 造 が ほ ど け て 疎 水 性 ア ミ ノ 酸 残 基 が 表 面 に 露 出 し て く る ( 変 性 ) 。 分 子 は こ れ ら 疎 水 基 の 疎 水 結 合 に よ っ て 会 合 し 始 め る 。 構 造 の 中 に あ っ た 遊 離 のSH基も、

T a b l e  2 ‑ 2 . 鶏卵卵白タンパク質3‑t )

名 称 分子量 来

1 1

成(0/0) 等電点 炭水化物 の含量(0/0) オボアルブミン 46，000  54  4.5‑‑‑4.8  3  オボ、トランスフェリン 76，600‑‑‑86，000  12‑‑‑13  6.05 ‑‑‑6.6  2 

(コンアルブミン)

オ ボ ム コ イ ド 28，000  11.0  3.9‑‑‑4.3  22  オボグロプリンG2 36，000"""'45，000  4.0  5.5  ^つ オボグロプリンG3 向上 4.0  5.8  ^つ

リゾチーム 14，300"""'17，000  3.4"""'3.5  10.5‑‑11.0 

。

(オボグロプリンG1)

オボムシン ^つ 1.5"""'2.9  ^{つ つ} フラボ、フ。ロテイン _{32，000‑‑‑36，000  0.8  3.9"""'4.1  14} 

オ ボ マ ク ロ グ ロ プ リ ン 760，000"""'900，000  0.5  4.5‑‑‑4.7  9  オ ボ グ リ コ プ ロ テ イ ン 24，400  0.5 """'1.0  3.9  16  オボ、インヒピター _{44，000 ~49 ，000  0.1"""'}1.5  5.1‑‑‑5.2  6  アピジン 68.300  0.05  9.5"""'10.0  8  ノてノてインインヒピター _{12，700  0.1}  ^{つ つ}

加熱により活性化され、 SH基 同 士 が 反 応 し てS‑S結 合 が で き る 。 長 く 伸 び た 分 子 鎖 同 士 の 絡 み 合 い も 起 こ り や す く な る 。 そ れ で も な お 、 分 子 の 表 面 に 親 水 性 の 解 離 基(‑COO‑) が 十 分 残 っ て い る の で 、 タ ン パ ク 質 分 子 は 相 互 に 連 な っ て 三 次 元 の 構 造 を 作 り な が ら そ の 内 部 に 水 分 子 を 取 り 込 ん で ゲ ル 化 す る 様 に なる。

図2‑3に 示 す 様 に 、 凝 集 体 の 形 成 機 構 は ま ず 、 加 熱 処 理 に よ り Ovalbumin分 子 の 構 造 が ほ ど け て 、 分 子 量

400

万 以 上 の 凝 集 体 が 疎 水 結 合 に よ り 生 成 す る 第 一 段 階 と 、 分 子 表 面 に 露 出 し た 遊 離SH基 の 反 応 に よ り 、 凝 集 体 が 会 合 し 、 分 子 量

3

，

500

万 ま で に な る 第 二 段 階 が あ る36)。

2^・3 光 学 的 測 定

2‑3‑1  光 散 乱 の 理 論³⁷⁾

本 研 究 に お い て 濁 度 測 定 か ら 得 ら れ る デ ー タ を 解 析 す る 場 合 の よ り ど こ ろ となる光散乱の理論について述べる。

媒 質 中 を 強 度10の 光 が 通 過 す る と き に 散 乱 が 起 こ る と 、 透 過 光 強 度Iは 、 光 路長をdとすると、

1  =  ^{1 0} 叫 ( 一 τ d )

_(2‑1) 

で 表 さ れ る 。 こ こ で で は 濁 度(turbidity)で あ る 。 上 記 の 式 をLambert‑Beerの 式 という 38)

。

図

2 ‑ 4 ‑ ( a )

に小さな粒子(径<入/

2 0 )

で の 散 乱 機 構 の 概 念 図 を 示 すo xyz空 間 内 に 散 乱 体 積VのN個 の 等 方 性 の 小 さ な 同 ー の 散 乱 粒 子 が 含 ま れ て い る と す る 。 こ こ へ 振 動 数ω。の垂直偏光単色光束(真空中の波長入。)がy軌 に そ っ て 入 射 さ れ ( 入 射 光 の 波 動 ベ ク ト ル kO)偏 光 面 は 平 面yzに平行であるとすると、

そ の 入 射 光 の 電 場 は

E=Ao仰 [‑i(ωt‑ko

め

( 2 ‑ 2 )  

オボアルブミン

加熱

年

￨疎水結合￨

M w   4 6 . 0 0 0  

可溶性凝集体

SH 

^{、~ .....̲}

(可溶性凝集体

)n

SH  lSH 基の酸化￨

S ‑ S 結合

4 ， 000 ，000~ ~

3 5

，

000

，

000 

図

2 ‑ 3 . オボアルブミンの熱変性

36)

( a )   ( b )  

粒 径

入 一

>  加

Z 

川 、 ⁷

x 

8: 散乱角

散乱体 単一d i p o l e d i p o l e の集合 内部干渉効果 ない ある

散乱光強度の

等方的 非等方的 角度依存性

波長依存性 _入 ‑4 入 ‑ α

(  2  壬

α 

三 玉 4  ) 

図 2 ‑ 4 . 光散乱の概念図

である。散乱光は波動ベクト jレksの方向で距離し離れた受光部で検出される。

ここでrを基準粒子の位置ベクトルとする。

q=ko‑ks 

^(2‑3) 

と定義すれば、散乱角0との間に次式が得られる。

I q l = q = ( や ) 討 n ( ! }

(2‑4) 

一 つ の 散 乱 粒 子 が電場Eの作用を うけると 、そ の 粒 子 に は 次 に 表 さ れ る 双 極 子

( d i p o l e )  P

が誘起きれる。

p=αE 

^(2‑5) 

ここに

α

は分極率

( p o l a r i z a b i l i t y )

で、等 方 性 粒 子 で は ス カ ラ ー で あ る が 非 等 方 粒子ではテンソルである。平面

x z

上では入射光は同位相であるが、 一般 に 基 準粒子より rj離れたj番目の粒子は異なっ た 位 相 の 振 動 双 佳 子 が 誘 起 さ れ て い る 。 そ の 結 果 、 異 な っ た 粒 子 か ら 散 乱 さ れ た 光 は光 路 差 に も と ず く 位相差を 持 っ て 受 光 部 に 入 る 事 に な る 。 散 乱 角 度一定では、 時間 tに受光部に入る総 和 の 散 乱 光 の 電 場Esは次の様に表される。こ の時、散 乱 体 積V中の散乱粒子濃 度 は 充 分 希 薄 で あ り 、 散 乱 光 が 別 の 粒子 に 当 た る 事 に よ っ て 生 ず る 多 重 散 乱

( m u l t i p l e  s c a t t e r i n g )

の効果は無視できる とする。

Es= 日j=~A 仲川iq.rlt)] 叫(- i ω 。 い

^P

( i k s  .  L )  

_(2‑6) 

散 乱 光 強 度Isは受光部に入る散乱光の電場の時 間 平 均 と し て 次 式 で 表 さ れる 。

I s   =  ¥ E * s  .  E s )   _{( 2 ‑ 7 )}  

ここでE*Sは複素共役

( c o m p l e xc o n j u g a t e )

で あ り 、 <・・>は時間平均を表す。

充分希薄であって、 N個の小さな粒 子 が 互 い に 運 動 も 位 置 も 相 関 を 持 た ないと すれば、式

( 2 ‑ 7 )

は簡単にな って次の様に表される。

Is=

何

^j.A.i

! 

^{= NA2  (2‑8)} 

Aは双極子Pと関係 づ け ら れ 、 最 終 的 に 次 式 に な る 。

弘一n一

・ ・ E

a‑

AV一

L

A

一 ︐

C

α

一

ω ウ劃一

一 一 一

A  (2‑9) 

ここで、中zは 一 般 に 散 乱 波 動 ベ ク ト jレksと入射光の電場 の 方 向Zと の な す 角 で あ り、 cは 光 速 を 表 す 。 ま た 、 入 射 光 と 散 乱 光 の 比 は 次 の 様 に 求 め ら れ る 。

Is  ̲ 

A

²

一^ω4α2sin弘一 16π4α2sin弘

前;-E; 一九2 一 λ~L2 (2‑10) 

同 様 に 水 平 偏 光 がy軸 に そ っ て 入 射 さ れ れ ば 全 く 同 じ 様 に

Is  16π4α2 sin <px 

NI_o

ー は

L² (2 ‑1 1 ) 

ここで、<Txはksと 入 射 光 の 電 場 のX方 向 の な す 角で あ る 。 自 然 光 (unpolarized light)が 入 射 さ れ た 場 合 は 式(2‑10)と(2‑11)か ら 次 のRayleighの式を得る。

T  n ̲ 4 、

三=21τ=r 1 + cos2

8 1

:L N:α2 

10λ^峠L^{..G ¥}  J ' 畠 (2 ‑12) 

ここで、Niはi種の分子数、 αiはi種 分 子 の 分極 ネ で あ る。

一 つ の 粒 子 が 光 の 波 長 よ り 小 さ い 場 合 ( 入 /20程 度 以 下 ) に は 、 散 乱 体 は 単 ー で あ る と 見 な さ れ 粒 子 の 電 荷 重 心 も 光 の 電 場 と 同 じ 様 に 振 動 す る 。 従 っ て 、 分 極 率αのN個 の 同 種 粒 子 が 存 在 し た と き、

}:  Njα2i=Nα2  (2 ‑13) 

と な る 。 入 射 光 が 自 然 光 で 、 体 積Vの中にN伺 の 粒 子 が 分 散 し て い て 、 そ れ ら が 独 立 に 入 射 光 を 散 乱 す る と き 、 体 積Vか ら 充 分 遠 方L^{で の 散 乱 角}Oにおける 単 位 体 積 当 り の 散 乱 光 強 度₁₈は、波長入入射光強度₁₀とすると

。 =b4MM2 叫

(2‑14) 

で与えられる。

式(2‑14)か ら 明 ら か な 様 に 、 散 乱 光 強 度 は 波 長 の4乗 に 逆 比 例 す る と い う 事 が判る

( R a y l e i g h

散乱)39)

。

し か し な が ら 粒 子 が 波 長 に 比 べ 大 き く な る と 、 粒 子 内 部 の 何 々 の 散 乱 体 か ら の 散 乱 に よ り 光 路 差 即 ち 位 相 差 が 現 れ 互 い に 干 渉 し 合 う 様 に な る 。 図2‑4‑(b) の 模 式 図 で 示 し た 様 に こ の 現 象 を 散 乱 光 の 内 部 干 渉 の 効 果 と 呼 ぶ 。 内 部 干 渉 効 果 に よ り 散 乱 光 強 度 は 、 散 乱 角0の 方 向 で は 直 進 方 向 に 比 べ て 弱 く な り 角 度 依 存 性 が 非 対 称 に な る 。 即 ち 散 乱 光 強 度 の 波 長 依 存

t l :

が変化するわけである。

従 っ て 、 大 き な 粒 子 の サ イ ズ を 光 散 乱 の 理 論 に よ っ て 見 積 る 場 合 は 、 単 に 一 方 向 の 散 乱 を 測 定 す る ( 例 え ば90度 散 乱 ) だ け で は 不 十 分 で あ り 、 散 乱 角 の 角 度 依 存 性 を 測 定 す る か 、 あ る い は 角 度 一 定 で 散 乱 光 強 度 の 波 長 依 存 性 を 測 定する必要がある。

一般に高分子の分野では、コロイド粒子の慣性半径をレーザ、等の単色光を 用 い て そ の 散 乱 光 強 度 の 角 度 依 存 性 か らZimプ ロ ッ ト 等 に よ り 算 出 し て い る

40，41 )。しかし、通常用いられているこの方法では、測定に時聞がかかるため、

本 研 究 で 用 い た 手 法 で あ る 短 時 間 の 時 間 分 解 測 定 が 困 難 で あ り 、 ま た 測 定 装 置 が 大 が か り に な る た め 、 例 え ば あ る 角 度 範 囲 で 光 を 取 り 出 す 窓 が 必 要 で あ っ た り 、 ま た 簡 単 に 外 場 を 変 え る 事 が 難 し い と い う 欠 点 が あ る 。 従 っ て 、 透 過 光 の 波 長 依 存 性 に 注 目 し 、 散 乱 光 強 度 の 波 長 依 存

t

l:を関数とした最も単純

な近似である

R a y l e i g h ‑ G a n s

散 乱 理 論42，43)による解析を用いた。

R a y l e i g h ‑ G a n s

散 乱 に よ る と 、 散 乱 体 が 半 径

a

の 球 の 場 合 、 全 散 乱 光 強 度Isca は、散乱断面積を_Cscaとすると、

ぞ ⁼

^Csca 

⁼ 

^jt 

^a

^21m‑1 

^{F  q ( x )}  

^(2‑15) 

で あ る 。 こ こ でmは散乱体の媒質に対する屈折半比である。

I 

m‑1 

I  ( 

1のとき、

q 

( x )   =  _~

X⁴ 

f 

^G 

^{( u}   r 

⁽¹ 

^+c判

^{ω d 8}

G(

←会

(sin

u  ‑ u 

cos 

u )  

、ヲ匹 、~ ~ずも

l‑ l‑ ¥、、

u=2x 叫~)

x‑k _‑‑ .a‑ZEa ~.-λ

で あ る 。 ま たaは散乱体の半径、 kは 波 数 (2π/入)を示す。

(2 ‑16) 

パラメータmに つ い て は 、 ゲ ル 化 の 初 期 段 階 で は 著 し い 変 化 は 無 い と 仮 定 す る と、 Ray1eigh‑Gansの 散 乱 メ カ ニ ズ ム に よ れ ば 、 球 の 散 乱 断 面 積 は 、 式(2‑16) で 与 え ら れ る 。 こ こ で0、 入 は 、 散 乱 角 と 光 の 波 長 を 示 す 。 波 長 依 存 量 はq(x)

に含まれる。

上 で 述 べ た 式 を 数 値 的 に 計 算 す る 事 に よ り 得 ら れ た 、 Inq対lnxの プ ロ ッ ト を図2‑5に 示 す 。 そ の 関 係 は ほ ぼ 直 線 で 近 似 可 能 で あ り 、 ま たlnq =0付近で、

1n  q値のInx依 存 性 は 著 し い 傾 き の 変 化 を 示 し て い る 。 こ の 様 子 を よ り 明 確 に す る た め に 、 図2‑6に、 d[lnq]/d[lnx]イ直(=Exponent α)を、 lnxに女すしてプロ

ットした。

ところで tは 、 言 い 換 え る と 消 光 度 即 ち 消 光 断 面 積 (C_ext) に対応している。

Csca ^{~ま吸光断面積 (C}

abs

^{) を用いて、 C}

ext

^{= Cabs + Csca}と 記 述 で き る 。 光 吸 収 は 通 常 特 定 の 波 長 に お い て 起 こ り そ の 場 合 は 著 し い 色 の 変 化 が 生 じ る 。 し か

しながら、第3章 で 測 定 さ れ た 透 過 率 ス ペ ク ト ル を 見 て も 明 ら か な 様 に 、 生 体 高 分 子 の 場 合 ゲ ル 化 の 際 に は 白 濁 す る の み で あ り 、 特 定 波 長 の 著 し い 減 少 ( 光 吸 収 ) は 観 測 さ れ て い な い 。 従 っ て 、 式(2‑16)からq‑‑‑‑‑Cscaで あ る の で τ‑‑‑‑‑qと なる。従って、 x‑‑‑k‑‑‑入ーlと 合 わ せ て 考 え る と 、 こ れ ら はlnτYS. ln入の傾きの 変 化 を 示 し て お り 、 散 乱 光 の 内 部 の 干 渉 の 増 加 に 寄 与 し て い る 。 ま た 、 1nxか

ら 散 乱 体 の 半 径 を 見 積 も る 事 が 可 能 と な る 。

上 記 の 議 論 か ら 、 実 験 的 に 得 ら れ た1nτとln入 を 直 線 近 似 し た 時 の 傾 き の 変 化 は 、 ゲ ル 化 過 程 に お け る ク ラ ス タ ー の 増 大 に よ る 散 乱 光 の 内 部 干 渉 の 効 果 の増加に起因すると考えられ、 Ray1eigh ‑G ansの 散 乱 メ カ ニ ズ ム に よ っ て 良 く 説明できる。

ゲ ル 化 の 最 終 段 階 で は 、 ク ラ ス タ ー の 境 界 の 干 渉 効 果 及 び 今 ま で 無 視 し て

CT 

ロ

F・ 『

ハU

唱 ︐

i

‑ 2 0  

‑ 4   10 

。

‑ 2   O  l n  x 

4  2 

x  =  ~Jt a λu 

a : 散乱体の半径

図 2 ‑ 5 . R a y l e i g h ‑ G a n s 散乱式より計算された l n x と l nq の関係

43)

‑ 2  

‑ 3  

‑ 4  

む

ω

ロ ω

口 ︒ ( 円 以 ハ 凶

4  O  2 

l n  x 

‑ 2  

‑ 4  

x  =  ~Jt a λ 

a : 散乱体の半径

図 2 ‑ 6 . R a y l e i g h ‑ G a n s 散乱式より計算された l n

x

と α の関係

43)

タ ン グ ス テ ン 酸 の ゲ ル 化 過 程 に お け る 濁 度 ス ペ ク ト ル 測 定 の 結 果 と Rayleigh‑

Gansの 散 乱 式 と が 良 い 対 応 関 係 を 示 し て い る の で43)、変'性途中においてはこ の 散 乱 式 が 良 い 近 似 で あ る と 考 え ら れ る 。

従 っ て 、 フ ォ ト ダ イ オ ー ド ・ リ ニ ア ・ ア レ イ を 検 出 器 と し た マ ル チ 測 光 分 光 光 度 シ ス テ ム を 用 い て 、 生 体 高 分 子 の 温 度 並 び に 圧 力 上 昇 に 伴 う ゲ ル 化 過 程 に お け る 透 過 光 の 波 長 依 存 性 の 経 時 変 化 の 測 定 を 行 い 、 ゲ ル 化 の 動 的 挙 動 の 変 化 並 び に 生 成 し た ゲ ル の 物 性 に つ い て の 比 較 解 析 を 行った。

2‑3‑2  時間分解濁度スペクトノレ測定

図2‑7に 実 験 系 の 概 略 図 を 示 す 。 直 流 点 灯 タ イ フ。Xe‑Lamp (浜松ホトニクス;

Type No. L2194 (75W)) を 光 源 と し て 用 い た 。 入 射 光 の ピームスポッ トは約

。

^{1mmで、ある。図2‑8}に光源、の波長スペクトルを示す。 350nmから800nmまで 充 分 な 強 度 が 存 在 す る 。 ま た 図2‑9は 光 源 全 強 度 の 時 間 変 化 を 示 し た グ ラ フ で あ る 。 光 源 強 度 は 点 灯 開 始 後30‑‑‑‑40分 以 降 は 、 非 常 に 安 定 で あ る。

光 源 か ら の 白 色 平 行 光 は セ ル 中 の 試 料 に 照 射 さ れ 、 透 過 光 は オ プ テ イ カ ル フ ァ イ パ ー に よ っ て マ ル チ 測 光 分 光 光 度 計 ( 大 塚 電 子 ;MCPD‑1000) に 退 か れる。ファイパーバンドルの径はゆ1.05 m mで あ り 、 集 光 立 体 角 は0.05rad (2.86度 ) で あ る 。 分 光 光 度 計 内 で は 、 透 過 光 強 度 は ス リ ッ ト 及 び 平 面 ミ ラ ー を 通 り グ レ ー テ ィ ン グ に 達 し 、 各 波 長 に 分 光 さ れ 自 己 走 査 型 検 出 素 子(MCPD)上

に 結 像 さ れ る 。 分 光 光 度 計 か ら の リ ア ル タ イ ム 出 力 は 、 パ ー ソ ナ ル コ ン ピ ュ ータ(NEC;PC‑9801m)に 取 り 込 ま れ 、 フ ォ ト ・ ダ イ オ ー ド の 暗 電 流 等 の 測 定 系 の 補 正 が 行 わ れ た 後 、 あ ら か じ め サ ン プ ル の な い 状 態 で 観 測 さ れ た ス ペ ク

ト ル デ ー タ で 割 ら れ 、 透 過 率 ス ペ ク ト ル と し て 表 示 さ れ る 。

分 光 光 度 計 の ス リ ッ ト は0.10mmの も の を 用 い 、 分 解 能 は2nmである。 1ス ペ ク ト ル 測 定 す る 時 間 は 本 研 究 に お い て い は1秒である。

2‑4  重 量 ・ 体 積 同 時 測 定

図2‑10に 、 重 量 及 び 体 積 の 同 時 測 定 系 の 概 略 図 を 示 す 。 電 子 天 秤 (A&D;

R e c o r d e r   Temp. 

C o n t r o l l e r  

ゆ ¥

c p i  

o n   m 加

e n  

h

﹀

T m

x  e   

/Heater  O p t i c a l  

f i b e r   Mi

^汀

o r

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rI  

u 

cリ

ο δ  

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ト

 

dm 

・I A E A

H m r  

G r a t i n g  

L i n e a r  p h o t o ‑ d i o d e ‑ a r r a y  

図 2 ‑ 7 . 時間分解濁度スペクトル測定システムの概略図

/ーヘ αコ +ー

. . .

・

⁴

ロ ロ

心し お)

λ

判 明 ∞

ロ ω 百 円 五 却

J

200  300  400  500  600  700  8 0 0   W a v e l e n g t h  (  nm  ) 

図 2 ‑ 8 .

使 用 し た 光 源

(Xe Lamp)

の ス ペ ク ト ル

400 

300 

ハ

U

ハ リウん (﹀

g ) ヨ 岳 ロ

︒ ・ 岳 何 回

dl

仏

O

1 0 0  

。

L i g h t  On 

Time ( m i n )  

図 2 ‑ 9 . 光源の強度の時間変化

CCD  Camera 

E l e c t r o n i c  B a l a n c e  

Computer 

Frame Memory  Board 

VTR 

Sample 

図 2 ‑ 1 0 . 重量・体積同時測定系の概略図

て 新 規 に 構 成 し た 。 試 料 を 天 秤 の テ ー ブ ノ レ の 上 に 置 き 、 試 料 の 像 と 電 子 天 秤 の重量の読みを、 CCDカメラによって撮影し、 VTRに 録 画 し た 。 測 定 終 了 の 後に VTRか ら の 試 料 の 画 像 デ ー タ を 、 マ イ ク ロ コ ン ピ ュ ー タ (NEC;

PC9801VX) に 装 着 さ れ て い る フ レ ー ム メ モ リ ー ボ ー ド (NBCC;NBC‑

PB980S) に転送し、 A/O変 換 し て 、 試 料 の 面 積 を 算 出 し た 。 同 時 に そ の 時 刻 での重量の読みも記録した。

全 て の 測 定 は 常 温 常 圧 下 で 行 っ た 。

試 料 は 薄 い 円 盤 状 の 形 状 を し て お り 、 内 部 は 均ーで あ る と す る と 、 変 化 過 程 に お け る 体 積 の 変 化 は 、 均 一 に 起 こ る と 仮 定 で き る 。 従 っ て 、 測 定 時 間 内 で の 試 料 円 盤 の 厚 さd(t)、 半 径 r(t)、 が 以 下 の 様 に 変 化 す る と 考 え ら れ る 。

r(t)= rOl(t)， d(t)=dOl(t)，  (2‑17) 

ここで、

r o

と d_Oは 円 盤 の 半 径 と 厚 さ の 初 期 値 で あ り 、 1(t)は 、 長 さ の 減 少 を 表す係数である。

最 終 的 に 、 体 積 v(t)=πr²(t)d(t)は 、 面 積 S(t)=πr2( t)の デ ー タ か ら v(t)=

s(t)  d(t)として計算される。

上 記 の 仮 定 よ り 、 変 化 過 程 に お け る 重 量 、 面 積 、 体 積 及 び 密 度 ( 重 量 / 体 積)の時間依存性を算出した。

一 方 、 乾 燥 過 程 に お い て は 、 溶 媒 の 拡 散 過 程 が 重 要 な 役 割 を 果 た す と 考 え られる。

今 、 図2‑11に 示 す 様 な 試 料 の 形 状 を 仮 定 し 、 拡 散 方 程 式 を 以 下 の 様 に 導 く 。 拡散方程式は、

竺 二

DV²c

dt  _(2‑18) 

で記述される。ここで、 D及び、cは 、 そ れ ぞ れ 拡 散 定 数 (O=const) お よ び 溶 媒の存在密度を示す。

今 、 図2‑11の モ デ ル に お い て 厚 さ 方 向 に 比 べ てxy方 向 に 十 分 長 い と し て 、 厚 さ 方 向 に つ い て は 考 え な い 。 ま た 全 方 向 に 対 し て 等 方 的 で あ る と 考 え る と 、 結局^X方 向 の み を 考 慮 し た 単 純 化 し た 式 が 導 か れ る 。

C 

厚み方向

X 

図 2 ‑ 1 1 . 拡散方程式のモデル

。

^c

^a

^2C 

at ‑^1.../ aX2 

( 2 ‑ 1 9 )  

境界条件を、

o % o  

fi ll

イ‑

II I1

¥

︑ ︑ ︐ ︐ 一 一

px 

〆 ︐ ︐ ︑ C  X~O

o 

s x 

s Q  

X注

f

(2 ‑2 0) 

とし、変数を

D t = τ

， 

u= チ

.....0 

( 2  ‑ 2 1  ) 

と 書 き 直 し て 、 溶 媒 の 存 在 密 度 と 位 置 の 関 係 は 、

… ^{2 1 長 1 [ 叫} _{( 2 ‑ 2 2 )}  

また、拡散による残存重量は、

w (

，) ==

 

 

' l

^{u(x吟 dx}

( 2 ‑ 2 3 )  

となる。

式

( 2 ‑ 2 2 )

か ら 判 る 様 に 、 高 次 の 振 動 項 1

s  i n (

・・)

e x p (

・・)f は時間(1:)の 経 過 と 共 に 著 し く 減 少 す る 。 図

2 ‑ 1 2

は 、 モ デ ル 計 算 ￨ 式

( 2 ‑ 2 2 )

において

n

を

l

か

ら100ま で 積 算 し た ￨ に よ っ て 求 め た 拡 散 に よ る 溶 媒 の 減 少 の 様 子 を 示 し た も の で あ る ￨ 式

( 2 ‑ 2 2 )

において各1:

(=Dt)

に つ い て プ ロ ッ ト し た も の ￨ 。 す な わ ち 、 あ る 程 度 時 間 が 経 て ば 自 由 水 は な め ら か な 上 に 凸 の 曲 線 的 に 減 少 し 、 位 置 に よ る 局 所 的 な 凹 凸 は 現 わ れ な い 。 ま た 、 式

( 2 ‑ 2 3 )

か ら 、 拡 散 過 程 に お け る 溶 媒 の 減 少 に と も な う 残 存 重 量 の 時 間 変 化 を 計 算 し た 結 果 を 図

2 ‑ 1 3

に示す(初

=  0 . 0 2  

ハU

値 1

期

o ' O

J

一 〆 τ τ τ

( ︒

υ

¥ Q H )

ロ

図 2 ‑ 1 2 . 各時刻での拡散による自由水密度の位置依存性に 対するの理論曲線(式 ( 2 ‑ 2 2 ) において

n

をl から 1 0 0

まで加算した結果で、

τ

は、規格化された時間)

。 X 

1 . 0  

( ω 2 C

﹀℃

ω 官

︒ ∞ ) 民

0 . 2 0   0 . 1 6  

図 2 ‑ 1 3 . 拡散 に よる 重量変化の 理論曲線

W

の初期値==

l.0 

0 . 0 8   0 . 1 2   Time;τ  0 . 0 4  

0 . 1 0  

0 . 0 0